[논문]Fetal Bovine Serum을 포함한 세포 배양액에 담근 Indium Tin Oxide 전극 계면의 전기화학적 특성

최원석; 조성보

doi:10.9718/jber.2013.34.1.34

Fetal Bovine Serum을 포함한 세포 배양액에 담근 Indium Tin Oxide 전극 계면의 전기화학적 특성
Electrochemical Properties of Indium Tin Oxide Electrodes Immersed in a Cell Culture Medium with Fetal Bovine Serum 원문보기

Journal of biomedical engineering research : the official journal of the Korean Society of Medical & Biological Engineering, v.34 no.1, 2013년, pp.34 - 39

최원석 (가천대학교 보건과학대학 의공학과) , 조성보 (가천대학교 보건과학대학 의공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

For the biocompatibility test of implantable devices or for the sensitivity evaluation of biomedical sensors, it is required to understand the mechanism of the protein adsorption and the interaction between the adsorbed proteins and cells. In this study, the adsorption of proteins in a cell culture medium with fetal bovine serum onto an indium tin-oxide electrode was characterized by using linear sweep voltammetry and impedance spectroscopy. We immersed the fabricated ITO electrodes in the culture medium for 30, 60, or 90 min, and then measured the electrochemical properties of electrodes with 10 mM $Fe(CN){_6}^{3-/4-}$ and 0.1 M KCl electrolyte. With an increase of contacting time, the anodic peak current was decreased and the charge transfer resistance was increased. However, both parameters were recovered to the values before contact with the medium after the treatment of Trypsin/Ethylenediaminetetraacetic acid hydrolyzing proteins.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 논문에서는 기존 연구에 주로 사용된 Titanium 및 Molybdenum계열 합금, Platinum, Au 전극 보다 광 투과성이 우수한 Indium Tin Oxide (ITO) 도전체를 이용하여 FBS를 포함한 세포 배양액 접촉에 따른 ITO 전극 계면의 전기화학적 특성 변화를 측정하고자 한다. ITO 전극 면에 흡착된 단백질 성분들이 세포의 흡착과 성장, 분열 및 분화 특성에 미치는 영향과 이에 따른 세포 형태의 변화를 광학 및 전기적으로 분석하는 것을 최종 연구 목적으로 삼고, 이를 위한 과정으로 본 연구를 수행하고자 한다.
본 논문에서는 기존 연구에 주로 사용된 Titanium 및 Molybdenum계열 합금, Platinum, Au 전극 보다 광 투과성이 우수한 Indium Tin Oxide (ITO) 도전체를 이용하여 FBS를 포함한 세포 배양액 접촉에 따른 ITO 전극 계면의 전기화학적 특성 변화를 측정하고자 한다. ITO 전극 면에 흡착된 단백질 성분들이 세포의 흡착과 성장, 분열 및 분화 특성에 미치는 영향과 이에 따른 세포 형태의 변화를 광학 및 전기적으로 분석하는 것을 최종 연구 목적으로 삼고, 이를 위한 과정으로 본 연구를 수행하고자 한다.

가설 설정

투명 전극 중 하나인 ITO 전극 면에 혈청이 포함된 세포 배양액이 접촉할 때 배양액 내 단백질들이 전극 계면에 흡착될 것이라 가정하고 배양액 접촉에 따른 전극의 전기화학적 특성 변화를 선형훑음전압전류(Linear sweep voltammetry) 및 전기 임피던스 측정법을 이용해 분석하였다. 제작한 ITO 전극의 전기화학적 특성은 가역적인 Fe(CN) ₆^3−/4− 계에서 이론적인 peak 전류와 주사속도의 관계를 만족하였다.

