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문제 정의
- 그러나 이러한 세포자연사가 황체세포에 존재하는 GnRH 수용체에 직접 작용해서 일어나는 것인지 대한 증거는 부족한 상태이다. 따라서 본 실험에서는 GnRH가 황체에 미치는 직접적인 세포자연사 유발 효과를 증명하기 위하여 임신된 흰쥐의 황체세포에 GnRH-Ag를 처리한 후 세포의 변화를 관찰하였다.
- 따라서 본 연구의 목적은 임신된 흰쥐에서 획득한 황체를 이용하여 먼저 GnRH와 그 수용체가 발현하는지를 조사한 다음 배양된 황체세포에 GnRH-Ag를 처리한 후 세포 자연사가 일어나는지를 확인하고, 세포자연사가 일어난 황체 세포에서 cytochrome c 방출 여부를 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 1:200으로 희석시킨 rabbit polyclonal anti-rat GnRH 와 GnRH 수용체 일차항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 이용하여 I시간동안 상온에서 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. FITC가 결합되어 있는 anti-rabbit IgG 이차항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
- )를 이용하여 I시간동안 상온에서 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. FITC가 결합되어 있는 anti-rabbit IgG 이차항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.)를가지고 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 증류수로 세척 하고 봉입하였다. GnRH와 GnRH 수용체의 발현은 confocal scanning image analysis system(Fluro View, FV300; Olympus Optical Co.
- GnRH-Ag에 의해 유발된 황체세포의 세포자연사를 확인하는 다른 방법으로 DNA 분절화 양상을 조사하였다(Fig. 4A). TUNEL 결과와 동일하게 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 처리 군(3.
- GnRH가 직접적으로 황체세포의 세포자연사를 유발시킬수 있는지를 알아보기 위하여 배양된 황체세포에 GnRH-Ag 를 처리한 후 TUNEL 방법을 이용하여 조사하였다. 세포 자연사가 일어난 세포들에서 녹색 형광으로 염색됨을 관찰할 수 있었고, PI로 핵을 이 중 염색을 했을 경우 두 색이 합쳐져 노란색을 보임을 알 수 있었다.
- )를가지고 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 증류수로 세척 하고 봉입하였다. GnRH와 GnRH 수용체의 발현은 confocal scanning image analysis system(Fluro View, FV300; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
- DNA는 다시 14, 000xg에서 20분간 원심분리한 후 ethanol로 침전시켰다. Labeled DNA는 40mM Tris-acetate와 ImM EDTA buffer0)] 담겨있는 2% agarose 젤에서 3시간 30분 동안 전기영동(60 volts)을 시행하였다. 젤에서 완전히 물을 제거한 후 Kodak X-Omat films에노출시켜 DNA 분절화 양상을 확인하였다.
- 1% Tween-20) 용액 에 1시간 동안 담가 비특이 적 결합을 방지 하기 위한 blocking을 수행하였다. Membranee rabbit polyclonal anti-rat GnRH receptor(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.) 일차항체가 1:1, 000으로 희석된 TTBS에서 1시간 동안 반응시켰다. TTBS 로 1분씩 3회 세척 후 이차항체인 anti-rabbit horseradish peroxidase- conjugated antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
- ) 일차항체가 1:1, 000으로 희석된 TTBS에서 1시간 동안 반응시켰다. TTBS 로 1분씩 3회 세척 후 이차항체인 anti-rabbit horseradish peroxidase- conjugated antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 TTBS에 1:1,000으로 희석시킨 후 40분동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 membranee chemiluminescence 용액 (ECL kit; Amersham life science, Buckinghamshire, UK.
- 세포자연사 정도를 정량하기 위하여 임의적으로 선택된 200 배율 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 700~1,000 개의 세포를 세었다. 그 중 TUNEL에 의해 녹색 형광으로 염색된 세포 수와 “로 염색된 전체 세포 수를 비율로 계산하여 세포자연사 정도를 분석하였다.
