초석잠의 항암효과 및 면역조절자로서의 기능을 알아보기 위하여 마우스를 이동하여 실험한 결과, 마우스 비장세포의 증식반응은 항진시켰으나 YAC-1 세포주의 증식능은 억제시켰다. CD4+ T세포 및 CD8+ T세포의 비율이 정상 대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD4+/CD8+ 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF-$\alpha$ 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 초석잠의 항암제 및 면역반응 조절자로서의 개발 가능성이 있음을 시사한다.
초석잠의 항암효과 및 면역조절자로서의 기능을 알아보기 위하여 마우스를 이동하여 실험한 결과, 마우스 비장세포의 증식반응은 항진시켰으나 YAC-1 세포주의 증식능은 억제시켰다. CD4+ T세포 및 CD8+ T세포의 비율이 정상 대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD4+/CD8+ 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF-$\alpha$ 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 초석잠의 항암제 및 면역반응 조절자로서의 개발 가능성이 있음을 시사한다.
The present study was designed to investigate the effects of Stachys Sieboldii MIQ as a new natural antitumor agent or immunomodulator. To obtain the above objectives, Stachys sieboldii MIQ was extracted with ethanol. Stachys sieboldii MIQ accelerated mouse spleen cell growth, but inhibited FM3A/S°-...
The present study was designed to investigate the effects of Stachys Sieboldii MIQ as a new natural antitumor agent or immunomodulator. To obtain the above objectives, Stachys sieboldii MIQ was extracted with ethanol. Stachys sieboldii MIQ accelerated mouse spleen cell growth, but inhibited FM3A/S°-cell growth. However, no significant difference was found for CD4+ / CD8+ cells. The growth rates of CD4+ and CD8+ T cells were accelerated more than those normal mouse group. Stachys sieboldii MIQ fed mice showed a significant enhancement of IL-2 receptor expression, increased numbers of CD4+ T cells, and CD8+ T cells. Stachys sieboldii MIQ also stimulated the production of NO by peritoneal macrophages and the production of NO by and the growth of mouse spleen cells. On the other hand, lung localization of Bl6Fl0 melanoma cells was inhibited by ethanol extract of Stachys sieboldii MIQ. These results show that Stachys sieboldii MIQ is a useful new functional antitumor agent or immunomodulator.
The present study was designed to investigate the effects of Stachys Sieboldii MIQ as a new natural antitumor agent or immunomodulator. To obtain the above objectives, Stachys sieboldii MIQ was extracted with ethanol. Stachys sieboldii MIQ accelerated mouse spleen cell growth, but inhibited FM3A/S°-cell growth. However, no significant difference was found for CD4+ / CD8+ cells. The growth rates of CD4+ and CD8+ T cells were accelerated more than those normal mouse group. Stachys sieboldii MIQ fed mice showed a significant enhancement of IL-2 receptor expression, increased numbers of CD4+ T cells, and CD8+ T cells. Stachys sieboldii MIQ also stimulated the production of NO by peritoneal macrophages and the production of NO by and the growth of mouse spleen cells. On the other hand, lung localization of Bl6Fl0 melanoma cells was inhibited by ethanol extract of Stachys sieboldii MIQ. These results show that Stachys sieboldii MIQ is a useful new functional antitumor agent or immunomodulator.
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문제 정의
본 연구는 이와 같이 많은 효능에도 불구하고 아직까지 항암 활성이나 생리활성 물질에 대한 연구가 진행되지 않은 초석잠으로부터 항암 효과에 대하여 실험하였다.
제안 방법
1% N-(l-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride(60% acetic acid) 혼합액 100 uL를 가하여 실온에서 방치하였다. 20분 후 ELISA 판독기 (Bio Tek Instruments Inc, model EL311 SL)를 사용하여 800 eg/mL의 유지 농도에서 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
02% EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포(2x1g를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다(16).
MTT를 이용한 방법을 변형하여 실시하였다<12). MTT를 PBS용액에 5 mg/mL의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 4℃의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다.
T 림프구 아형의 구성비는 phycoerythrin(PE)-conjugated rat anti-mouse CD4(L3T4) mAb와 FITC conjugated rat antimouse CD8(Ly-2)mAb 를 이용하고 IL-2 수용체는 HTC-cojugated rat anti-mouse CD25 mAb를 이용하여 분석하였다.
Tumor necrosis factor(TNF)의 측정은 ELISA kit(Genzyme, Boston, MA)를 사용하여 시행하였다. 즉 24시간 동안 항 TNF 항체를 96well plate에 부착시킨 뒤 세척하고 여기에 검체 100 甘L를 넣고 1시간 동안 96 well plate에서 반응시켰다.
