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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 아토피성 피부염 등을 유발하는 슈퍼 항원으로 중요시되고 있는 SEB에 대한 예방 및 치료제 개발 연구의 일환으로, 재조합 SEB 단백질 면역원을 제조하고, 이를 산란계에 면역하여 획득한 SEB 독소에 대한 특이항체(specific anti-SEB IgY)의 면역학적 특성을 조사하였다.
- 본 연구는 식중독은 물론, 아토피성 피부염의 원인물질로 알려져 있는 포도상구균 장내독소 B(Staphylococcal enterotoxin B; SEB)에 대한 특이 난황항체를 개발하고자 실험을 실시하였다. 우선, SEB 유전자를 클로닝한 다음, 대장균 발현시스템을 이용하여 약 30 kDa 정도의 재조합 SEB 단백질을 생산하였다.
- , 1996; Kovacs-Nolan and Mine, 2004). 본 연구에서는 SEB 유전자를 이용한 재조합 단백질을 생산하고, 산란계에 면역을 실시하여 SEB 특이적인 난황항체를 생산하고자 하였다. 우선, 대장균에서 발현시킨 재조합 단백질이 anti-SEB monoclonal antibody와 특이적으로 반응한다는 것을 Western blot 실험을 통하여 확인하였으며(Fig.
제안 방법
- 2차 항체로는 alkaline phosphatase가 conjugation되어 있는 AffiniPure rabbit IgG anti-chicken IgY (Jackson, USA)를 5,000배로 희석하여 사용하였으며, 이를 각 well에 100 μL씩 분주 후 37℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다.
- 8) 용액에 용해시킨 기질을 plate에 가하여 37℃에서 20분간 발색반응을 시켰다. 5 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, Microplate reader(Molecular Devices; E Max)를 사용하여 405 nm에서 흡광도(optical density)를 측정하였다. 이 결과를 이용하여 항체가를 산출하였으며, 모든 실험은 3반복 실시하였다.
- Genomic DNA의 분리는 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN, USA)를 사용하였으며, 추출된 geno- mic DNA를 주형으로 BamHⅠsite가 포함된 SEB forward pri- mer(5'-gga tcc gag agt caa cca gat c-3')와 SalⅠsite가 포함된 SEB reverse primer(5'-gtc gac ggt act cta taa gtg cc-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다(95℃에서 1분간 denaturation, 54℃에서 1 분간 annealing, 72℃에서 2분간 extension, 30회 반복하였음).
- 여기에 secondary antibody로 alkaline phosphatase conjugated rabbit anti-mouse IgG(Sigma, USA)를 20 mL의 TBST에 5,000배 희석하여 이 희석액을 membrane에 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. Membrane은 TBST로 3차례 각각 5분씩 washing하고, TNM(100 mM Tris-Cl pH 9.5, 100 mM NaCl, 5mM MgCl2)으로 1회 washing한 다음 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, Amersham Phar- macia Bioscience, UK)와 NBT(nitro blue tetrazolium, Amer- sham Pharmacia Bioscience, UK)로 발색반응을 유도하였다.
- SEB 유전자를 확보하기 위하여 PCR을 수행하여 목적한 783 bp의 밴드를 얻었고(Fig. 1A), 이를 pGEM-T 벡터에 클로닝하여 BamHⅠ과 Sal Ⅰ의 제한효소 분석을 통하여 목적한 유전자를 확인하였으며(Fig. 1B), 발현벡터인 pQE80L vector에 다시 클로닝한 다음 제한효소 분석을 통하여 목적한 SEB 유전자를 확인하였다(Fig. 1C). 최종적으로 염기서열 분석을 통하여 GenBank(M11118)에 등록되어 있는 SEB 유전자 서열과 100%의 homology를 가지는 것을 확인하였다.
- 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, SA)은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 사용하였다(ATCC 13566). SEB 유전자를 확보하기 위하여 황색포도상구균의 genomic DNA를 분리하고, 이를 주형으로 PCR(polymerase chain reaction)을 실시하였다. Genomic DNA의 분리는 DNeasy Tissue Kit(QIAGEN, USA)를 사용하였으며, 추출된 geno- mic DNA를 주형으로 BamHⅠsite가 포함된 SEB forward pri- mer(5'-gga tcc gag agt caa cca gat c-3')와 SalⅠsite가 포함된 SEB reverse primer(5'-gtc gac ggt act cta taa gtg cc-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다(95℃에서 1분간 denaturation, 54℃에서 1 분간 annealing, 72℃에서 2분간 extension, 30회 반복하였음).
