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문제 정의
- 본 연구에서는 이 두 가지 목적을 동시에 만족시키는 방법론 으로 현대 생명과학의 도구로서 급성장하고 있는 DNA chip에 의한 환경바이러스 분석 시스템의 유용성을 평가하고자 하였다. DNA chipe 올리고뉴클레오티드(11)나 cDNA(16)를 마이크로어 레이어 (microarrayer)로 슬라이드글라스 위에 고정시켜 수많은 유 전자발현의 동시 분석에 많이 사용되는데 최근에는 돌연변이 분 석(4, 8)이나 유전자 mapping (15)에도 활용되고 있다.
제안 방법
- 따라서 DNA chip의 정확도 와 특이도를 먼저 확인한 후 시료를 검사하였다. DNA chip 자 체에 대한 평가를 하기 위하여 세 종류(enterovirus, adenovirus 및 rotavirus)의 바이러스를 확인할 수 있는 각각의 종류에 속하는 표준(reference)바이러스를 이용하여 DNA chip 검사를 시행하였다. 사용된 DNA chip의 포맷(format)을 보면 4개의 β-globin 이 있어서 시료의 적정성을 확인함과 동시에 다른 탐침자의 위치를 쉽게 파악할 수 있도록 포지션마커(position marker) 역할을 한다(Fig.
- Enterovirus 유전자 검색을 위해서 진화적으로 보존성이 높은 5'-noncoding region (NCR)의 436 bases를 대상으로 RT-PCR을 수행하였다. CPE 양성의 세포배양액 2000에 약 600川의 Tri- reagent와 chloroform 200 ul를 넣고 잘 섞은 후 상온에 10분간 방치한 다음 15 분간 원심분리(10, 000Xg, 4℃)하였다.
- 증폭시 사용한 반응액 및 조건은 다음과 같다. 각 프라이머 25 pmole 씩과 2U rTaq DNA 중합효소(Takara, Kyoto, Japan)를 넣어서 다음의 조건에서 PCR을 실시하였다. 90℃에서 1 분, 94℃, 45℃, 72℃에서 각각 30 초씩 3 주기, 94℃, 45℃, 72℃ 에서 각각 15 초, 15 초, 20 초를 27 주기, 72℃에서 2 분간 유 지시킨 뒤 4P에서 보관하였다.
- 본 연구에서 사용되어진 장내바이러스 검출용 DNA chip의 경우는 세 가지 종류의 바이러스(enterovirus, adenovirus 및 rotavirus) 검줄이 가능하고 유전형을 판별할 수 있다. 따라서 DNA chip의 정확도 와 특이도를 먼저 확인한 후 시료를 검사하였다. DNA chip 자 체에 대한 평가를 하기 위하여 세 종류(enterovirus, adenovirus 및 rotavirus)의 바이러스를 확인할 수 있는 각각의 종류에 속하는 표준(reference)바이러스를 이용하여 DNA chip 검사를 시행하였다.
- 세포배양에는 5~10%의 우태아혈청, penicillin/streptomycin, tetracycline 및 항진균제 fhgizone을 첨가 한 MEM几-15 혼합배지를 사용하였다(19). 바이러스 접종 후, 1~5 일 사이에 CPE를 확인하고 세포배양 플라스크를 3회 반복 하여 동결/해동하였다. 배양상층액은 상온에서 15 분 동안 1,000 Xg로 원심분리하여 부유물을 제거하고 상층액(바이러스 suspension)은 사용 전까지 -70%:에 보관하였다.
- 세포배양에서 바이러스 양성으로 나온 시료에서 바이러스를 검출하기 위하여 DNA chip을 이용하여 검사하였다. 본 연구에서 사용되어진 장내바이러스 검출용 DNA chip의 경우는 세 가지 종류의 바이러스(enterovirus, adenovirus 및 rotavirus) 검줄이 가능하고 유전형을 판별할 수 있다.