제안 방법

ITO 전극 면에 단백질 흡착 유무를 판단하는 비교 실험으로 단백질간 결합을 끊고 단백질들을 가수분해하는 Trypsin/ Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) × 10 용액을 전극 면에 접촉시킨 후 선형훑음전압전류와 전기 임피던스를 상기와 같은 조건으로 측정하였다.
Pattern된 ITO 도전체 상에 절연층을 형성하기 위해 2.8 × 1014 Ωm 의 저항비를 갖는 negative 감광액을(SU-8 2002, Microchem, Newton, USA) 약 2 µm 두께로 spin coating하였다.
Slide glass (75 mm × 25 mm × 1.1 mm) 표면에 ITO를 두께 460 nm로 증착한 후, 광섬유 laser 가공 시스템을(µ-Fab, KORTherm Science, 부평) 사용하여 작동전극, 보조 전극, 각 전극에 연결된 전송선과 전송선 끝 단자를 제외한 나머지 부분의 ITO 도전체를 제거하였다.
69 × 10⁵n^3/2AD^1/2v^1/2c(n: 이동 전자 수, A: 전극 면적(cm²), D:확산 계수(cm²s⁻¹), v: 주사속도(Vs⁻¹), c: bulk 이온 농도 (mol cm⁻³))로 peak 전류는 주사속도의 제곱근에 비례한다 [16,30]. 다양한 주사속도로 측정한 선형훑음전압전류 곡선들로부터 산화 peak 전류를 추출한 뒤 이론적인 값과 비교하여 ITO 전극이 제대로 제작되었는지 평가하였다.
단백질은 양쪽성 고분자전해질로 단백질의 흡착 경향은 단백질 표면에 존재하는 곁사슬의 특성 때문이라 여겨지는데 특히 흡착되는 면의 전하와 반대 극성으로 하전된 아미노산 곁사슬 사이에 강력한 정전기적 인력이 작용하는 것으로 알려져 있다[8,9]. 단백질 흡착과 관련한 응용 연구로 콘택트렌즈 표면에 단백질 흡착에 따라 저하될 수 있는 투명도와 산소투과성 문제 해결을 위해 렌즈용 공중합체 재료를 다양한 성분비로 제작한 뒤 표면에 흡착되는 단백질량을 최소화 하는 공중합체 성분비를 찾거나[10], 생체 이식 재료로 사용되는 Titanium 및 Molybdenum 계열 합금의 체내 안전성을 평가하기 위해 금속을 FBS가 포함된 황산나트륨 용액에 담그고 장기간 전기 임피던스 측정을 통해 금속 면의 부식 정도를 측정한다[11,12]. 또한 생체조직공학을 이용한 피부상처조직의 재생을 위해 다공성 구조의 고분자 표면에 세포 점착 및 증식을 유도하고 항바이러스, 항박테리아 및 항응고에 효과적인 glucan 처리[13] 및 신경세포 네트워크 연구에서 신경전달물질 또는 신약후보물질 주입 후 신경세포들의 반응으로서 전기생리신호를 측정하기 위한 신경 세포 패터닝[14] 등은 표면에 단백질 흡착 여부 판단 및 농도 분석이 선행된다.
1 M KCl 용액을 chamber에 넣고 주사속도 50 mV/s로 선형훑음전압전류 곡선을 측정하였다. 또한 주파수 10 mHz 에서 10 kHz까지 전기 임피던스를 측정한 뒤 설계한 전기 등가회로 model과 fitting 분석을 통해 등가회로 model의 각 회로 변수들을 추출하였다. ITO 전극 면에 단백질 흡착 유무를 판단하는 비교 실험으로 단백질간 결합을 끊고 단백질들을 가수분해하는 Trypsin/ Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) × 10 용액을 전극 면에 접촉시킨 후 선형훑음전압전류와 전기 임피던스를 상기와 같은 조건으로 측정하였다.
상기 평가 후 검증된 ITO 전극 칩에 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM)을 넣고 해당 전극 칩을 5% CO2 , 36.5℃의 배양기(VS-9160C, Vision Scientific, 부천) 내에 일정 시간 동안 보존하였다.