- 1mM phenylmethyl-sulfonylfluoride, 5 /zg/ml aprotinin, and 5 " g/ml leupeptin)이 포함된 균질화 용액에서 분쇄한 후 12, 000xg에서 30분간 원심분리하였다. 단백질의 농도는 DC protein assay kit(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, U.S.A.)를이용하여 측정한 후 동일한 양을 10% SDS-PAGE에서 전기영동을 시행하였다. 전기영동에 의해 분리된 단백질들은 blotting 방법으로 nitrocellulose membrane으로 옮기고, 5% non-fat dry milk가 포함된 Tris-buflered saline(TTBS; 10 mM Tris(pH 7.
- 0)에 용해시킨 후 I“1의 DNase- free RNase(500 n g/ml; Boehringer-Mannheim, Roche Disno- sties GmbH, Mannheim, Germany)를 첨가하고 60분 동안 37℃ 에서 방치하였다. 동량의 phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1, V:V:V)를 첨가하여 DNA를 추출하였으며, 다시 동량의 chloroform : isoamyl alcohol(24:l, V:V)로 재 추출하였다. 상층액을 모아서 0.
- 젤에서 완전히 물을 제거한 후 Kodak X-Omat films에노출시켜 DNA 분절화 양상을 확인하였다. 또한 15kb 이하의 DNA fi:actiori들을 젤에서 자른 후 10ml scintillation fluid를 넣어 Gounter로 방사선 방출량을 측정하였다';
- EDTA로 처리된 황체들은 200Xg에서 15분간 원심분리한 후 EDTA 용액을 HBSS로 교환하였다. 마지 막으로 pasteur pipet을 이용하여 아직 단일 세포로 분리되지 않은 황체 조직을 위 아래로 pipeting하면서 단일 세포로 만들었다. 이렇게 만들어진 단일 황체세포는 200Xg에서 15분간 원심분리한 후 25mM HEPES buffer, penicillin 100IU, streptomycin 100"g/ml, gentamicin 50 "g/ml, 10% fetal bovine serum이 포함된 Medium 199로 옮겼다.
- )를이용하여 배 양하였으며, well 당 세포 수는 5 ¥ IO。개로 하였다. 배양은 37℃에서 95% 공기와 5% CO2가 공급되고 100% 습도가 유지되는 배양기 내에서 수행하였으며 배양된 황체 세포는 GnRH-Ag 처리 후 4, 8, 12시간에 획득하였다. 황체 세포의 Western blot 분석을 위해 급속 냉동 후 -70℃에 보관하였고 일부는 면역조직화학적 염색을 위해 4% paraformaldehyde 용액에 고정하였다.
- 증류수로 세척한 후 propidium iodide(PI)로 핵을 2차 염색하고 형 광현 미 경 하에서 검 경 하여 황체 세포의 세 포자 연사를 조사하였다. 세포자연사 정도를 정량하기 위하여 임의적으로 선택된 200 배율 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 700~1,000 개의 세포를 세었다. 그 중 TUNEL에 의해 녹색 형광으로 염색된 세포 수와 “로 염색된 전체 세포 수를 비율로 계산하여 세포자연사 정도를 분석하였다.
- 035M potassium acetate 를 넣고 시료를 잘 섞은 후 60분간 단백질이 가라앉도록 얼음에 방치하였다. 시료는 4℃, 5000xg에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 미량원심분리 시험관으로 옮기고 동량의 phenol : chloroform : isoamyl alcohol(25:24:l, V:V:V)을 첨가하여 DNA를 추출하였으며, 다시 동량의 chloroform : isoamyl alcohol(24:l, V:V)로 재추출하였다. 상층액을 미량 원심 분리 시험관에 옮기고 0℃ 에서 보관한 2.
- 공급되는 동물실험실에서 사육하였다. 임신된 흰쥐로부터 황체를 획득하기 위하여 먼저 흰쥐를 마취시킨 후 복부를 절개하여 양쪽 난소를 적출하였다. 획득된 난소로부터 분리된 황체들은 sodium bicarbonate가 포함된 Medium 199 (Gibco BRL, Life Technologies, Inc.