복강대식세포는 Yoon등(11)의 방법에 따라 분리하였다. 마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3 일 후, 1% fetal calf serum(FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린 (100 /jg/mL) 및 스트렙토마이신(100 “g/mL)이 첨가된 10 mL HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출 세포를 수집하였다. 이를 RPMI 1640 완전배지에 재부유시켜 37℃에서 3시간 배양한 후 부착되지 않은 세포들을 인산 완충액으로 세척하여 제거하고 부착세포들은 2.
MTT를 PBS용액에 5 mg/mL의 농도가 되도록 녹인 다음, 무균 여과하여 4℃의 어두운 곳에 보관하였고, 보관된 지 3주 이내의 것을 검사에 사용하였다. 배양 중인 microplate 의 각 well에서 상층의 배지를 조심스럽게 160 씩 첨가하였다. 이때 세포를 함유하지 않은 well에도 MTT 희석액을 가해 주었다.
복강대식세포를 세포배양판에 5xl07mL의 농도가 되도록 재 부유하여 IFN-v (10 U/mL)와 LPS (1 您/mL)의 자극하에 48시간 배양하고 그 배양 상청액 내의 NO를 Griess[13]반응에 의해 측정하였다. 즉 100 uL의 배양 상청액에 1% sulfanHamie (30% acetic acid)와 0.
온도는 20+2+, 명암주기가 12시간 단위로 유지하며 고형사료와 물을 충분히 공급하였다. 실험전 마우스를 동일한 조건하에서 사육하여 동물실 환경에서 적응시켰다. 사료는 삼양유지 사료사와 항생제 무첨가 마우스용 펠렛을 공급하였다.
암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 0.05% trypsin- 0.02% EDTA 용액으로 수집하여 2회 수세하여 PBS롤 농도를 조정하였다. B16F10 세포(2x1g를 마우스 미정맥을 통하여 주사한 후 14일째에 폐를 제거하여 흑색종의 수를 관찰하여 산정하였다(16).
초석잠 추출물 10 mL에 수돗물 100 mL로 희석하여 급수 병에 담아 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다(케이지당 5마리). 초석잠 추출물의 공급은 21일 동안 하였으며 총량은 3 g/5 마리/21일이 되도록 하였다.
5 N HC1 용액을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 450 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준 TNF용액을 3200, 1600, 800, 400, 200, 100 및 50 pg/mL의 농도로 조절하여 함께 측정하고 표준용액에서 측정된 흡광도를 근거로 polynomial standard regression curve를 작성하고 작성된 곡선 방정식을 기준으로 검체내에 포함된 TT亚의 양을 구하였다(14).
대상 데이터
5-6 주령의 수컷, C57 BL/6계 마우스를 대한실험동물센타 (충북 음성)에서 구입하여 사용하였다. 온도는 20+2+, 명암주기가 12시간 단위로 유지하며 고형사료와 물을 충분히 공급하였다.
경남 밀양시 산외면에서 직접 재배하여 사용하였다.
본 실험에 공시한 암세포주는 B16F10 마우스 흑색종 세포 (Tumor Repoitory of the National Cancer Institute, Bethesda, MD)로서 10% 우태아혈청, sodium pyruvate, nonessential amino acids 및 L-ghitamine이 함유된 RPMI1640 배지에 유지하였다. 암세포의 준비는 대수증식기의 암세포를 0.
실험전 마우스를 동일한 조건하에서 사육하여 동물실 환경에서 적응시켰다. 사료는 삼양유지 사료사와 항생제 무첨가 마우스용 펠렛을 공급하였다.
5 mM pyrophosphate 와 rubber policeman로 수집하여 복강대식세포로 사용하였다. 암 세포주로는 mouse mammary carcinoma 세포와 mouse leukemia 세포, human histocytic lymphoma를 사용하였다.
마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3 일 후, 1% fetal calf serum(FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린 (100 /jg/mL) 및 스트렙토마이신(100 “g/mL)이 첨가된 10 mL HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출 세포를 수집하였다. 이를 RPMI 1640 완전배지에 재부유시켜 37℃에서 3시간 배양한 후 부착되지 않은 세포들을 인산 완충액으로 세척하여 제거하고 부착세포들은 2.5 mM pyrophosphate 와 rubber policeman로 수집하여 복강대식세포로 사용하였다. 암 세포주로는 mouse mammary carcinoma 세포와 mouse leukemia 세포, human histocytic lymphoma를 사용하였다.
이론/모형
이 속에 포함된 적혈구는 멸균된 림프구 증류수를 사용하여 hypotonic shock로 제거하며 분리된 림프구는 완전배지에 부유시켰다. 복강대식세포는 Yoon등(11)의 방법에 따라 분리하였다. 마우스의 복강내에 Brewer's thioglycollate broth(Difco laboratory, detroit, MI) 3 mL를 주사한 3 일 후, 1% fetal calf serum(FCS), 10 mM HEPES, 그리고 페니실린 (100 /jg/mL) 및 스트렙토마이신(100 “g/mL)이 첨가된 10 mL HBSS(calcium 및 magnesium 무첨가)를 이용하여 복강 삼출 세포를 수집하였다.