5℃의 배양기(VS-9160C, Vision Scientific, 부천) 내에 일정 시간 동안 보존하였다. 이후 배양액을 제거한 뒤 Phosphate buffered saline 용액으로 전극 면을 씻은 후 10mM K ₄Fe(CN)₆과 0.1 M KCl 용액을 chamber에 넣고 주사속도 50 mV/s로 선형훑음전압전류 곡선을 측정하였다. 또한 주파수 10 mHz 에서 10 kHz까지 전기 임피던스를 측정한 뒤 설계한 전기 등가회로 model과 fitting 분석을 통해 등가회로 model의 각 회로 변수들을 추출하였다.
이후 작동전극 상에서 반경 200 µm의 원형과 작동전극보다 상대적으로 큰 면적의 보조 전극 및 전송선 끝 단자가 노출되도록 mask와 mask aligner로(MDA-400M, Midas System, 대전) 365 nm 파장의 UV로 노광한 뒤 노출되지 않은 영역을 현상액을(SU-8 Developer, Microchem, Newton, USA) 이용하여 제거하였다.
이후 작동전극 상에서 반경 200 µm의 원형과 작동전극보다 상대적으로 큰 면적의 보조 전극 및 전송선 끝 단자가 노출되도록 mask와 mask aligner로(MDA-400M, Midas System, 대전) 365 nm 파장의 UV로 노광한 뒤 노출되지 않은 영역을 현상액을(SU-8 Developer, Microchem, Newton, USA) 이용하여 제거하였다. 작동전극과 보조전극 상에서 배양액을 보존 할 수 있도록 polystyrene 재질의 chamber를 ITO 전극 및 절연층 기판 위에 silicone epoxy를 이용하여 붙였다.
100 mHz와 10 Hz 사이에서 위상은 배양액 접촉전 또는 Trypsin/EDTA 처리 후 측정한 값들에 비해 0도에 가까웠고 따라서 해당 주파수 구간에서 임피던스 크기의 증가가 임피던스 실수부 또는 저항 성분에 영향을 받은 것으로 나타났다. 전극 계면의 전기적 등가회로 model은 nonfaradaic 전류 경로를 따라 전극 계면에서 전하 이중층의 capacitance (C _dl) 성분과 faradaic 전류에 의한 전하이동저항(charge transfer resistance) R_ct, 전해질 이온의 확산에 의한 Warburg 확산(W), 그리고 용액의 저항(R_s ) 성분으로 구성하였다(그림 4a). 등가회로 model은 측정한 임피던스 스펙트럼들과 일치하였고 fitting 결과 C_dl 성분은 배양액 접촉 전 14.
전극의 산화, 환원 전압전류 및 전기 임피던스를 측정하기 위해 그림 1과 같이 작동 전극(Working electrode), 상대 전극(Counter electrode) 및 기준 전극으로(Reference electrode) 구성된 3 전극 시스템을 구성하였다. 제작한 ITO 전극의 전류-전압 특성을 평가하기 위해 ITO 전극 기판 상의 chamber 내에 Ag/AgCl 기준전극과 10 mM K₄ Fe(CN)₆가 포함된 0.
제작한 ITO 전극의 전류-전압 특성을 평가하기 위해 ITO 전극 기판 상의 chamber 내에 Ag/AgCl 기준전극과 10 mM K4 Fe(CN)6가 포함된 0.1 M KCl 용액을 넣은 후 전기화학측정기를 (CompactStat, Ivium, Eindhoven, Netherlands) 이용해 기준전극에 대한 작동전극의 전위를 −200 mV에서 800 mV까지 일정한 주사속도로 변화시키면서 작동전극과 보조 전극 사이에 흐르는 산화 전류를 기록하여 선형훑음전압전류(Linear sweep voltammetry) 곡선을 측정하였다.

