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문제 정의
- 본 연구에서는 초석잠의 기능성 연구의 일환으로 초석잠줄기의 항산화 활성도와 페놀성 화합물의 존재를 밝혀 기능성 소재의 식품소재로써의 이용가능성에 대한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- 이러한 성질을 이용하여 간단하게 항산화 활성을 측정할 수 있다(11). 각 용매 별로 분획하여 추출한 시료를 각각 4, 000 “g, 2,000 昭 1,000 俸, 600 昭, 250 您, 125.13 傩, 15.64 侷 7.81 昭, 1.95 昭을 취해서 메탄올 4 mL에 녹인 후, 1.5x10" M DPPH 메탄올 용액 1 mL를 첨가하였다. 그 후 대조군 BHA, BHT, a-tocopherol과 함께 30분간 실온에서 방치 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 그 후, 3, 000 G에서 10분 동안 원심분리하고 그 상등액을 취하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Caffic acid의 농도가 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 俸/mL이 되도록 하여 작성한 검량선으로 측정한 흡광도를 농도로 환산하였다.
- DPPH를 통한 전자 소거능, 산화 지질 형성능 억제율과, 아질산염 소거능 측정을 통해 에틸아세테이트의 추출물이 가장 높은 항산화 활성도를 나타내었으므로, 물질의 특성을 고찰하기 위해 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하였다. 각 분획별 흡광도의 변화를 Fig.
- 직접 재배한 것이다. 가을에 추수한 초석잠을 부분별로 잘라서 바람이 잘 통하는 그늘에서 15일간 건조하여 분쇄기로 분쇄하였다. 용매로 사용한 메탄올, 클로르포름 (Fisher science)은 특급 시약이고, 나머지 용매들은 Junsei사의 1급시약이 다.
- 각 용매별로 추출한 시료의 DPPH에 의한 자유 라다칼 소거작용을 측정하여 라디칼의 50%를 소거시키는 농도 값을 RC50으로 표시하였으며 Fig. 3에 각 추출 시료의 비교 값을 나타내었다. 메탄올 (225 俸)추출물을 기준으로 각 용매 추출물의 RC50 값을 보면 에틸아세테이트 추출물 (15 陽)이 가장 높은 활성도 값을 나타내었으며 그 다음으로 부탄올 (50 您), 클로르포름 (170 昭) 추출물 순으로 활성도를 나타내었고 헥산 (490 俸), 증류수 (570 俸) 추출물은 메탄올보다 낮은 활성도를 나타내었다.
- 농축물을 300 mL의 3차 증류수에 녹인 후 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 1 : 1의 비율로 혼합한 후 분액여두를 사용하여 3시간씩 3회 반복 분획하였다. 각각의 분획물은 농축하여 시료 건물량에 대한 백분율로 추출 수율을 계산하였다.
- 0 mL/min의 속도로 용출 용매를 전개 시켜 총 5개의 분획으로 나누었으며, 용출 용매를 제거하기 위해 회전식 감압 증류장치를 이용하였다. 각각의 분획은 DPPH방법을 이용해 항산화 활성도가 측정되고, UV/VIS 분광 광도계로 흡광도파장이 측정되었다.
- 98%)의 추출물을 각각 얻었다. 그 중 에틸아세테이트의 추출물에서 높은 항산화 활성도를 보여 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 다시 분획하였다.
- 5x10" M DPPH 메탄올 용액 1 mL를 첨가하였다. 그 후 대조군 BHA, BHT, a-tocopherol과 함께 30분간 실온에서 방치 한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 580 g의 줄기 분쇄 건조물을 메탄올 4 L로 15시간씩 3회 추출하고 GF/C (47 mm。, Whatman)로 감압 여과 시킨 후 회전식 감압 증류 장치로 농축시켰다. 농축물을 300 mL의 3차 증류수에 녹인 후 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 부탄올 순으로 1 : 1의 비율로 혼합한 후 분액여두를 사용하여 3시간씩 3회 반복 분획하였다. 각각의 분획물은 농축하여 시료 건물량에 대한 백분율로 추출 수율을 계산하였다.