- 세포배양에서 배양성 바이러스 양성으로 판정된 총 10 개의 세포배양액 시료로부터 직접 바이러스 유전자를 적출하고 panenterovirus 특이적 primerS- 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 된 cDNA를 주형으로 enterovirus 5, -NCR의 비구조적 부위를 특 이적으로 증폭하는 PCR을 시도하였고 10 개의 시료 중 7 개의 검체에서 enterovirus 특이 밴드의 증폭이 확인되었다.
- 25 ul를 넣고 최종부피를 25 ul로 맞춰 95℃ (5 분), 95℃ (1 분), 52℃ (1 분 30 초), 72℃ (1 분 30 초)의 싸이클을 35 회 실시하였다(1, 2). 증폭된 436 bp 산물은 agarose gel 전기영동으로 확인하였고 TA 클로닝 후 염기서열을 결정하여 GenBank의 데이터와 비교하였다.
- 2B). 표준바이 러스를 이용한 DNA chip 검증실험 후에 세포배양결과 바이러스 양성으로 판정된 총 10 개의 시료를 PCR 후, 유전자 분석법 및 DNA chip 방법으로 검사하고 비교하였다(Table 3). DNA chip 검사결과는 유전자 분석법에 의한 결과와 일치한 결과를 보여주 었다.
- 세포배양에서 배양성 바이러스 양성으로 판정된 총 10 개의 세포배양액 시료로부터 직접 바이러스 유전자를 적출하고 panenterovirus 특이적 primerS- 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성 된 cDNA를 주형으로 enterovirus 5, -NCR의 비구조적 부위를 특 이적으로 증폭하는 PCR을 시도하였고 10 개의 시료 중 7 개의 검체에서 enterovirus 특이 밴드의 증폭이 확인되었다.
- 5 μI를 넣고 최종 부피를 15 ul로 조정하여 4TC에서 90 분간 반응시킨 후 95℃에서 5 분 간 역전사효소를 불활성 화시 켰다. 합성된 cDNA로부터 panenterovirus 특이 유전자를 증폭하기 위해 cDNA 1 [11, dNTP 3 fjl, fonvard primer (EntF 10 pM) 1 /Jl, reverse primer (EntR 10 pM 1 pZ), Taq polymerse 0.25 ul를 넣고 최종부피를 25 ul로 맞춰 95℃ (5 분), 95℃ (1 분), 52℃ (1 분 30 초), 72℃ (1 분 30 초)의 싸이클을 35 회 실시하였다(1, 2). 증폭된 436 bp 산물은 agarose gel 전기영동으로 확인하였고 TA 클로닝 후 염기서열을 결정하여 GenBank의 데이터와 비교하였다.
- 합성된 cDNA를 주형으로 하여 키트에서 제공하는 프라이머세 트(enterovirus Ⅱ, Ⅱ, VⅡ, rotavirus group A Ⅲ, IV adenovirus VI, VII)를 이용하여 바이러스를 증폭하였고 QgIobin(BG 1, 2) 은 DNA 증폭여부를 판단하기 위해 양^대조군으로 사용하였다. 증폭시 사용한 반응액 및 조건은 다음과 같다.
대상 데이터
- 바이러스 검출용 세포배양에는 African green monkey kidney (BGM) 세포를 사용하였다. 세포배양에는 5~10%의 우태아혈청, penicillin/streptomycin, tetracycline 및 항진균제 fhgizone을 첨가 한 MEM几-15 혼합배지를 사용하였다(19).
- 바이러스 검출 및 유전형 분석을 위하여 EVDNAChip™ 키트 (BiomedLab, Seoul, Korea)를 제공받아 매뉴얼에서 제시하는 방법을 따랐다. 세포배양에서 RNA/DNA 분리를 위하여 RNAID 키트 (BiolOl, Carlsbad, USA) 와 guanindinium thiocyanate (GITC, Sigma, St. Louis, USA)를 사용하였다. 6M GITC 250 ul와 세포배양액을 1:1 로 섞고 10ul의 글래스파우더(glass powderX 첨가하여 상온에서 10 분 동안 교반 시킨 후 30 초간 650Xg에서 원심분리하였다.