성능/효과

FBS 단백질 흡착에 따른 임피던스 크기 변화는 약 100 mHz와 100 Hz 사이에서 관측되었는데 이러한 저주파수 구간에서는 전극 계면 임피던스가 전체 임피던스의 크기를 좌우한다. 100 mHz와 10 Hz 사이에서 위상은 배양액 접촉전 또는 Trypsin/EDTA 처리 후 측정한 값들에 비해 0도에 가까웠고 따라서 해당 주파수 구간에서 임피던스 크기의 증가가 임피던스 실수부 또는 저항 성분에 영향을 받은 것으로 나타났다. 전극 계면의 전기적 등가회로 model은 nonfaradaic 전류 경로를 따라 전극 계면에서 전하 이중층의 capacitance (C _dl) 성분과 faradaic 전류에 의한 전하이동저항(charge transfer resistance) R_ct, 전해질 이온의 확산에 의한 Warburg 확산(W), 그리고 용액의 저항(R_s ) 성분으로 구성하였다(그림 4a).
제작한 ITO 전극의 전기화학적 특성은 가역적인 Fe(CN) ₆^3−/4− 계에서 이론적인 peak 전류와 주사속도의 관계를 만족하였다. ITO 전극 면에 세포 배양액 접촉 시간이 증가함에 따라 산화 peak 전류는 감소하였고 전하이동저항이 증가함을 관측하였다. 이후 단백질을 가수분해하는 Trypsin/EDTA 처리 후산화 peak 전류와 전하이동저항은 배양액 접촉전의 수준으로 복귀하였으며 따라서 배양액 내 단백질의 전극 면 흡착이 전극 계면에서 전해질 이온의 산화와 전자 이동을 방해함을 알 수 있었다.
613 µA로 증가하였다. 따라서 FBS 단백질 접촉 시간에 따라 전극 면에 단백질 흡착이 증가할수록 전자 이동을 방해하여 산화 전류의 감소를 일으키는 것으로 판단된다. 유사한 현상으로 Au 전극의 경우에도 인간의 혈청 albumin 이나 면역글로불린 G의 전극 면 흡착 정도에 따라 산화 전류가 감소한 결과가 보고된바 있다[25,26].
그림 2(b)는 측정한 산화 peak 전류 값과(Measured) 다항식 y = ax^1/2 + b(x = v, y = I P , a,b = 상수)로 fitting 한 선을(Polynomial fit) 나타내는데 fitting 결과로부터 산화 peak 전류가 주사속도의 제곱근에 비례함을 알 수 있었다. 따라서 제작한 ITO 전극의 표면이잘 형성되어 있음을 확인하였다.
이상의 결과로부터 ITO 전극과 FBS를 포함한 세포 배양액의 접촉시간이 길어질수록 산화 peak 전류의 크기가 낮아지고 전하이동저항이 증가함을 확인할 수 있었다. 이는 FBS 단백질들이 작동전극 면에 달라붙을수록 전극 계면에서 전해질 이온의 산화 및 전자이동을 방해하는 것으로 여겨진다.
ITO 전극 면에 세포 배양액 접촉 시간이 증가함에 따라 산화 peak 전류는 감소하였고 전하이동저항이 증가함을 관측하였다. 이후 단백질을 가수분해하는 Trypsin/EDTA 처리 후산화 peak 전류와 전하이동저항은 배양액 접촉전의 수준으로 복귀하였으며 따라서 배양액 내 단백질의 전극 면 흡착이 전극 계면에서 전해질 이온의 산화와 전자 이동을 방해함을 알 수 있었다. 상기 연구 결과를 바탕으로 ITO 전극 면에 흡착된 단백질 성분들이 세포의 흡착과 성장, 분열및 분화 특성에 미치는 영향과 이에 따른 세포 형태의 변화를 투명 ITO 전극상에서 광학 및 전기적으로 분석할 것이다.
인가전압이 약 300~310 mV일 때 산화 peak 전류가 관측되었고 그 값은 주사속도가 10 mV/s일 때 0.925 µA, 30 mV/s일 때 1.387 µA, 60 mV/s일 때 1.797 µA, 100 mV/s 일 때 2.210µA로 주사속도가 증가할수록 산화 peak 전류도 증가하였다.
제작한 ITO 전극의 전기화학적 특성은 가역적인 Fe(CN) 63−/4− 계에서 이론적인 peak 전류와 주사속도의 관계를 만족하였다.