성능/효과
CD4+ T세포 및 CD8* T세포의 비율이 정상대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD47CD8* 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF- a 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다.
CD4+ T세포 및 CD8* T세포의 비율이 정상대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD47CD8* 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다. 또한, 복강대식세포로부터의 nitric oxide와 TNF- a 생산을 항진시켰으며, 복강대식세포는 탐식능이 현저하게 항진되었고 B16F10 흑색종의 폐전이가 억제됨을 알 수 있었다. 따라서, 초석잠의 항암제 및 면역반응 조절자로서의 개발 가능성이 있음을 시사한다.
정상 대조군에 비하여 초석잠 잎 추출물 급식군의 경우에 CD4+ T세포 및 CD8+ T세포의 비율이 증가하였다. 그러나 CD4*/ CD8+ 비는 대조군 4.
초석잠 추출물 급식군에서 대조군에 비하여 B16F10 세포의 폐전이는 숫적으로 감소하였으며 전이된 암세포 집락의 크기도 초석잠 추출물 급식군에서 현저하게 작아 초석잠 추출물이 암세포의 전이 뿐만 아니라 일단 전이된 암세포의 증식도 억제함을 알 수 있었다{Figure 2). 이는 T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-Y 그리고 본 실험 결과 항진되었던 TNF-α와 NO 외에도 복강대식 세포로부터의 IL-12, IL-15 등의 생산을 항진시켜 이에 의한 대식세포를 비롯한 면역계의 효과 세포들의 기능이 항진된 결과로 생각된다(18).
초석잠 추출물은 NO 생산을 약간 자극함을 알 수 있었으며 TNF-α 생산도 어느 정도 항진시킬 수 있음을 관찰할 수 있었다 (Figure 1). 탐식기능이 있는 단핵 탐식세포계 세포를 활성화시킬 수 있는 세포가 생산하는 림포카인들의 자극을 받으면 탐식세포는 superoxide나 hydrogen peroxide 와 같은 반응성 산소중간물질(reactive oxygen intermediate : ROI)이나 NO와 같은 반응성 질소중간물질(reactive nitrogen intermediate: RNI)을 생성하여 탐식한 세포 내 미생물을 사멸시키거나 증식을 억제한다(5, 10).
7로 양군 간의 차이를 관찰할 수 없었다(Table 3). 초석잠 추출물을 마우스에 투여한 후 비장세포의 T 세포아형의 변화에서는 helper T(CD4*) 세포 및 suppressor T(CD8*) 세포의 증가는 보였으나 CD4+/CD8+ T 세포의 비는 변하지 않았으므로, 생체 내에서도 면역계를 활성화시킬 수 있음을 보여주는 결과로 생각된다.
같았다. 초석잠 추출물의 농도 증가에 따라 증식능이 비장 세포의 경우 현저하게 증가하였으나 암 세포주에서는 그 증식능이 다소 억제됨을 알 수 있었다. 초석잠의 알코올 추출물이 각종 암세포에 의하여 저지작용을 가질 수 있음을 나타내었으며, 아울러 생체의 면역계가 다른 생체기관들과 상호 유기적으로 연관되어 있음을 고려할 때 초석잠 추출물이 면역반응 조절자(immuno response modifier)로서의 작용 가능성도 고려된다(15).
초석잠의 항암효과 및 면역조절자로서의 기능을 알아보기 위하여 마우스를 이용하여 실험한 결과, 마우스 비장 세포의 증식반응은 항진시켰으나 YAC-1 세포주의 증식능은 억제시켰다. CD4+ T세포 및 CD8* T세포의 비율이 정상대조군 마우스의 그것에 비하여 증가하였으나 CD47CD8* 비는 차이가 없었으며 비장세포에서 IL-2수용체의 발현이 항진되었다.
후속연구
이는 T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-Y 그리고 본 실험 결과 항진되었던 TNF-α와 NO 외에도 복강대식 세포로부터의 IL-12, IL-15 등의 생산을 항진시켜 이에 의한 대식세포를 비롯한 면역계의 효과 세포들의 기능이 항진된 결과로 생각된다(18). 본 연구 결과 초석잠 추출물을 이용한 항암제 또는 면역기능의 강화를 위한 면역반응 보조제로서의 개발 가능성이 기대되며 이를 기본 자료로 하여 이러한 기작들에 관한 연구가 앞으로 수행되어야 할 것이다.
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