- DNA chipe 올리고뉴클레오티드(11)나 cDNA(16)를 마이크로어 레이어 (microarrayer)로 슬라이드글라스 위에 고정시켜 수많은 유 전자발현의 동시 분석에 많이 사용되는데 최근에는 돌연변이 분 석(4, 8)이나 유전자 mapping (15)에도 활용되고 있다. 이 시스템의 적용단계는 세포배양 후 적출된 세포 내 유전물질을(RT)-PCR 로 증폭하고 그 생성물을 직접 DNA chip과 반응시키면서 시작 되며 적용범위는 poliovirus, coxsackievirus, echovirus 및 unclassified enterovirus를 포함한 pan-enterovirus 그룹과 rotavirus 그룹 및 adenovirus 그룹 등 환경에서의 검출빈도가 가장 높은 바이러스 종류를 대상으로 한다. 이 DNA chipe 3~4 시간 이내 로 특정 바이러스의 유전물질 존재여부를 확인하는 동시에 검출 바이러스의 1차 동정자료까지 제시할 수 있어 PCR 후 수반되는 전기영동 분석과정은 물론 종 동정에 필요한 항원-항체반응이 나 염기서열분석까지 생략시켜준다.
이론/모형
- 바이러스 검출 및 유전형 분석을 위하여 EVDNAChip™ 키트 (BiomedLab, Seoul, Korea)를 제공받아 매뉴얼에서 제시하는 방법을 따랐다. 세포배양에서 RNA/DNA 분리를 위하여 RNAID 키트 (BiolOl, Carlsbad, USA) 와 guanindinium thiocyanate (GITC, Sigma, St.
성능/효과
- 4). DNA chip에 의한 검출은 세포배양액을 대상으로 한 panenterovirus 특이 PCR 결과와 100% 일치하여 훌륭한 검출 특이 성을 나타내었다(Table 3).
- 각 PCR로 생성된 DNA는 TA-vector에 클로닝하였고 확보된 5, -NCR의 염기서열은 Dye terminator 방법으로 결정하였으며 GenBank에 등록된 장내바이러스 염기서열 분석결과 시료-3에서 coxsackievirus B3 (CB3)와 99%의 homology를 갖는 바이러스가 검출되었다. 시료-4, 시료-6, 시료-7에서 echovirus 30과 94%의 homology를 갖는 바이러스가, 시료-8, 시료-9, 시료-10에서는 각각 CB3와 98%, 94%, 99%의 상동성을 보이는 유전자로 판정되 었다(Table 3).
- 결론적으로 환경시료에서의 장내바이러스 검출을 위하여 올리 고뉴클레오티드 DNA chip을 이용한 경우 바이러스 검출 및 유 전형 분석을 동시에 수행할 수 있으므로 신속하게 결과를 도출 할 수 있었으며, 기존의 방법과 일치한 결과를 보여줌으로써 결 과의 정확성을 보여 주었다. 더 나아가서 DNA chip의 장점인 고집적성, 고민감도, 고처리량(high throughput) 그리고 자동화의 가능성을 고려한다면 향후 관련분야 조사연구, 학술연구, 산업계 에서의 효용성 상승에 크게 기여할 것으로 판단된다.
- 그러나 세포배양에 의한 바이러스 검출결과는 DNA chip 또는 PCR에 의한 검출결과와 완전히 일치하지는 않았으며 10 개의 세포배양 양성시료 중 3 개가 DNA chip과 PCR에서는 음성으로 나타났다(Table 3). 이러한 불일치의 가능한 이유로는 여러가지 가 있을 수 있겠으나 가장 합리적인 근거로는 각 방법에 의한 검출범위의 설정에 차이가 있기 때문인 것으로 판단된다.
- 두 가지 방법 모두 10 개의 시료 중 3 개(시료번호 1, 2,5)가 바이러스 음성으로 7 개(시료번호 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10)가 바이러스 양성으로 나타났다. 바이러스 양성으로 나타난 7 개 시료의 유전형은 유전자 분석법 및 DNA chip 방법에 의하여 모두 장내바이러스로 일치하는 결과를 보여주었다.
