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문제 정의
- 따라서 본 연구는 체외에서 소난포란 유래의 양질의 배반포를 생산하는데 있어서 외인성 고정질소원인 아미노산과 혈청의 첨가가 배반포의 생산에 어떠한 영향을 미치는지를 검토하고 자본 실험을 실시하였다.
- 본 연구는 체외에서 소난포란유래의 배반포 생산에 있어서 배지 내에 첨가하는 외인성 고정질소원으로써 아미노산과 FBS의 첨가 효과를 검토하였다. 소난포란의 체외성숙은 TCM-199용액, 체외수정은 Fer-TALP용액으로 행하였으며, 체외수정 후 24시간째(day 1)의 수정난자를 체외 배양에 제공하였다.
제안 방법
- 한우의 동결 정액을 사용하였다. 1~2개의 동결 straw를 공기 중에서 10초간 방치한 후, 37℃ 의 항온수조에서 30초간 침적함으로써 융해를 실시하였다. 융해된 정액은 3ml의 80% percoll(Sigma, P-1644)용액 상층에 조용히 첨가한 후 2000 rpm에서 20분간 원심분리하여pellet을 회수하여 4ml의정자처리용 용액으로 희석하고, 1000 rpm에서 10 분간 원심분리한 후 최종 정자농도가 1.
- 기본적인 체외 배양법은 10/zl 배지를 이용한 단순. 미소적 배양법 (20~25개 난자/배지)으로 행하였으며 (박 등,2000), day 1은 20% hFF 첨가 YS용액으로, day 3과 day 5에 각각 다른 첨가물이 함유된 배지로 교환하여 배양하면서 배반 포 또는 부화배로의 배발달율을 조사하였다.
- 수정난자를 day 1에 20% hFF와 필수. 비 필수아미노산군 첨가 YS용액으로 배양하면서 day 3, day 4, day 5에 10% hFF와 비필수아미노산 군만을 첨가한 YS용액으로 교환하였다.
- 선별된 난포란을 TCM-199용액으로 2회 정도 세척한 후, 35 mm의 plastic petri dish(Falcon, 3001) 에 mineral oil(Sigma, M-8410 )로 피복되어져 있는 50μ1의 TCM-199용액으로 15~20개씩의 난 포란을 넣어, 39℃ 5% CO2 배양기 에 22~24시간 배양함으로써 난포란의 체외 성숙을 유도하였다.
- 소난포란의 체외성숙은 TCM-199용액, 체외수정은 Fer-TALP용액으로 행하였으며, 체외수정 후 24시간째(day 1)의 수정난자를 체외 배양에 제공하였다. 체외 배양용 기초배지는 YS용액, 기초배양법은 25개 난자/10㎕ 배지의 단순.
- 수정난자를 day 1은 20% hFF와 비필수 아미노 산군 첨가YS용액으로, day 3은 10% hFF와 필수아미노산 군을 첨가하여 배양하면서 day 3, day 4, day 5에 각각 10% FBS 를 첨가하였다.
- 9% 생리식염수가 들어있는 25 ~3O'C의 보온병에 담아 4시간 이내 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 생리식염수로 여러 번 세척하여 이물질을 제거한 후 18gauge의 주사침이 부착된 1회용 10ml의 주사기를 이용하여 직경 2~ 5mm의 가시난포로부터 난포액을 흡입함으로써난포란을 회수하였다. 이렇게 회수한 난포란을 HEPES-TALP용액으로 세척한 후, 40× ~ 80× 의 실체현미경 하에서 난구세포가 2~3겹으로 싸여져있으며, 세포질이 균일하고 색상이 양호한 것(Wiemer 등, 1991)만을 선별하여 체외성숙에 이용하였다.
- 체외수정 후 22~24시간째에 실체현미경하에서저) 2극체 존재의 유무와 관계없이 형태적으로 정상적인 수정란을 회수하여 체외 배양용 배지로 세척한 후 체외배양하였다(day 1).기본적인 체외 배양법은 10/zl 배지를 이용한 단순.
- 세척한 후 체외수정에 제공하였다. 체외수정은 35 mm plastic petri dish에 mineral oil로 피복되어져 있는 46“1의 Fer-TALP용액에 15개씩의 난포란을 넣고, 10/zg/ml heparin(Sigma, H-3149)용액 2μ1와 체외수정용 정액 2μ1을 첨가하여 39℃, 5% CO2 배양기에서 22~24시간 배양함으로써 체외수정을 유도하였다.