- 박층 크로마토그래피는 일정 두께를 가진 박층의 흡착제를 고정상으로 하고, 이동하는 용매상과 고정상에 대한 친화력이 물질에 따라 다른 것을 이용한 분리분석법으로 분리된 이동거리 Rf를 측정하였다. 실리카겔 칼럼을 이용해 1 mL/min 속도로 용출시킨 에틸아세테이트의 추출물을 박층 크로마토그래피를 이용해 64개의 fraction을 같은 Rf 값을 가지고 있는 5개의 분획으로 나누었고 이를 각각 ES-1 (17), ES-2 (& 15), ES-3 (1629), ES-4 (3043), ES-5 (4464)로 명명하였다.
- 칼럼 용 silical gel 60과 thin-layer chromatography silica gel 60 F254는 Merck사에서, 항산화 활성도 측정을 위한 1, 1-diphenyl- 2-picryl hydrazyl (이하 DPPH라 표기함), butylated hydroxytoluene (이하 BHT라표기함), butylated hydroxyanisole (이하 BHA 라 표기함), a-tocopherol 등은 sigma사의 시약용이다. 시료 추출을 위해 사용된 용매를 증류시키기 위해 회전식 감압 증류장치 (Yamato RE440A, Japen) 와 흡광도를 측정하기 위해 UV/VIS 분광광도계(Perkin Elmer, Germany) 를 사용하였다.
- 하여 측정하였다(12). 시험액 조제를 위해 20 mL 유리병에 linoleic acid 용액 (linoleic acid 2.5 mg을 메탄올 1 mL에 용해) 0.57 mL와 1 M phosphate buffer (pH 7.0) 2.25 mL를 넣고, 메탄올에 각각 10 mg/mL 농도로 희석한 추출물을 30 区씩 첨가하였다. 자동 산화를 진행시키기 위해 시험액을 차광시킨 3840 ℃의 배양기에 투입하여 매일 생성되는 과산화물의 양을 ferric thiocyanate 방법으로 측정하였으며, 대조군으로 BHA, BHT, a-tocopherol를 사용하였다 즉 배양된 시험액 50 pl와 75% 메탄올 4.
- Rf를 측정하였다. 실리카겔 칼럼을 이용해 1 mL/min 속도로 용출시킨 에틸아세테이트의 추출물을 박층 크로마토그래피를 이용해 64개의 fraction을 같은 Rf 값을 가지고 있는 5개의 분획으로 나누었고 이를 각각 ES-1 (17), ES-2 (& 15), ES-3 (1629), ES-4 (3043), ES-5 (4464)로 명명하였다. 분리되어진 띠의 확인은 UV 254 nm와 1% Ce(SO4)/10% H2SO4를 이용하였으며 그 결과를 Fig.
- 02 mL을 가한 후, 37 ℃ 항온조에서 1시간 동안 방치 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다<10). 이때 Rutin의 농도가 0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 “g/mL이 되도록 하여 작성한 검량 선으로 농도를 산출하였다.
- 25 mL를 넣고, 메탄올에 각각 10 mg/mL 농도로 희석한 추출물을 30 区씩 첨가하였다. 자동 산화를 진행시키기 위해 시험액을 차광시킨 3840 ℃의 배양기에 투입하여 매일 생성되는 과산화물의 양을 ferric thiocyanate 방법으로 측정하였으며, 대조군으로 BHA, BHT, a-tocopherol를 사용하였다 즉 배양된 시험액 50 pl와 75% 메탄올 4.85 mL를 시험관에 넣고 잘 섞은 후, 30% ammonium thiocyanate 50 虬를 반응액에 가한 후 3분 동안반응시키고 3.5% 염산 용액에 녹인 20 mM ferrous chloride 50 pL를 반응액 에 가하여 나타나는 붉은색 을 UV/VIS 분광 광도계를 이용하여 500 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 초석잠의 메탄올 추출물에서 total polyphenol 과 flavonoid 의 함량을 측정하여 Table 1에 나타내었으며, 활성 성분에 대한 특성을 검토하고자 극성이 다른 유기 용매인 헥산, 클로르포름, 에틸아세테이트, 및 부탄올 순으로 순차적으로 추출물을 용출하여 얻은 수율을 Fig. 2 에 나타내었다. 건조시켜 가루 싱태의 초석잠 (Stachys si沥0서『MIQ.
