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문제 정의
- 본 연구는 이와 같이 많은 효능에도 불구하고 아직까지 항암 활성이나 생리활성 물질에 대한 연구가 진행되지 않은 초석잠으로부터 항암 효과에 대하여 실험하였다.
제안 방법
- 1% N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride(60% acetic acid) 혼합액 100 uL를 가하여 실온에서 방치하였다. 20분 후 ELISA 판독기 (Bio Tek Instruments Inc, model EL311 SL)를 사용하여 800 eg/mL의 유지 농도에서 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 02% EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포(2x1g를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다(16).
- MTT를 이용한 방법을 변형하여 실시하였다<12). MTT를 PBS용액에 5 mg/mL의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 4℃의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다.
- T 림프구 아형의 구성비는 phycoerythrin(PE)-conjugated rat anti-mouse CD4(L3T4) mAb와 FITC conjugated rat antimouse CD8(Ly-2)mAb 를 이용하고 IL-2 수용체는 HTC-cojugated rat anti-mouse CD25 mAb를 이용하여 분석하였다.
- Tumor necrosis factor(TNF)의 측정은 ELISA kit(Genzyme, Boston, MA)를 사용하여 시행하였다. 즉 24시간 동안 항 TNF 항체를 96well plate에 부착시킨 뒤 세척하고 여기에 검체 100 甘L를 넣고 1시간 동안 96 well plate에서 반응시켰다.
- 복강대식세포는 Yoon등(11)의 방법에 따라 분리하였다. 마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3 일 후, 1% fetal calf serum(FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린 (100 /jg/mL) 및 스트렙토마이신(100 “g/mL)이 첨가된 10 mL HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출 세포를 수집하였다. 이를 RPMI 1640 완전배지에 재부유시켜 37℃에서 3시간 배양한 후 부착되지 않은 세포들을 인산 완충액으로 세척하여 제거하고 부착세포들은 2.
- MTT를 PBS용액에 5 mg/mL의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 4℃의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다. 배양 중인 microplate 의 각 well에서 상층의 배지를 조심스럽게 160 씩 첨가하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 well에도 MTT 희석액을 가해 주었다.
- 복강대식세포를 세포배양판에 5xl07mL의 농도가 되도록 재 부유하여 IFN-v (10 U/mL)와 LPS (1 您/mL)의 자극하에 48시간 배양하고 그 배양 상청액 내의 NO를 Griess[13]반응에 의해 측정하였다. 즉 100 uL의 배양 상청액에 1% sulfanHamie (30% acetic acid)와 0.
- 온도는 20+2+, 명암주기가 12시간 단위로 유지하며 고형사료와 물을 충분히 공급하였다. 실험전 마우스를 동일한 조건하에서 사육하여 동물실 환경에서 적응시켰다. 사료는 삼양유지 사료사와 항생제 무첨가 마우스용 펠렛을 공급하였다.
- 암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 0.05% trypsin- 0.02% EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포(2x1g를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다(16).
- 초석잠 추출물 10 mL에 수돗물 100 mL로 희석하여 급수 병에 담아 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다(케이지당 5마리). 초석잠 추출물의 공급은 21일 동안 하였으며 총량은 3 g/5 마리/21일이 되도록 하였다.
- 5 N HC1 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 TNF용액을 3200, 1600, 800, 400, 200, 100 및 50 pg/mL의 농도로 조절하여 함께 측정하고 표준용액에서 측정된 흡광도를 근거로 polynomial standard regression curve를 작성하고 작성된 곡선 방정식을 기준으로 검체내에 포함된 TT亚의 양을 구하였다(14).
대상 데이터
- 5-6 주령의 수컷, C57 BL/6계 마우스를 대한실험동물센타 (충북 음성)에서 구입하여 사용하였다. 온도는 20+2+, 명암주기가 12시간 단위로 유지하며 고형사료와 물을 충분히 공급하였다.
- 경남 밀양시 산외면에서 직접 재배하여 사용하였다.
- 본 실험에 공시한 암세포주는 B16F10 마우스 흑색종 세포 (Tumor Repoitory of the National Cancer Institute, Bethesda, MD)로서 10% 우태아혈청, sodium pyruvate, nonessential amino acids 및 L-ghitamine이 함유된 RPMI1640 배지에 유지하였다. 암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 0.
- 실험전 마우스를 동일한 조건하에서 사육하여 동물실 환경에서 적응시켰다. 사료는 삼양유지 사료사와 항생제 무첨가 마우스용 펠렛을 공급하였다.
- 5 mM pyrophosphate 와 rubber policeman로 수집하여 복강대식세포로 사용하였다. 암 세포주로는 mouse mammary carcinoma 세포와 mouse leukemia 세포, human histocytic lymphoma를 사용하였다.