- )를이용하여 측정한 후 동일한 양을 10% SDS-PAGE에서 전기영동을 시행하였다. 전기영동에 의해 분리된 단백질들은 blotting 방법으로 nitrocellulose membrane으로 옮기고, 5% non-fat dry milk가 포함된 Tris-buflered saline(TTBS; 10 mM Tris(pH 7.6), 150mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액 에 1시간 동안 담가 비특이 적 결합을 방지 하기 위한 blocking을 수행하였다. Membranee rabbit polyclonal anti-rat GnRH receptor(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
- Labeled DNA는 40mM Tris-acetate와 ImM EDTA buffer0)] 담겨있는 2% agarose 젤에서 3시간 30분 동안 전기영동(60 volts)을 시행하였다. 젤에서 완전히 물을 제거한 후 Kodak X-Omat films에노출시켜 DNA 분절화 양상을 확인하였다. 또한 15kb 이하의 DNA fi:actiori들을 젤에서 자른 후 10ml scintillation fluid를 넣어 Gounter로 방사선 방출량을 측정하였다'
- 반응을 중단시키기 위하여 stop buffer를 상온에서 10분간 처리한 후 Tris buffer로 3번 세척한 다음 anti-digoxigenin-FITC로 37℃ 에서 30분간 반응시 켰다. 증류수로 세척한 후 propidium iodide(PI)로 핵을 2차 염색하고 형 광현 미 경 하에서 검 경 하여 황체 세포의 세 포자 연사를 조사하였다. 세포자연사 정도를 정량하기 위하여 임의적으로 선택된 200 배율 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 700~1,000 개의 세포를 세었다.
- 3A). 황체세포에서 세포자연자가 일어난 정도를 정량화하기 위하여 염색된 세포를 계수하여 비율을 계산하였다. GnRH-Ag처리 후 12시간에 대조군(22.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 임신 8일령의 Sprague-Dawley 흰쥐들은 14시간 명주기와 10시간 암주기가 조절되고 충분한 사료와 물이 공급되는 동물실험실에서 사육하였다. 임신된 흰쥐로부터 황체를 획득하기 위하여 먼저 흰쥐를 마취시킨 후 복부를 절개하여 양쪽 난소를 적출하였다.
- 황체들은 가위를 이용하여 작은 조각으로 자른 다음 세포 분리용 배 양액 이 들어있는 작은 삼각플라스크에 옮겼다. 세포 분리용 배양액으로는 calcium과 magnesium0] 포함되어 있지 않고, 0.1% BSA, collagenase(50 U/ml), dispase(2.4 U/ml), DNase(200 U/ml) 등이 포함된 HBSS 을 사용하였다. 작은 조각으로 잘린 황체들이 들어있는 삼각플라스크는 37℃ 가 유지 되는 항온 수조에 옮기고 30분씩 4번 흔들어 주었다.
데이터처리
- 통계학적 유의성 검정은 student's t-test 방법을 사용하였으며 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- 3. Detection of apoptotic cells in the luteal cells cultured with saline or GnRH-Ag using TUNEL assay(A). At 12h after saline(a) or GnRH-Ag(b) treatment, apoptotic cells were detected using in situ apoptosis detection kit after fixation.
- 배양된 황체세포에서 TUNEL 방법으로 세포자연사를 확인하기 위하여 in situ apoptosis detection kit(ApopTag; Intergen, Gaithersburg, MD, U.S.A.)를 사용하였다. 황체세포가 배양된 각각의 well에 4% neutral buffered formalin을 500/zl 씩 넣어 10분간 고정 후 Tris buffer로 세척 하였다.
성능/효과
- 4A). TUNEL 결과와 동일하게 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 처리 군(3.2±0.53)에서 대조군(1.12±0.21)에 비해 DNA 분절화 정도가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다 0.05)(Fig. 4B).
- 결론적으로 본 연구 결과 GnRH와 그 수용체 단백질이 임신된 흰쥐의 배양된 황체세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 배양된 황체세포에 GnRH-Ag의 처리한 결과 직접적으로 황체세포의 세포자연사를 유도시켰으며, 이는 미토콘드리아로부터 cytochrome c의 방출을 매개로 이루어진 것으로 사료된다.