- 용출 용매로는 클로르포름 : 메탄올 : 증류수 (70 : 30 : 5)의 하층을 이용하였다. 칼럼의 맨 위 부분에 소량의 메탄올에 녹인 에틸아세테이트 추출물을 넣고 1.0 mL/min의 속도로 용출 용매를 전개 시켜 총 5개의 분획으로 나누었으며, 용출 용매를 제거하기 위해 회전식 감압 증류장치를 이용하였다. 각각의 분획은 DPPH방법을 이용해 항산화 활성도가 측정되고, UV/VIS 분광 광도계로 흡광도파장이 측정되었다.
- 항산화 활성도가 가장 높음을 나타낸 에틸아세테이트의 추출물을 실리카겔 칼럼 (직경: 3 cm, 길이: 67 cm, 입자크기: 63200 ㎛)을 사용하여 분리하였다. 용출 용매로는 클로르포름 : 메탄올 : 증류수 (70 : 30 : 5)의 하층을 이용하였다.
대상 데이터
- 2 에 나타내었다. 건조시켜 가루 싱태의 초석잠 (Stachys si沥0서『MIQ.) 580 g을 메탄올로 추출하여 39.21 g (6.75%)의 추출물을 얻었으며 이중 38.41 g을 취하여 헥산 추출물에서 1.23 g (3.125%), 클로르포름, 3.22 g (8.38%), 에틸아세테이트, 3.23 g (8.41%), 부탄올, 3.53 g (9.19%), 증류수, 26.88 g (69.98%)의 추출물을 각각 얻었다. 그 중 에틸아세테이트의 추출물에서 높은 항산화 활성도를 보여 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 다시 분획하였다.
- 본 실험에서 사용한 초석잠은 경남 밀양시 산외면 야산에서 직접 재배한 것이다. 가을에 추수한 초석잠을 부분별로 잘라서 바람이 잘 통하는 그늘에서 15일간 건조하여 분쇄기로 분쇄하였다.
- 실리카겔 칼럼을 이용해 1 mL/min 속도로 용출시킨 에틸아세테이트의 추출물을 박층 크로마토그래피를 이용해 64개의 fraction을 같은 Rf 값을 가지고 있는 5개의 분획으로 나누었고 이를 각각 ES-1 (17), ES-2 (& 15), ES-3 (1629), ES-4 (3043), ES-5 (4464)로 명명하였다. 분리되어진 띠의 확인은 UV 254 nm와 1% Ce(SO4)/10% H2SO4를 이용하였으며 그 결과를 Fig. 6 에 나타내었다. 5개분획의 대표 Rf값은 ES-1 (0.
- ㎛)을 사용하여 분리하였다. 용출 용매로는 클로르포름 : 메탄올 : 증류수 (70 : 30 : 5)의 하층을 이용하였다. 칼럼의 맨 위 부분에 소량의 메탄올에 녹인 에틸아세테이트 추출물을 넣고 1.
- 분획으로 분류하기 위해 사용되었다. 전개 상으로는 클로르포름 : 메탄올 : 증류수 (70 : 30 : 5)의 하층이 사용되었으며 UV light 검출기와 10% H2SO4에 1%의 Ce(SOQ를 녹인 발색제가 사용되여 Rf 값이 구해졌다.
이론/모형
- Antioxidant activity of the isolated fraction of ethylacetate from Stachys sieboldii MIQ. stalks by silica gel column by DPPH method.
- 과산화지질 형성 억제능 측정은 linoleic acid를 자동산화모델로 하여 측정하였다(12). 시험액 조제를 위해 20 mL 유리병에 linoleic acid 용액 (linoleic acid 2.
- 초석잠 줄기의 total polyphenol 함량을 Folin-Denis법(9)으로 측정하였다. 메탄올 추출물 (99%메탄올 1 mL에 추출물 500 을 용해) 용액 0.
성능/효과
- 4에 나타내었다. 9일 동안 측정한 결과 증류수 추출물은 control과 같은 양상으로 1일이 지난 후 흡광도가 0.1에서 0.3으로 변화하며 급격한 산화 현상을 보이고 있고, 에틸아세테이트 추출물을 제외한 다른 용매 역시 5일 후부터는 초기 흡광도보다 2배 이상 높아지며 산화가 시작됨을 보이고 있었다. 에틸아세테이트추출물은 대조군으로 사용된 BHA, BHT, a-tocopherol과 비슷하게 9일 동안 흡광도의 변화를 보이지 않으면서 지속적인 과산화 지질 형성 억제능을 보여주고 있었다.