- 마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3 일 후, 1% fetal calf serum(FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린 (100 /jg/mL) 및 스트렙토마이신(100 “g/mL)이 첨가된 10 mL HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출 세포를 수집하였다. 이를 RPMI 1640 완전배지에 재부유시켜 37℃에서 3시간 배양한 후 부착되지 않은 세포들을 인산 완충액으로 세척하여 제거하고 부착세포들은 2.5 mM pyrophosphate 와 rubber policeman로 수집하여 복강대식세포로 사용하였다. 암 세포주로는 mouse mammary carcinoma 세포와 mouse leukemia 세포, human histocytic lymphoma를 사용하였다.
이론/모형
- 이 속에 포함된 적혈구는 멸균된 림프구 증류수를 사용하여 hypotonic shock로 제거하며 분리된 림프구는 완전배지에 부유시켰다. 복강대식세포는 Yoon등(11)의 방법에 따라 분리하였다. 마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3 일 후, 1% fetal calf serum(FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린 (100 /jg/mL) 및 스트렙토마이신(100 “g/mL)이 첨가된 10 mL HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출 세포를 수집하였다.
성능/효과
- CD4+ T세포 및 CD8* T세포의 비율이 정상대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD47CD8* 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF- a 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다.
- CD4+ T세포 및 CD8* T세포의 비율이 정상대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD47CD8* 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF- a 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 초석잠의 항암제 및 면역반응 조절자로서의 개발 가능성이 있음을 시사한다.
- 정상 대조군에 비하여 초석잠 잎 추출물 급식군의 경우에 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포의 비율이 증가하였다. 그러나 CD4*/ CD8+ 비는 대조군 4.
- 초석잠 추출물 급식군에서 대조군에 비하여 B16F10 세포의 폐전이는 숫적으로 감소하였으며 전이된 암세포 집락의 크기도 초석잠 추출물 급식군에서 현저하게 작아 초석잠 추출물이 암세포의 전이 뿐만 아니라 일단 전이된 암세포의 증식도 억제함을 알 수 있었다{Figure 2). 이는 T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-Y 그리고 본 실험 결과 항진되었던 TNF-α와 NO 외에도 복강대식 세포로부터의 IL-12, IL-15 등의 생산을 항진시켜 이에 의한 대식세포를 비롯한 면역계의 효과 세포들의 기능이 항진된 결과로 생각된다(18).
- 초석잠 추출물은 NO 생산을 약간 자극함을 알 수 있었으며 TNF-α 생산도 어느 정도 항진시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다 (Figure 1). 탐식기능이 있는 단핵 탐식세포계 세포를 활성화시킬 수 있는 세포가 생산하는 림포카인들의 자극을 받으면 탐식세포는 superoxide나 hydrogen peroxide 와 같은 반응성 산소중간물질(reactive oxygen intermediate : ROI)이나 NO와 같은 반응성 질소중간물질(reactive nitrogen intermediate: RNI)을 생성하여 탐식한 세포 내 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제한다(5, 10).
- 7로 양군 간의 차이를 관찰할 수 없었다(Table 3). 초석잠 추출물을 마우스에 투여한 후 비장세포의 T 세포아형의 변화에서는 helper T(CD4*) 세포 및 suppressor T(CD8*) 세포의 증가는 보였으나 CD4+/CD8+ T 세포의 비는 변하지 않았으므로, 생체 내에서도 면역계를 활성화시킬 수 있음을 보여주는 결과로 생각된다.
- 같았다. 초석잠 추출물의 농도 증가에 따라 증식능이 비장 세포의 경우 현저하게 증가하였으나 암 세포주에서는 그 증식능이 다소 억제됨을 알 수 있었다. 초석잠의 알코올 추출물이 각종 암세포에 의하여 저지작용을 가질 수 있음을 나타내었으며, 아울러 생체의 면역계가 다른 생체기관들과 상호 유기적으로 연관되어 있음을 고려할 때 초석잠 추출물이 면역반응 조절자(immuno response modifier)로서의 작용 가능성도 고려된다(15).
- 초석잠의 항암효과 및 면역조절자로서의 기능을 알아보기 위하여 마우스를 이용하여 실험한 결과, 마우스 비장 세포의 증식반응은 항진시켰으나 YAC-1 세포주의 증식능은 억제시켰다. CD4+ T세포 및 CD8* T세포의 비율이 정상대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD47CD8* 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다.
후속연구
- 이는 T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-Y 그리고 본 실험 결과 항진되었던 TNF-α와 NO 외에도 복강대식 세포로부터의 IL-12, IL-15 등의 생산을 항진시켜 이에 의한 대식세포를 비롯한 면역계의 효과 세포들의 기능이 항진된 결과로 생각된다(18). 본 연구 결과 초석잠 추출물을 이용한 항암제 또는 면역기능의 강화를 위한 면역반응 보조제로서의 개발 가능성이 기대되며 이를 기본 자료로 하여 이러한 기작들에 관한 연구가 앞으로 수행되어야 할 것이다.
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