- 교환은행 하지 않았다. 한편 수정난자를 day 1 에 20% hFF와 비필수 아미노산군 첨가 YS용액으로 배양하면서, day 1, day 3, day 5에 각각 필수 아미노산군을 첨가하였다.
- 체외성숙된 난포란의 체외수정용 배지는 6mg/ml BSA(Sigma, A-6003)가 첨가된 TALP(Fer -TALP)용액이며, 정자 처리용 배지는 3mg/ml BSA (Sigma, A-6003) 첨가TALP용액을 사용하였다. 한편 체외수정된 배의 체외 배양용 기초배지는 인간의 불임 극복을 위하여 제조된 용액으로서 이ucose와 phosphate가 함유되지 않은 MEM 수준의 10ml/ I nonessential amino acids 그룹 고* 10ml/ I vitamins 그룹 및 5ml/ I RPMI 1640 수준의 essential amino acids 그룹이 첨가 된 YS(허 등, 1996) 용액을 사용하였고, 배발달단계에 따라 human follicle fluid(hFF)를 10% 또는 20%를 첨가하였다. 이렇게 제조된 각각의 배양액은 0.
대상 데이터
- 미성숙 난포란의 회수용 배지는 10mM HEPES와 3mg/ml bovine serum albumin(BSA: Sigma, A-9647)이 첨가된 TALP (HEPES-TALP) 용액을 이용하였고, 체외 성숙용 배지는 25mM HEPES 함유 TCM 199(Gibco, 12340-030) 용액에 0.22mg/ml pyruvate(Sigma, P-2256), 1 μg/ml follicle stimulating hormone(FSH: Vetrepharm, DIN 00867357), 56℃에서 35분간 처리한 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco, 26140-079) 을 첨가한 용액을 이용하였다. 체외성숙된 난포란의 체외수정용 배지는 6mg/ml BSA(Sigma, A-6003)가 첨가된 TALP(Fer -TALP)용액이며, 정자 처리용 배지는 3mg/ml BSA (Sigma, A-6003) 첨가TALP용액을 사용하였다.
- 본 실험에 공시된 난포란은 울산시 울주군 소재의 화신산업과 경남 김해시 주촌면 소재의 태강산업이라는 각각의 도축장에서 도살된 한우의 난소를 수집하여, 25mg/ml gentamycin(Gibco, 15750 -011)이 함유된 0.9% 생리식염수가 들어있는 25 ~3O'C의 보온병에 담아 4시간 이내 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 생리식염수로 여러 번 세척하여 이물질을 제거한 후 18gauge의 주사침이 부착된 1회용 10ml의 주사기를 이용하여 직경 2~ 5mm의 가시난포로부터 난포액을 흡입함으로써난포란을 회수하였다.
- 수정난자를 day 1에 20% hFF와 비필수 아미노산 군만을 첨가한 YS용액으로 배양하였으며, 배양액 교환은행 하지 않았다.
- 운반된 난소는 생리식염수로 여러 번 세척하여 이물질을 제거한 후 18gauge의 주사침이 부착된 1회용 10ml의 주사기를 이용하여 직경 2~ 5mm의 가시난포로부터 난포액을 흡입함으로써난포란을 회수하였다. 이렇게 회수한 난포란을 HEPES-TALP용액으로 세척한 후, 40× ~ 80× 의 실체현미경 하에서 난구세포가 2~3겹으로 싸여져있으며, 세포질이 균일하고 색상이 양호한 것(Wiemer 등, 1991)만을 선별하여 체외성숙에 이용하였다.
- 22mg/ml pyruvate(Sigma, P-2256), 1 μg/ml follicle stimulating hormone(FSH: Vetrepharm, DIN 00867357), 56℃에서 35분간 처리한 10% fetal bovine serum (FBS: Gibco, 26140-079) 을 첨가한 용액을 이용하였다. 체외성숙된 난포란의 체외수정용 배지는 6mg/ml BSA(Sigma, A-6003)가 첨가된 TALP(Fer -TALP)용액이며, 정자 처리용 배지는 3mg/ml BSA (Sigma, A-6003) 첨가TALP용액을 사용하였다. 한편 체외수정된 배의 체외 배양용 기초배지는 인간의 불임 극복을 위하여 제조된 용액으로서 이ucose와 phosphate가 함유되지 않은 MEM 수준의 10ml/ I nonessential amino acids 그룹 고* 10ml/ I vitamins 그룹 및 5ml/ I RPMI 1640 수준의 essential amino acids 그룹이 첨가 된 YS(허 등, 1996) 용액을 사용하였고, 배발달단계에 따라 human follicle fluid(hFF)를 10% 또는 20%를 첨가하였다.