- )에는 많은 유용한 물질이 있음을 알 수 있었다. 줄기의 메탄올 추출물 10。 mg을 메탄올 20 mL에 녹여 만든 샘플에서 total poplyphenol과 flavonoid가 각각 9.33 /zg/mL (1.97%), 3.77 /zg/mL (0.75%)씩 함유되고 있음을 알 수 있으며 각 유기 용매층의 추출물의 항산화 활성도를 비교해 본 결과 DPPH법을 통해 기존의 항산화제인 a-tocopherol (21.8 陽), BHT (100 昭) 그리고 BHA (20.6 “g)와 비교해도 에틸아세테이트 (15 姻), 부탄올 (50 陽) 추출물의 항산화능이 뒤지지 않음을 알 수 있었다. 또한 과산화 지질 형성 억제능과 아질산염 소거능 조사에서 에틸아세테이트의 추출물이 가장 높은 활성도를 나타내었으며 기존의 항산화제들과 비슷한 효능을 나타내었다.
- 6 “g)와 비교해도 에틸아세테이트 (15 姻), 부탄올 (50 陽) 추출물의 항산화능이 뒤지지 않음을 알 수 있었다. 또한 과산화 지질 형성 억제능과 아질산염 소거능 조사에서 에틸아세테이트의 추출물이 가장 높은 활성도를 나타내었으며 기존의 항산화제들과 비슷한 효능을 나타내었다. 이를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 이용해 다시 분획하였고 UV/VIS 흡광광도계를 통해 최대 흡광도의 파장은 280-330 nm 사이에 나타내었다.
- 3에 각 추출 시료의 비교 값을 나타내었다. 메탄올 (225 俸)추출물을 기준으로 각 용매 추출물의 RC50 값을 보면 에틸아세테이트 추출물 (15 陽)이 가장 높은 활성도 값을 나타내었으며 그 다음으로 부탄올 (50 您), 클로르포름 (170 昭) 추출물 순으로 활성도를 나타내었고 헥산 (490 俸), 증류수 (570 俸) 추출물은 메탄올보다 낮은 활성도를 나타내었다. 특히 에틸 아세테이트와 부탄올 추출물은 대조군으로 사용된 기존의 항산화제인 BHA (20.
- 3으로 변화하며 급격한 산화 현상을 보이고 있고, 에틸아세테이트 추출물을 제외한 다른 용매 역시 5일 후부터는 초기 흡광도보다 2배 이상 높아지며 산화가 시작됨을 보이고 있었다. 에틸아세테이트추출물은 대조군으로 사용된 BHA, BHT, a-tocopherol과 비슷하게 9일 동안 흡광도의 변화를 보이지 않으면서 지속적인 과산화 지질 형성 억제능을 보여주고 있었다.
- 메탄올 (225 俸)추출물을 기준으로 각 용매 추출물의 RC50 값을 보면 에틸아세테이트 추출물 (15 陽)이 가장 높은 활성도 값을 나타내었으며 그 다음으로 부탄올 (50 您), 클로르포름 (170 昭) 추출물 순으로 활성도를 나타내었고 헥산 (490 俸), 증류수 (570 俸) 추출물은 메탄올보다 낮은 활성도를 나타내었다. 특히 에틸 아세테이트와 부탄올 추출물은 대조군으로 사용된 기존의 항산화제인 BHA (20.6 區), BHT (100 飓), a-tocopherol (21.8 俸)과 대등하거나 높은 활성도를 나타내고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 이 중 280~290 nm에서 최대 흡광도를 나타내는 물질에는 rosmanol (284 ran), epiisorosmanol (288 nm), epiisorosmanol methyl ether (288 nm), epiisorosmanol ethyl ether (288 nm), camosic acid (284 nm), methyl camosate (282 nm)가 알려져 있고 330 nm 부근에서 최대 흡광도를 가지는 물질에는 rosmarinic acid (328 nm), homoplantaginin (334 nm), crsimaritin (334 nm), 4-methoxytectoc hrysin (332 nm), genistein (330 nm)가 알려져 있다{15, 17). 이러한 범위는 초석잠 (Stachys sieboldii 에서 항산화 활성도가 높은 부분만을 취해 분획하여 나타난 UV-VIS spectral data의 범위와 같으므로 본 연구의 추출물 중에도 여러 phenolic compounds가 존재함을 추증할 수 있으며, 보다 정확한 구조는 차후 실험에서 C-NMR, H-NMR, IR 등을 이용해 밝히고자 한다.
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