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문제 정의
- 기존의 합성 항산화제 인 BHA(butylated hydroxy anisol), BHT(butylated hydroxy toluene)등은 다량 투여시 기형이 발생되거나 암이 발생될 가능성이 있다고 보고 되었으며4], a- tocopherol은 효능이 우수하나 가격이 비싼 단점이 있어, 본 연구에서는 초석잠에서 polyphenolic 화합물이 제일 많이 함유된 뿌리의 항산화 활성도를 밝혀 항산화성 식품소재로써 의 이용 가능성에 대한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 그 후, 3, 000 G에서 10분 동안 원심분리하고 그 상등액을 취하여 725nm에서 흡광도를 측정하였다.Caffic acid의 농도가 0, 3.125, 6.25/ 12.5, 25, 50, 100 gg/mL이 되도록 하여 작성한 검량선으로 측정한 흡광도를 농도로 환산하였다.
- DPPH를 통한 전자 소거능, 산화 지질 형성능 억제율과, 아질산염 소거능 측정을 통해 에틸아세테이트의 추출물이 가장 좋은 항산화 활성도를 나타냄을 알 수 있으므로, 다시 실리 카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분획 하였다. 각 분획별 흡광도의 변화를 Fig.
- 이러한 성질을 이용하여 간단하게 항산화 활성을 측정할 수 있다同. 각 용매 별로 분획하여 추출한 시료를 각각 4, 000 ng, 2, 000 ng 1, 000 pg, 600 pg, 250 pg, 125.13 pg, 15.64 Ug, 7.81 ug/1.95 ug을 취해서 메탄올 4 mL에 녹인 후, 1.5 x 10』 MDPPH 메탄올 용액 1 mL를 첨가하였다. 그 후 대조군 BHA, BHT, a-tocopherol과 함께 30분간 실온에 서 방치 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하 였다.
- 농축물을 300 mL의 3차 증류수에 녹인 후 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올순으로 1:1의 비율로 혼합한 후 분액 여두를 사용하여 3시 간씩 3회 반복 분획하였다. 각각의 분획물을 농축하여 시료 건물량에 대한 백분율로 추출 수율을 계산하였다.
- 0mL/min의 속도로 용출 용매를 전개 시켜 총 6개의 분획으로 나누었으며, 용출 용매를 제거 하기 위해 회전식 감압 증류 장치를 이용하였다. 각각의 분획은 DPPH방법을 이용해 항산화 활성도가 측정되고, UV/VIS 분광 광도계로 흡광도 파장이 측정되었다.
- 19%)의 추출물을 각각 얻었다. 그 중 에틸아세테이트의 추출물에서 높은 항산화 활성도를 보여 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 다시 분획 하였다.
- 9 g의 뿌리 분쇄 건조물을 메탄올 4 L로 12시간씩 3회 추출하고 GF/C (47 mm。, Whatman)로 감압 여과 시킨 후 회전식 감압 증류 장치로 농축시켰다. 농축물을 300 mL의 3차 증류수에 녹인 후 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올순으로 1:1의 비율로 혼합한 후 분액 여두를 사용하여 3시 간씩 3회 반복 분획하였다. 각각의 분획물을 농축하여 시료 건물량에 대한 백분율로 추출 수율을 계산하였다.
- 칼럼용 silical gel 60과 thin-layer chromatography silica gel 60 F254는 Merck사에서, 항산화 활성도 측정을 위한 l/l-diphenyl-2- picryl hydrazyl (이총!" DPPH라 표기함), butylated hydroxy toluene (이하 BHT라 표기함), butylated hydroxyanisole (이하 BHA라 표기함), a-tocopherol등은 Sigma사의 시약용이다. 시료 추출을 위해 사용된 용매를 증류시키기 위해 회전식 감압 증류장치(Yamato RE440Az Japen)와 흡광도를 측정하기 위해 UV/VIS 분광 광도계(Perkin Elmer, Gennany)를 사용하였다.
- 박층 크로마토그래피는 일정 두께를 가진 박층의 흡착제를 고정상으로 하고, 이동하는 용매상과 고정상에 대한 친화력이 물질에 따라 다른 것을 이용한 분리분석법으로 분리된 이동거리 Rf로 분석하는 장치이다. 실리카겔 칼럼을 이용해 1 mL/ min 속도로 용출시 킨 에틸아세 테이트의 추출물을 박층 크로 마토그래피를 이용해 64개의 fraction을 같은 Rf값을 가지고 있는 6개의 분획으로 나누었고 이를 각각 ES-R1 (1~3), ES-R2 (4〜6), ES-R3 (7~14), ES-R4 (15〜28), ES-R5 (29〜36), ES-R6 (37〜65)로 명명하였다. 분리되어진 띠의 확인은 UV 254 nm와 1% Ce (SO4)/10%H2SQ를 이용하였으며 그 결과를 Fig.
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요약
약용 식물로서 그 효능이 알려져 있으나 다른 약용 작물에 비해 성분 연구가 알려져 있지 않은 초석잠에 대한 항산화 활성도에 시험하였다. 뿌리의 메탄올 추출물 100 mg을 메탄올 20mL에 녹여 만든 샘플에서 total poplyphenols과 flavonoids가 각각 14.