- 체외수정에 사용된 축협에서 제공되는 인공수정용 한우의 동결 정액을 사용하였다. 1~2개의 동결 straw를 공기 중에서 10초간 방치한 후, 37℃ 의 항온수조에서 30초간 침적함으로써 융해를 실시하였다.
데이터처리
- 본 연구의 실험 결과의 통계학적 분석은 %2-test 를 이용하여 실시하였다.
이론/모형
- 체외 배양용 기초배지는 YS용액, 기초배양법은 25개 난자/10㎕ 배지의 단순. 미소적배양법을 이용하였다. 본 연구의 결과를 요약하면 다음과 같다.
성능/효과
- 1.체외 수정란의 배양에 있어서 비필수 아미노산(MEM 유래) 첨가가 무첨가군보다 높은 배반포 발달율을 나타냈다.
- 2.체외 수정란의 배양에 있어서 필수 아미노산 (RPMI 1640 유래) 첨가가 무첨가군보다 유의하게 높은 배반포발 달율을 나타냈다.(P<0.
- 3. Day 1에 비필수 아미노산, day 5에 필수 아미노산을 첨가하였을 경우 부화 배반포로의 발생율 및 배반포로의 부화율을 향상시켰다.
- 5. FBS의 첨가 시기는 배양 후기(day 5)에 첨가할수록 배반포율 또는 부화 배반포율이 유의하게 상승하였다 (p<0.05).
- Day 1, day 3, day 5에 필수 아미노산을 첨가하였을 때 배반포로의 발달율은 각각 22.6%, 32.4%, 34.4 %로서 5일째에 필수 아미노산을 첨가한 군에서 가장 높은 배발달율을 나타냈으나 각 군 간의 유의 차는 없었다. 또한 부화 배반포로의 배발달율은 각각 8.
- 필수 아미노산군 첨가하여 배양하면서 각각의 날짜에 따라 10%의 FBS를첨가하였을 때 배발달율에 대한 결과가 Table 5 나타나 있다. Day 3, day 4, day 5에 FBS를 첨가하였을 때 배반포로의 발달율은 각각 19.8%, 29.7%, 43.8%로서 day 5일째에 첨가하였을 때 가장 높았으며, day 3일째에 첨가군보다는 유의하게 높았다 (p<0.05). 또한 부화 배반포로의 배발달율도 각각 3.
- 05). 또한 부화 배반포로의 배발달율도 각각 3.1%, 4.1%, 15.6%로 day 5일째의 FBS 첨가 군이 다른 군보다 유의하게 높았다 (p<0.05). 한편 배반포의 부화율은 각각 15.
- 4 %로서 5일째에 필수 아미노산을 첨가한 군에서 가장 높은 배발달율을 나타냈으나 각 군 간의 유의 차는 없었다. 또한 부화 배반포로의 배발달율은 각각 8.6%, 10.6%, 13.3%로서 역시 5일째 첨가한 군에서 가장 높았으나, 각 구간의 유의차는 없었고 배반포로부터 부화배까지 발달율도 각각 38.1 %, 32.6%, 38.7%로서 각군간의 유의차는 없었다.
- 이상의 결과에서 소난포란 유래 배반포의 체외생산에 있어서 배지에 첨가하는 외인성 고정 질소원들의 첨가에 있어서 첨가시기 및 농도를 조절함으로써 양질의 배반 포 생산을 향상시킬 수 있는 것으로 사료된다.
- Day 1에 비필수. 필수 아미노산을 첨가한 후 day 3, day 4, day 5에 각각 필수 아미노산만을 배지로부터 제거시 배반포의 부화율은 현저하게 낮았다.
후속연구
- 이상의 것을 종합한다면 소난포란 유래 배반포의 체외생산에 있어서 배지에 첨가하는 외인 성 고정 질소원으로서의 아미노산의 종류, 첨가시기, 첨가농도와 더불어 혈청의 첨가 시기와 농도를 재검토함으로써 배반포의 생산율을 향상시킬 수 있으며, 또한 양질의 품질을 지닌 배반포를 생산할 수 있다고 사료된다
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