- 0로 적정한 후 -20℃에서 24시간 동결하였다. 동결된 난황희석액을 해동시킨 다음, 15℃, 10,000g로 30분간 원심분리를 실시하여 상청액을 수거하였고, 다시 수거액을 8℃에서 Whatman No. 1으로 여과하여 수용성 난황 항체를 분리하여 항체가 측정 시험에 사용하였다.
- 재조합 SEB 단백질 발현 여부를 확인하기 위해 Western blot analysis를 실시하였다. 양성대조군으로 상업적으로 판매되고 있는 SEB 단백질(Staphylococcal Enterotoxin B Frag- ment(150-161), # S0812, Sigma, USA)과 음성대조군으로 발현벡터인 pQE80L vector를 이용하여 분석하였다. Western blot을 간략히 설명하면, SDS-polyacrylamide gel에서 각각의 샘플을 로딩하고 전기영동을 실시한 다음, Nylon membrane(Amersham Pharmacia Biosciences, UK)에 blotting 시킨 후, 3% BSA/PBS로 실온에서 1시간 동안 blocking시켰다.
- 본 연구는 식중독은 물론, 아토피성 피부염의 원인물질로 알려져 있는 포도상구균 장내독소 B(Staphylococcal enterotoxin B; SEB)에 대한 특이 난황항체를 개발하고자 실험을 실시하였다. 우선, SEB 유전자를 클로닝한 다음, 대장균 발현시스템을 이용하여 약 30 kDa 정도의 재조합 SEB 단백질을 생산하였다. 재조합 SEB 단백질을 산란계에 2주 간격으로 3회 면역접종을 실시하고, 혈청 및 난황 내 항체가를 측정한 결과, 면역 후 4주경에 항체가가 최고치에 달하였으며, 산란계로부터 획득한 난황항체를 이용한 Western blot 결과, 재조합 SEB 단백질은 물론, 상용화 SEB 단백질과도 특이적으로 반응한다는 것을 규명하였다.
- 5 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, Microplate reader(Molecular Devices; E Max)를 사용하여 405 nm에서 흡광도(optical density)를 측정하였다. 이 결과를 이용하여 항체가를 산출하였으며, 모든 실험은 3반복 실시하였다.
- 25 mL씩 근육주사를 실시하였다. 이러한 면역을 2주 간격으로 3회 수행하였다(김정우 등, 2000).
- 이후 sonicator(BRANSON SONIFIER 450, Branson Ultrasonic, USA)를 이용하여 분쇄한 후 4℃, 10,000×g에서 20분 동안 원심분리를 실시해서 상청액과 침전물을 획득하여 재조합 단백질의 유무와 산란계 면역에 활용하였다.
- 재조합 SEB 단백질을 0.15 M PBS에 유화시킨 0.5 mL를 동량의 Freund's adjuvant 혼합하여 충분히 교반한 다음 면역원으로 사용하였으며, 이를 산란계의 흉근 4군데에 각각 0.25 mL씩 근육주사를 실시하였다.
- 재조합 SEB 단백질을 QIAExpressionist Kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 정제하였다. 1 L의 LB broth에 균을 배양하고 centrifugation한 후 균체를 확보하였고, sonicator로 회수된 균체를 분쇄하고 상청액만을 수거하여 상기 kit 내에 포함된 NiNTA agarose와 혼합한 후, 4℃에서 16시간 동안 혼탕 반응시켰다.
- 증폭된 PCR product는 1% agarose gel에 전기영동을 실시하고, 목적 band를 잘라내어 pGEM-T easy vector(Promega, USA)에 클로닝한 다음 염기서열 분석을 의뢰(Macrogen, Korea)하여 확인하였으며, 확인된 클론을 선발하여 제한 효소인 BamHⅠ과SalⅠ을 이용하여 6×His coding sequenc를 갖는 발현벡터인 pQE80L vector(QIAGEN, USA)에 다시 클로닝하고, 염기서열 분석을 의뢰(Macrogen, Korea)하여 확인을 하였다.
- 혈청 항체가 측정을 위하여, 산란계의 날개정맥으로부터 혈액 2 mL를 채취하여 30분간 정치하여 응고시킨 다음, 3,000 rpm으로 원심분리하고 상청의 혈청을 분리하였다. 분리된 혈청은 -70℃에 보관하였다가 항체가 측정을 위한 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구하기 위하여 28 주령 ISA-Brown계의 산란계를 이용하였다. 건강한 개체 10수를 시험동물로 공시하였다. 산란계는 개별 사육하였으며, 수행시험 전 기간 동안 일일 16시간 점등하였고, 온도는 22±2℃로 유지하였고, 사료와 물은 자유섭식하였다.