- 25 mL를 넣고, 메탄올에 각각 10 mg/mL농도로 희석한 추출물을 30 此씩 첨가하였다. 자동 산화를 진행시키기 위해 시험액을 차광시킨 38〜4(TC의 배양기에 투입하여 매일 생성되는 과산화물의 양을 ferric thiocyanate 방법으로 측정하였으며, 대조군으로 BHA, BHT, a-tocopherol를 사용하였다. 즉 배양된 시험 액 50 此와 75% 메탄올 4.
- 용줄 용매로는 클로르포름: 메탄올:증류수(70:30:5)의 하층을 이용하였다. 칼럼의 맨 위 부분에 소량의 메탄올에 녹인 에틸아세테이트 추출물을 넣고 1.0mL/min의 속도로 용출 용매를 전개 시켜 총 6개의 분획으로 나누었으며, 용출 용매를 제거 하기 위해 회전식 감압 증류 장치를 이용하였다. 각각의 분획은 DPPH방법을 이용해 항산화 활성도가 측정되고, UV/VIS 분광 광도계로 흡광도 파장이 측정되었다.
- 항산화 활성도가 가장 높음을 나타낸 에틸아세테이트의 추출물을 실리카겔 칼럼(직경: 3 cm, 길이: 67 cm, 입자크기: 63、 200 Jim)을 사용하여 분리하였다. 용줄 용매로는 클로르포름: 메탄올:증류수(70:30:5)의 하층을 이용하였다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용한초석잠은 경남 밀양시 산외면 야산에서 직접 재배한 것이다. 겨울에 채취한 초석잠 뿌리를 바람이 잘 통하는 그늘에서 10일간 건조하여 분쇄기로 분쇄하였다. 용매로 사용한 메탄올, 클로르포름(Fisher science)은 특급시 약이고, 나머지 용매들은 Junsei사의 1급 시약이다.
- 본 실험에서 사용한초석잠은 경남 밀양시 산외면 야산에서 직접 재배한 것이다. 겨울에 채취한 초석잠 뿌리를 바람이 잘 통하는 그늘에서 10일간 건조하여 분쇄기로 분쇄하였다.
- 실리카겔 칼럼을 이용해 1 mL/ min 속도로 용출시 킨 에틸아세 테이트의 추출물을 박층 크로 마토그래피를 이용해 64개의 fraction을 같은 Rf값을 가지고 있는 6개의 분획으로 나누었고 이를 각각 ES-R1 (1~3), ES-R2 (4〜6), ES-R3 (7~14), ES-R4 (15〜28), ES-R5 (29〜36), ES-R6 (37〜65)로 명명하였다. 분리되어진 띠의 확인은 UV 254 nm와 1% Ce (SO4)/10%H2SQ를 이용하였으며 그 결과를 Fig. 6에 나타내었다. 각 분획물을 감압 증류하여 ES-R1에서는 하얀 분말을, ES-R2에서는 노란 분말을 ES-R3, ES-R4에서는 연두색 분말을 ES-R5, ES- R6에서는 갈색 분말을 얻었다.
- 항산화 활성도가 가장 높음을 나타낸 에틸아세테이트의 추출물을 실리카겔 칼럼(직경: 3 cm, 길이: 67 cm, 입자크기: 63、 200 Jim)을 사용하여 분리하였다. 용줄 용매로는 클로르포름: 메탄올:증류수(70:30:5)의 하층을 이용하였다. 칼럼의 맨 위 부분에 소량의 메탄올에 녹인 에틸아세테이트 추출물을 넣고 1.
이론/모형
- 과산화지질 형성 억제능 측정은 linoleic acid를 자동산화 모델로 하여 측정하였다[17]. 시험액 조제를 위해 20 mL 유리 병 에 linoleic acid 용액 (linoleic acid 2.
- 초석 잠 뿌리의 total polyphenols 함량을 Folin-Denis1^ [15]으로 측정하였다. 메탄올 추출물(99% 메탄올 1 mL에 추출물 500 卩g을 용해) 용액 0.
성능/효과
- 7에 나타내 었으며 최대 흡광도값을 Table 2에 나타내 었으며 칼럼 분획물은 280 - 330 run 사이 에 서 높은 흡광도를 나타내고 있다. 각 분획을 DPPH법을 이용해 항산화 활성도를 측정하여 Fig. 8에 나타내 었으며, 325 nm 및 289 nm에 서 최대 흡광도 값을 가지는 값인 ES-5가 가장 높은 활성도를 나타내었다. 이러한 모양은 phenolic acids 과 flavonids의 UV-VIS spectral 값인 200〜400 nm 사이와 일치 하몌2] 특히 flavonids 계열 중 flavones의 최대 홉광범위로 알려져 있는 띠 I 이300〜33Qnm, 띠 !!가275〜295mn와 일치 하는 범위를 나타내고 있다卩1].