- 보이지 않았다. 그러나 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 cytochrome c 양은 미토콘드리아 분획에서는 감소한 반면, 세포질 분획에서 3배 이상 증가한 것을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 배양된 황체세포에 GnRH-Ag를 처리한 후 미토콘드리아로부터 방출되는 cytochrome c의 양을 조사하기 위하여 세포질 분획과 미토콘드리아 분획을 분리하여 Western blot을 수행한 결과, 처리 후 4시간과 8시간에서 두 분획 간에 cytochrome c의 양은 대조군 또는 GnRH-Ag 처리군 모두에서 차이를 보이지 않았다. 그러나 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 cytochrome c 양은 미토콘드리아 분획에서는 감소한 반면, 세포질 분획에서 3배 이상 증가한 것을 알 수 있었다(Fig.
- 배양된 황체세포에서 GnMI가 강하게 염색된 반면(Fig.lc), GnRH 수용체는 상대적으로 약하게 염색된 것을 알 수 있었다(Fig. If), 일차 항체를 제거한 후 동일하게 염색을 시행한 음성대조군에서는 GnRH 및 GnRH 수용체 모두 염색이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. lb, e).
- 배양된 황체세포에서 GnRH 수용체의 발현을 정확히 확인하기 위하여 Western blot 방법을 시행한 결과, 황 체세포에서 다량 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용한 뇌하수체에서 다량의 GnRH 수용체 단백질이 검출된 반면, 음성대조군으로 사용한 시상하부에서는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig.
- 세포 자연사가 일어난 세포들에서 녹색 형광으로 염색됨을 관찰할 수 있었고, PI로 핵을 이 중 염색을 했을 경우 두 색이 합쳐져 노란색을 보임을 알 수 있었다. 또한 TNEL에 의해 염색된 세포들은 대부분 세포자연사의 형태적인 특징인 응축된 모양을 보여주었다(Fig.
- 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용한 뇌하수체에서 다량의 GnRH 수용체 단백질이 검출된 반면, 음성대조군으로 사용한 시상하부에서는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- , 1999). 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, GnRH-Ag에 의한 황체세포의 자극은 세포 내 NO의 변화를 유도하면서 Bax, Bcl-xL와 Bcl-2와 같은 단백질의 발현을 조절함으로써 미토콘드리아의 막 투과성을 증가시키고, 이로 인하여 cytochrome c가 세포질 쪽으로 방출되면서 세포자연사가 일어나는 것으로 사료된다.
- 이를 위하여 본 연구에서는 먼저 배양된 황체세포에서 GnRH와 그 수용체의 발현을 확인한 결과, GnRH 수용체의 발현은 배양 후에도 그대로 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한 다른 조직과 비교해 볼 때 황체에서 다량 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 황체세포가 난소 내 다른 세포들보다 더 효과적으로 GnRH에 의해 직접적인 조절을 받을 수 있다는 것을 시사한다.
- 이러한 결과는 황체세포가 난소 내 다른 세포들보다 더 효과적으로 GnRH에 의해 직접적인 조절을 받을 수 있다는 것을 시사한다. 한편 배양된 황체 세포에서 GnRH 수용체의 발현 정도는 체내 황체조직에 비해 발현되는 양이 감소해 있는 것을 알 수 있었고, 이는 체외에서 황체세포를 배양하는 조건이 체내 환경과 비교해서 GnRH 수용체 발현을 유지시키기 위한 중요한 요소들이 결핍되어 일어난 것으로 사료된다. 이러한 임신된 흰쥐의 황체 세포에서 GnM와 그 수용체의 발현은 이미 오래 전부터 GnRH-like mRNA가 난소의 협막세포, 과립세포, 그리고 황체 등에서 발현된다는 결과를 뒷받침하는 증거라고 할 수 있다.
- 한편 본 실험 결과에서 GnRH-Ag 처리 후 황체세포 내 미토콘드리아에서 cytochrome c가 세포질 쪽으로 방출되는 것을 확인할 수 있었다. 미토콘드리아의 cytochrome c 방출은 세포 자연사가 진행되는 세포에서 일어나는 일련의 현상으로 미토콘드리아의 막 투과성을 잃어버림으로써 나타난다.
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