- 세포배양에서 바이러스 양성으로 나온 시료에서 바이러스를 검출하기 위하여 DNA chip을 이용하여 검사하였다. 본 연구에서 사용되어진 장내바이러스 검출용 DNA chip의 경우는 세 가지 종류의 바이러스(enterovirus, adenovirus 및 rotavirus) 검줄이 가능하고 유전형을 판별할 수 있다. 따라서 DNA chip의 정확도 와 특이도를 먼저 확인한 후 시료를 검사하였다.
- 이와 같은 목적에서 DNA chip에 의한 검출 시스템은 세포배양-PCR 방법이 제공하는 세포배양기간 최소화의 장점을 그대로 유지하고 동시에 뒤 이은 실험과정을 최소화하였다. 시료 접종 후 24 시간부터 3 일 이내에 세포 내 핵산을 분리하고 cDNA로 전환하여 불과 3~4 시간 정도면 바이러스 검출 및 유전형 여부를 판단할 수 있다(Fig.4). DNA chip에 의한 검출은 세포배양액을 대상으로 한 panenterovirus 특이 PCR 결과와 100% 일치하여 훌륭한 검출 특이 성을 나타내었다(Table 3).
- 각 PCR로 생성된 DNA는 TA-vector에 클로닝하였고 확보된 5, -NCR의 염기서열은 Dye terminator 방법으로 결정하였으며 GenBank에 등록된 장내바이러스 염기서열 분석결과 시료-3에서 coxsackievirus B3 (CB3)와 99%의 homology를 갖는 바이러스가 검출되었다. 시료-4, 시료-6, 시료-7에서 echovirus 30과 94%의 homology를 갖는 바이러스가, 시료-8, 시료-9, 시료-10에서는 각각 CB3와 98%, 94%, 99%의 상동성을 보이는 유전자로 판정되 었다(Table 3).
- 2와 같다. 음성 대조군의 시료 결과를 보면 포지션 마커인 β-globin 탐 침자에서만 양성신호가 나타나고 다른 바이러스 탐침자에서는 음성으로 나타났다. 즉 음성으로 기대되는 결과에서 음성결과를 보여 주었다.
- 1996 년 Reynolds 등은 PCR을 사용, 세포배양 후 세포 적출물 을 대상으로 바이러스 유전물질 검색을 시도하여 감염성 또는 배양성 바이러스 검출기법과 분자생물학적 방법의 검출민감도를 접목하여 Integrated Cell Culture PCR (ICC-PCR)' 분석법을 제 시하였다(14). 이 방법은 위양성(false positivity) 및 정량의 문제점을 완전히 배제하지는 못했지만 감염력을 잃은 바이러스의 유 전물질을 검출할 가능성을 크게 줄이고 높은 민감도를 유지하였 으며 접종 후 24 시간~7 일 이내에 바이러스 존재유무를 확인할 수 있다는 점을 장점으로 제시하고 있다. 한편 검출된 바이러스 의 종 또는 혈청형의 동정(identification) 단계에서는 중화항체법 (antibody neutralization)0]Q 면역형광법(immunofluorescence), 그리고 유전물질의 염기서열결정법(sequencing) 등을 이용하는 것이 일반적이지만 보다 전문적인 기술과 장비, 그리고 짧지 않은 분석기간이 요구된다.
- 표준바이러스 enterovirus, adenovirus 및 rotavirus를 각각 적용한 결과 해당 탐침자 위치에서 양성 결과를 보여줌으 로써 정확한 바이러스 검출 및 검출된 바이러스의 유전형에 해당되는 결과를 보여주었다. 즉 세 개의 표준바이러스 시료 모두 양성으로 나타났고, 또한 chip 상에 나타난 유전형 또한 표준바 이러스 유전형과 일치한 결과를 보여 주었다(Fig. 2B). 표준바이 러스를 이용한 DNA chip 검증실험 후에 세포배양결과 바이러스 양성으로 판정된 총 10 개의 시료를 PCR 후, 유전자 분석법 및 DNA chip 방법으로 검사하고 비교하였다(Table 3).
