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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 생쥐 난소내 난자와 과립세포에서 Fas와 Fas ligand의 발현 유무를 확인하고 난포폐쇄와의 연관성을 조사하고자 하였다. RT-PCR 방법으로 Fas와 Fas ligand mRNA의 발현유무를 확인하였고, 또한 발현 부위를 알아보기 위하여 면역조직화학적 염색 방법을 시행하였다.
제안 방법
- 5분씩 3번 세척하고, anti-digoxi- genin-peroxidase로 30분간 실온에서 반응시킨 후, Tris buffer 로 5분간 3회 세척하였다. 33-diaminobenzidine (DAB)로 2분간 발색시키고 증류수로 1분씩 3회 세척하고, Mayer's hema- toxiline으로 2분간 대조염색을 실시하였다. 증류수로 세척한 뒤, 100% 에탄올에 탈수하였으며, 자일렌으로 투명화시켜 Canada balsam으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다.
- 마지막으로 72℃에서 10 분간 postelon- gation시켜 충분히 PCR 산물을 얻어내어 전기영동 전까지 4℃에 보관하였다. B-actin으로 RNA 추출을 확인한 cDNA를 사용하여, B-actin에서의 혼합물을 기준으로 Fas 실험용 시료에는 Fas 3'-, 5'- primer를, Fas ligand 실험용 시료에는 Fas ligand 3'-, 5'- primer> 넣었다, Taq polymerasee- Ex Taq poly- merase(Takara Co., Corebiosystem, Seoul)를 혼합하였다. Fas antigen forward primer sequence는 5-CAG ACA TGC TGT GGA TCT GG-3', reverse primer sequence는 5'-TCA CTC CAG ACA TTG TCC-3로 제조하여 사용하였다.
- PCR 반응이 끝난 후 각각의 RT-PCR 산물들 9 ug와 10 X loading dye 1 μg 를 섞어 10 μg씩 1% agarose gel에 100 V로 30 분간 전기영동하였다. Ethidium bromide로 10분간 염색한 후 Image analyser (VILBER LOURMAT, France)하에서 관찰하고 촬영하였다.
- Amino ethyl carbazol (AEC)로 2분간 발색을 시킨 다음 물에 세척하였다. Mayer's hematoxylin으로 2분간 대조 염색을 한 뒤, Crystal mount로 봉입하여 영구표본을 제작하였다.
- 25 “1, cDNA 3 “1 씩을 분주한 후, 총 25 M 가 되 도록 distilled water# 넣어 잘 섞어주었다. PCR (PERKIN ELMER 2400 PCR machine) 반응조건은 95℃에서 5분간 predenaturation하고, 95℃ 에서 30초간 denaturation, 55℃ 에서 45초간 annealing, 72℃ 에서 1분간 extention을 총 28 cycles 실시하여 증폭하였다. 마지막으로 72℃에서 10 분간 postelon- gation시켜 충분히 PCR 산물을 얻어내어 전기영동 전까지 4℃에 보관하였다.
- 이 혼합물은 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA로 만들어 PCR을 할 때까지 -20℃에 보관하였다. RNA 추출 및 역전사가 제대로 수행되었는지를 확인하기 위해서 house keeping gene으로 알려진 & -actin을 먼저 PCR로 증폭하였다. f-actin forward primer se- quence는 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3' , reverse primer sequence는 5'-GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC3을 제조하여 사용하였고, PCR 산물의 크기는 532 bp임 을 확인하였다.
- 따라서 본 실험에서는 생쥐 난소내 난자와 과립세포에서 Fas와 Fas ligand의 발현 유무를 확인하고 난포폐쇄와의 연관성을 조사하고자 하였다. RT-PCR 방법으로 Fas와 Fas ligand mRNA의 발현유무를 확인하였고, 또한 발현 부위를 알아보기 위하여 면역조직화학적 염색 방법을 시행하였다. 그리고 Fas와 Fas ligand의 발현과 난자 및 과립세포의 세포자연사간의 연관성을 알아보고자 TUNEL 염색 방법으로 세포자연사를 확인하였다.
- Total RNA를 추출하기 위해서, 0.2 ml 의 RNAzol™B(Tel- Test Inc., USA)에 들어있는 생쥐의 난소를 homogenizer로 얼음위에서 균질화시켰다. 균질화된 현탁액을 각각 microcentri- fuge tube로 0.
- Louis MO, USA) 투여 여부에 따라 2가지 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. 먼저 대조군은 생리식염수 0.2 ml을, 실험군은 5 IU PMSG를 복강에 주사하여 24시간 후 경추파괴로 도살하고, 즉시 난소와 흉선을 적출하였다. 적출한 왼쪽 난소와 흉 선은 total RNA 추출을 위해 RNAzol™B (Tel-Test Inc, USA) 에 넣어 사용전까지 -20℃에 보관하였다.
- Xu 등(1997)과 Guo 등(1997)은 난자의 Fas와 과립세포의 Fas ligand 간의 상 호작용이 난자의 세포자연사를 유발시키며, 난자의 투명대를 제거한 후 과립세포와 함께 배양하면 투명대가 Fas와 Fas ligand의 상호작용을 방해하여 세포자연사가 억제된다는 것을 증명하였다. 본 실험에서는 난자의 면역조직화학적 염색 시 Fas와 Fas ligand가 막에 결합된 단백질임을 고려하여 acidic Tyrod's solution(pH 3.0)을 사용할 경우 단백질의 변성을 야기할 수 있음을 고려하여 투명대를 가진 난자를 그대로 염색하였다. 또한 난소 염색 결과에 나타난 바와 같이 Fas와 Fas ligand가 강소형성전난포 상태인 난자의 투명대에 염색 되지 않고 강소형성난포에서 투명대에 염색되는 것으로 보아, Xu 등과 Geo 등의 결과와는 달리 Fas와 Fas ligand가 난포 의 발달단계에 따라 난자의 투명대를 통해 상호작용을 하는 것으로 사료된다.