- 건조시켜 가루 상태의 초석잠 뿌리(Stacks sieboldii MIQ.)696.6 g을 메탄올로 추출하여 86.37 g (12.4%)의 추출물을 얻었으며 이 중 86.37 g을 취하여 헥산 추출물에서 2.86 g (3.31%), 클로르포름, 3.27 g (3.79%), 에 틸 아세 테 이트, 1.23 g (1.42%),부탄올, 9.79 g (11.34%), 증류수, 59.77 g (69.19%)의 추출물을 각각 얻었다. 그 중 에틸아세테이트의 추출물에서 높은 항산화 활성도를 보여 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 다시 분획 하였다.
- 8 ug), 부탄올(10 pg) 추출물이 보다 우수한 항산화능을 보였다. 과산화 지질 형성 억제능과 아질산염 소거능 조사에서는 에틸아세테이트의 추출물이 다른 용매 분획물과 비하여 가장 높은 활성도를 나타내 었으며 기존의 항산화제들과 비슷한 효능을 나타내었다. 이를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용해 다시 분획하여 6개의 분획을 얻었으며 UV/VIS 흡광광도계를 통해 최대 홉광도의 파장은 280〜330 nm사이에 있음을 확인하였다.
- 약용 식물로서 그 효능이 알려져 있으나 다른 약용 작물에 비해 성분 연구가 알려져 있지 않은 초석잠에 대한 항산화 활성도에 시험하였다. 뿌리의 메탄올 추출물 100 mg을 메탄올 20mL에 녹여 만든 샘플에서 total poplyphenols과 flavonoids가 각각 14.3 JJg/zg/mL (3.02%), 9.9 pg/mL (1.97%)씩 함유되어 있음을 알 수 있으며 각 유기 용매층의 추출물의 항산화 활성도를 비교해 본 결과 DPPH법을 통해 기존의 항산화제인 a -tocopherol (21.8)ig), BHT (100 ]lg) 그리고 BHA (20.6 Rg)와 비교해서 에틸아세테이트(2.8 ug), 부탄올(10 pg) 추출물이 보다 우수한 항산화능을 보였다. 과산화 지질 형성 억제능과 아질산염 소거능 조사에서는 에틸아세테이트의 추출물이 다른 용매 분획물과 비하여 가장 높은 활성도를 나타내 었으며 기존의 항산화제들과 비슷한 효능을 나타내었다.
- 하지만 4일부터 증류수, 메탄올, 헥산, 클로르포름 순으로 급격한 흡광도의 변화를 보이며 산화가 되어감을 보였다. 에틸아세테이트와 부탄올은 대조군으로 사용된 기존의 항산화제인 BHA, BHT, a-tocoph- erol와 비슷하게 9일 동안 흡광도의 변화를 보이지 않으면서 지속적인 과산화 지질 형성 억제능을 보여 주고 있었다.
- 그 중 최대 흡광도가 띠 I 이 325 nm, 띠!! 가 289 nm 인 ES-R5에서 가장 높은 항산화 활성을 보였다. 이는 일반적으로 알려져 있는 phenolic compounds의 UV-VIS spectral data와 일치하며 특히 fla- vones의 UV- VIS spectral data와 유사한 경향을 보이고 있으므로 flavones 계통의 phenolic compounds가 초석잠(staTzys sieboldii MIQ)속에 함유되어 있음을 알 수 있었다.
- 과산화 지질 형성 억제능과 아질산염 소거능 조사에서는 에틸아세테이트의 추출물이 다른 용매 분획물과 비하여 가장 높은 활성도를 나타내 었으며 기존의 항산화제들과 비슷한 효능을 나타내었다. 이를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용해 다시 분획하여 6개의 분획을 얻었으며 UV/VIS 흡광광도계를 통해 최대 홉광도의 파장은 280〜330 nm사이에 있음을 확인하였다. 그 중 최대 흡광도가 띠 I 이 325 nm, 띠!! 가 289 nm 인 ES-R5에서 가장 높은 항산화 활성을 보였다.
- 8 jig)의 순으로 높은 소거능을 보이고 있다. 특히 에틸 아세테이트와 메탄올 추출물은 대조군으로 사용된 기존의 항산화제인 BHA (20.6 )ig), BHT (100 jig), a -tocopherol(21.8 mg)에 비해 높은 활성도를 나타내고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이러한 모양은 phenolic acids 과 flavonids의 UV-VIS spectral 값인 200〜400 nm 사이와 일치 하몌2] 특히 flavonids 계열 중 flavones의 최대 홉광범위로 알려져 있는 띠 I 이300〜33Qnm, 띠 !!가275〜295mn와 일치 하는 범위를 나타내고 있다卩1]. 이러한 범위는 초석잠(St”奶ssieboldii MIQ.)에서 항산화 활성도가 높은 부분만을 취해 분획 하여 나타난 UV- VIS spectral data의 범위와 같으므로 본 연구의 추출물 중에도 여러 phenolic compounds가 존재함을 추정 할 수 있으며, 보다 정확한 구조는 차후 실험에서 C-NMR, H-NMR, IR등을 이용해 밝힐 예정이다.
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