- 즉 음성으로 기대되는 결과에서 음성결과를 보여 주었다. 표준바이러스 enterovirus, adenovirus 및 rotavirus를 각각 적용한 결과 해당 탐침자 위치에서 양성 결과를 보여줌으 로써 정확한 바이러스 검출 및 검출된 바이러스의 유전형에 해당되는 결과를 보여주었다. 즉 세 개의 표준바이러스 시료 모두 양성으로 나타났고, 또한 chip 상에 나타난 유전형 또한 표준바 이러스 유전형과 일치한 결과를 보여 주었다(Fig.
후속연구
- 결론적으로 환경시료에서의 장내바이러스 검출을 위하여 올리 고뉴클레오티드 DNA chip을 이용한 경우 바이러스 검출 및 유 전형 분석을 동시에 수행할 수 있으므로 신속하게 결과를 도출 할 수 있었으며, 기존의 방법과 일치한 결과를 보여줌으로써 결 과의 정확성을 보여 주었다. 더 나아가서 DNA chip의 장점인 고집적성, 고민감도, 고처리량(high throughput) 그리고 자동화의 가능성을 고려한다면 향후 관련분야 조사연구, 학술연구, 산업계 에서의 효용성 상승에 크게 기여할 것으로 판단된다.
- 환경시료를 대상으로 한 바이러스 검출에서 높은 민감도의 정성적 판단과 동시에 정확한 정량분석을 성 취하는 것은 매우 어렵지만 환경오염의 사전예방을 위한 사전 조사는 많은 시료의 신속한 분석으로 바이러스 오염가능성의 판 단이 우선되어야 한다(7). 동시에 종 동정에 대한 기초자료도 확 보할 수 있다면 오염 바이러스의 잠재적 위해도에 대한 일차적 인 이해까지 가능할 것이다.
- 뿐만 아니라 높은 민감도를 가지고 있으므로 시료에서 바이러스를 검출하는데 좋은 장점이 있다. 또한 레이저 스캐너(laser scanner)에 의한 DNA chip의 판 독은 방대한 양의 환경시료 분석에 자동화 체계를 도입할 수 있어 향후 관련분야 조사연구 및 학술연구의 효용성 상승에 크게 기여할 것으로 판단된다.
- DNA chip 시스템은 검출여부의 판정과 동시에 환경바이러스 중에서 가장 빈번하게 검줄되는 pan-enterovirus, adenovirus, 그리고 rotavirus의 구별이 가능해져 검출과 동시에 1 차적인 동정자료를 제공함으로써 다 수의 시료를 분석해야하는 환경시료연구에서 종동정을 위한 부 차적인 시간과 경비를 절감할 수 있다. 물론 현재의 기술수준으 로 중화항체법이나 염기서열결정법에 의한 단계의 심도 있는 동 정은 할 수 없으나 adenovirus의 경우에서와 같이 향후 subgroup 또는 type에 특이한 염기서열을 확보한다면 이를 기반으로 유전 형에 특이한 올리고뉴클레오티드 탐침자를 디자인할 수 있어 DNA chip 시스템의 효용성 증가가 기대된다.
- Chip의 포맷에서는 염 기로 사용되는 슬라이드글라스에 수많은 올리고 뉴클레오티드를 집적시킬 수 있으므로 한번에 여러 개의 시료에 대한 동시 혼성 화반응이 가능하며 한 번의 스캐닝과정에는 한 개에서 십여 개 이상의 판독이 가능하여 필요하다면 현재의 기술로도 단시간에 수 백 개의 시료분석이 가능하다. 이에 더하여 혼성화반응과 스 캐닝과정은 실험조건과 공정이 정형화되어 있어 시료분석의 자 동화가 가능하다는 점은 많은 수의 시료분석이 필요한 환경시료 연구에 크게 기여할 것이다.
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