- Western blot의 모든 방법은 상기과정과 동일하게 진행하였다. 동량의 단백질을 사용하였고, primary antibody로는 재조합 SEB를 산란계에 면역하여 획득한 난황항체를 10,000배 희석하여 사용하였고, se- condary antibody로는 alkaline phosphatase conjugated anti-chicken IgY(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. USA)를 사용하였다.
- 본 연구하기 위하여 28 주령 ISA-Brown계의 산란계를 이용하였다. 건강한 개체 10수를 시험동물로 공시하였다.
- 산란계는 개별 사육하였으며, 수행시험 전 기간 동안 일일 16시간 점등하였고, 온도는 22±2℃로 유지하였고, 사료와 물은 자유섭식하였다. 실험장소는 단국대학교 생명자원과학부 실험동물사육동이며, 단국대학교 동물실험윤리위원회의 가이드라인에 따라 실험을 수행하였다.
- 황색포도상구균(Staphylococcus aureus, SA)은 ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양받아 사용하였다(ATCC 13566). SEB 유전자를 확보하기 위하여 황색포도상구균의 genomic DNA를 분리하고, 이를 주형으로 PCR(polymerase chain reaction)을 실시하였다.
이론/모형
- pQE80L expression vector로 클로닝이 확인된 SEB 유전자의 단백질 발현을 확인하기 위하여 anti-SEB monoclonal anti- body를 이용하여 Western blot을 실시하였다. Fig.
- 0)를 사용하여 4번씩 단백질을 용출시켜 정제된 재조합 SEB 단백질을 획득하였다. 또한 상기에서 획득한 정제된 재조합 SEB 단백질 농도 측정은 BCA 방법에 준하여 실시하였다(Smith et al., 1985).
- 또한 재조합 SEB 단백질을 산란계에 면역하여 얻어진 난황항체의 면역 특이성을 확인하기 위하여 난황항체를 이용하여 Western blot을 실시하였다. Fig.
- 분리된 혈청은 -70℃에 보관하였다가 항체가 측정을 위한 실험에 사용하였다. 매일 수거된 계란으로부터 난황항체의 분리는 김정우 등(2000)의 방법에 따라 실시하였다. 채집한 난으로부터 난황만을 분리한 후 증류수(pH 5.
- 생산된 egg yolk antibody의 면역 특이성이 유무를 확인하고자 재조합 SEB protein 및 상업화된 SEB protein을 이용하여 Western blot analysis을 수행하였다. Western blot의 모든 방법은 상기과정과 동일하게 진행하였다.
- 재조합 SEB 단백질 발현 여부를 확인하기 위해 Western blot analysis를 실시하였다. 양성대조군으로 상업적으로 판매되고 있는 SEB 단백질(Staphylococcal Enterotoxin B Frag- ment(150-161), # S0812, Sigma, USA)과 음성대조군으로 발현벡터인 pQE80L vector를 이용하여 분석하였다.
- 혈청과 난황으로부터 재조합 SEB 단백질에 대한 항체역가를 분석하기 위하여 면역전, 재조합 SEB 면역 후 2, 4 및 6 주차에 indirect enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)법으로 시험을 실시하였는데, 그 측정방법은 다음과 같다(김정우 등, 2000). Carbonate-bicarbonate buffer(pH 9.
성능/효과
- 2A), 이는 대장균에서 유도되어 발현된 단백질은 재조합 SEB 단백질이며 상용화된 SEB 단백질 대신에 면역원으로 활용 가능하다는 것을 나타내었다. 더불어, 재조합 SEB 단백질을 산란계에 면역하여 얻어진 난황항체가 재조합 SEB 단백질은 물론, 상용화된 SEB 단백질과 특이적으로 반응한다는 것이 확인되었다(Fig. 2B). 따라서, 본 연구에서 생산된 재조합 SEB 단백질에 대한 특이 난황항체를 이용할 경우, S.
- 산란계에서 재조합 SEB 항원을 접종한 후 혈청과 난황 내 항체역가를 측정한 결과, 혈청항체가와 난황항체가의 변화가 비슷한 양상을 보였으나 면역 후 4～6주 경의 혈청항체가의 감소폭이 난황항체보다 크게 나타났다(Fig. 3). 이와 같은 현상은 면역 직후부터 2주경까지 혈중에 형성된 항체가 4주 경에 난황으로 이전되어 축적됨으로써 나타나는 현상으로 추정된다(Bar-Joseph et al.