후속연구

혈청 내 albumin, vitronectin, laminin과 fibronectin 등의 단백질들은 세포 흡착 및 증식에 관여하고[4-6], collagen 성분들은 중간엽 성체줄기세포의 흡착과 골아 세포로의 분화에 기여하기도 한다[7]. 따라서 혈청 단백질의 흡착 기전과 흡착 정도에 대한 정량 분석은 체내 이식 형 의료 도구 및 바이오 센서 개발 시 생체적합성 평가 및 표면에 흡착된 단백질과 세포와의 상호작용 연구를 위해 필요하다.
FBS 단백질의 흡착으로 인한 전극 계면의 임피던스 변화는 주파수에 의존적이었으며 이러한 실험 결과는 특히 전기 임피던스 측정법과 ITO 전극 기반의 세포칩을 이용한 연구에[31-33] 활용될 수 있다. 또한 본 실험의 측정 결과들은 향후 다양한 단백질 흡착에 따른 전기적 특성 변화와 비교할 수 있는 기준 자료로 사용될 것으로 기대된다.
이후 단백질을 가수분해하는 Trypsin/EDTA 처리 후산화 peak 전류와 전하이동저항은 배양액 접촉전의 수준으로 복귀하였으며 따라서 배양액 내 단백질의 전극 면 흡착이 전극 계면에서 전해질 이온의 산화와 전자 이동을 방해함을 알 수 있었다. 상기 연구 결과를 바탕으로 ITO 전극 면에 흡착된 단백질 성분들이 세포의 흡착과 성장, 분열및 분화 특성에 미치는 영향과 이에 따른 세포 형태의 변화를 투명 ITO 전극상에서 광학 및 전기적으로 분석할 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	동물 세포 배양액은 어떻게 사용되는가?	동물 세포 배양액은 세포의 대사활동과 유지 및 성장을 위해 조성한 용액으로 배양액 성분과 조성에 따라 결정되는 세포의 흡착, 증식, 복제 및 분화와 같은 세포 반응과 활성을 이해하고 생체 내 조건과 유사한 세포 외 기질(extracellular matrix) 환경을 조성하기 위해 사용된다[1,2]. 일반적으로 세포 증식을 위해서 생체 내에 존재하는 호르몬, 성장인자및 단백질 등을 포함한 혈청을 배지에 추가하는데 매우 낮은 수준의 항체와 풍부한 성장인자를 갖는 fetal bovine serum (FBS) 또는 fetal calf serum이 선호된다[3].
	단백질 농도를 분석하는 방법은?	단백질 농도를 분석하는 방법으로 UV 흡광법, 형광발현및 발색 관측법, 편광해석법, 반사광측정법, 표면 플라즈몬 공명, 적외선흡수스펙트럼, 라만 산란, 원편광 이색성 분광 분석, 전반사 형광 분광법, 푸리에 변환 적외선-반사 흡수 분광법 등이 사용되나[15] 고가의 부피가 큰 광학 시스템, 흡착 표면의 개질과 형광표지인자 사용으로 인한 단백질 변성 가능성 등으로 인해 질병진단 및 신약개발 산업에서 상기 문제들을 개선할 수 있는 비표지 및 실시간 분석기술의 수요가 증가하고 있다. 그러한 대체 방법 중 하나로 나노 및 미세 전극을 이용한 전기화학적 분석법이 있는데, 이는 전극 표면에 흡착된 물질의 종류 및 농도에 따라 결정되는 산화, 환원 전압전류 곡선의 형태를 측정하거나 전극 계면 임피던스를 측정하여 흡착되는 물질의 농도 및 변화를 비표지 및 실시간으로 관측하는 방법이다[16].
	혈청 단백질의 흡착 기전과 흡착 정도에 대한 정량 분석은 체내 이식 형 의료 도구 및바이오 센서 개발 시 생체적합성 평가 및 표면에 흡착된 단백질과 세포와의 상호작용 연구를 위해 필요한 이유는?	일반적으로 세포 증식을 위해서 생체 내에 존재하는 호르몬, 성장인자및 단백질 등을 포함한 혈청을 배지에 추가하는데 매우 낮은 수준의 항체와 풍부한 성장인자를 갖는 fetal bovine serum (FBS) 또는 fetal calf serum이 선호된다[3]. 혈청내 albumin, vitronectin, laminin과 fibronectin 등의 단백질들은 세포 흡착 및 증식에 관여하고[4-6], collagen 성분들은 중간엽 성체줄기세포의 흡착과 골아 세포로의 분화에 기여하기도 한다[7]. 따라서 혈청 단백질의 흡착 기전과 흡착 정도에 대한 정량 분석은 체내 이식 형 의료 도구 및바이오 센서 개발 시 생체적합성 평가 및 표면에 흡착된 단백질과 세포와의 상호작용 연구를 위해 필요하다.

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동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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