- 본 연구에서는 SEB 유전자를 이용한 재조합 단백질을 생산하고, 산란계에 면역을 실시하여 SEB 특이적인 난황항체를 생산하고자 하였다. 우선, 대장균에서 발현시킨 재조합 단백질이 anti-SEB monoclonal antibody와 특이적으로 반응한다는 것을 Western blot 실험을 통하여 확인하였으며(Fig. 2A), 이는 대장균에서 유도되어 발현된 단백질은 재조합 SEB 단백질이며 상용화된 SEB 단백질 대신에 면역원으로 활용 가능하다는 것을 나타내었다. 더불어, 재조합 SEB 단백질을 산란계에 면역하여 얻어진 난황항체가 재조합 SEB 단백질은 물론, 상용화된 SEB 단백질과 특이적으로 반응한다는 것이 확인되었다(Fig.
- 우선, SEB 유전자를 클로닝한 다음, 대장균 발현시스템을 이용하여 약 30 kDa 정도의 재조합 SEB 단백질을 생산하였다. 재조합 SEB 단백질을 산란계에 2주 간격으로 3회 면역접종을 실시하고, 혈청 및 난황 내 항체가를 측정한 결과, 면역 후 4주경에 항체가가 최고치에 달하였으며, 산란계로부터 획득한 난황항체를 이용한 Western blot 결과, 재조합 SEB 단백질은 물론, 상용화 SEB 단백질과도 특이적으로 반응한다는 것을 규명하였다. 결론적으로, 식중독과 아토피성 피부염 등의 원인물질로 알려진 SEB에 특이적인 난황항체를 생산에 성공하였으며, 이러한 특이적인 난황항체는 식중독 및 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 재조합 SEB를 산란계에 2주 간격으로 3번 면역한 다음, 실험 0, 2, 4, 6 주차에 혈청 및 난황 내 항체역가를 측정한 결과, 혈청의 경우, 재조합 SEB 단백질의 면역을 시작한 이후 2주경부터 항체가가 증가하기 시작하여 4주경에 급격히 증가하여 최고의 항체가를 나타내다가, 6주경에 급격하게 감소하는 양상을 나타내었다(Fig. 3). 한편, 난황 내 재조합 SEB 특이 항체가는 면역 후 2주까지는 항체가의 변화가 뚜렷이 나타나지 않다가 4주경에 갑자기 최고가의 항체가를 나타내었으며, 6주경에는 비교적 서서히 항체가가 감소하는 것으로 나타났다(Fig.
- 1C). 최종적으로 염기서열 분석을 통하여 GenBank(M11118)에 등록되어 있는 SEB 유전자 서열과 100%의 homology를 가지는 것을 확인하였다.
- 3). 한편, 난황 내 재조합 SEB 특이 항체가는 면역 후 2주까지는 항체가의 변화가 뚜렷이 나타나지 않다가 4주경에 갑자기 최고가의 항체가를 나타내었으며, 6주경에는 비교적 서서히 항체가가 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
후속연구
- 결론적으로 본 실험을 통하여, 식중독과 아토피성 피부염 등의 원인 물질로 알려진 SEB에 특이적인 난황항체를 생산에 성공하였으며, 이러한 특이적인 난황항체는 식중독 및 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 재조합 SEB 단백질을 산란계에 2주 간격으로 3회 면역접종을 실시하고, 혈청 및 난황 내 항체가를 측정한 결과, 면역 후 4주경에 항체가가 최고치에 달하였으며, 산란계로부터 획득한 난황항체를 이용한 Western blot 결과, 재조합 SEB 단백질은 물론, 상용화 SEB 단백질과도 특이적으로 반응한다는 것을 규명하였다. 결론적으로, 식중독과 아토피성 피부염 등의 원인물질로 알려진 SEB에 특이적인 난황항체를 생산에 성공하였으며, 이러한 특이적인 난황항체는 식중독 및 아토피성 피부염의 예방 및 치료에 활용 가능할 것으로 사료된다.
- 2B). 따라서, 본 연구에서 생산된 재조합 SEB 단백질에 대한 특이 난황항체를 이용할 경우, S. aureus에 의하여 생산되는 장내독소, 즉 SEB를 효과적으로 중화할 수 있을 것으로 기대된다.
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