- 생쥐 흉선과 난소내 난자 및 과립세포에서 Fas와 Fas ligand mRNA의 발현을 확인하고자 RT-PCR을 실시하였다 (Fig. 1). 먼저 난소 조직에서 Fas와 Fas ligand mRNA가 모두 발현하는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 실험에서는 생쥐 (ICR strain) 암컷을 14시간(명)/10시간 (암) 조명 조건하에서 일정기간 이상 먹이와 물을 충분히 공 급하여 실험에 사용하였다. 실험 생쥐는 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis MO, USA) 투여 여부에 따라 2가지 실험군으로 나누어 실험을 진행하였다. 먼저 대조군은 생리식염수 0.
- , Korea) 4 ug 증류수와 함께 총 15 M 가 되도록 만든 다음, 70℃에서 5분간 가열시키고 4℃에서 식혀 spindown시켜 tube의 벽면에 붙은 수분을 모았다. 이 tube에 M-MLV RT 5 x reaction buffer 5 M, 25 mM dNTP 1 M, Recombination RNasin Ribonuclease inhibitor (40 ug) 0.625 ug M-MLV RTase (200 U/yl) 1ug 와 Nuclese-free 증류수를 총 부피 25 M 가 되도록 첨가하였다. 이 혼합물은 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA로 만들어 PCR을 할 때까지 -20℃에 보관하였다.
- 33-diaminobenzidine (DAB)로 2분간 발색시키고 증류수로 1분씩 3회 세척하고, Mayer's hema- toxiline으로 2분간 대조염색을 실시하였다. 증류수로 세척한 뒤, 100% 에탄올에 탈수하였으며, 자일렌으로 투명화시켜 Canada balsam으로 봉입하여 영구표본을 제작하였다.
- 4% NBF에 고정된 난소 조직은 흐르는 물에 30분간 수세하고 알코올 탈수과정을 거쳐 자일렌에 투명시켰다. 파라핀으로 침투시켜 포매된 조직을 박편절단기를 이용하여 4 μg 두께로 박절하였다. 이 박절된 조직 절편을 Poly-L-Lysin coated 슬라이드에서 60C로 1시간 이상 열고정시켰다.
- 과립세포는 배양액으로 3회 세척한 뒤 total RNA를 추출하기 전까지 RNAzol에 넣어 - 20℃ 에 보관하였다. 획득한 난자 중 일부는 핵막이 있는 난 자 (Germinal Vesicle, GV), 핵막이 붕괴된 난자 (Germinal Vesicle Breakdown, GVBD), 퇴화된 난자, 절편화된 난자로 나누었다. 이들을 Poly-L-Lysin-coated 슬라이드에 부착시키고, 4% NBF로 고정한 후, phosphate buffered saline (PBS)로 세척 하고, 실온에서 건조시킨 후 -20℃ 에 보관하였다.
대상 데이터
- RNA 추출 및 역전사가 제대로 수행되었는지를 확인하기 위해서 house keeping gene으로 알려진 & -actin을 먼저 PCR로 증폭하였다. f-actin forward primer se- quence는 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3' , reverse primer sequence는 5'-GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC3을 제조하여 사용하였고, PCR 산물의 크기는 532 bp임 을 확인하였다. Thin wall tube에 10 X buffer 2.
- 본 실험에서는 생쥐 (ICR strain) 암컷을 14시간(명)/10시간 (암) 조명 조건하에서 일정기간 이상 먹이와 물을 충분히 공 급하여 실험에 사용하였다. 실험 생쥐는 pregnant mare's serum gonadotropin (PMSG; Sigma-Aldrich Corp.
이론/모형
- RT-PCR 방법으로 Fas와 Fas ligand mRNA의 발현유무를 확인하였고, 또한 발현 부위를 알아보기 위하여 면역조직화학적 염색 방법을 시행하였다. 그리고 Fas와 Fas ligand의 발현과 난자 및 과립세포의 세포자연사간의 연관성을 알아보고자 TUNEL 염색 방법으로 세포자연사를 확인하였다.
성능/효과
- 2G, I). Fas와 Fas ligand의 면역조직화학 염색 결과와 비교했을 때, Fas가 주로 강하게 염색된 강소형성난포내 과립세포와 난자에서 세포자 연사가 일어났음을 확인할 수 있었다.
- PMSG 처리군과 대조군에서 Fas와 Fas ligand mRNA 발현 을 조사한 결과, PMSG 처리군의 난소에서 Fas mRNA 발현 이 대조군에 비해 증가함을 나타낸 반면 Fas ligand mRNA 발 현은 두 실험군간에 차이가 없었다. 그러나 과립세포와 난자에서는 PMSG 처리와 관계없이 Fas와 Fas ligand mRNA 모두 유사한 발현 정도를 보였다.
- Sakamaki 등(1997)은 많은 양의 Fas mRNA가 림프 조직뿐만 아니라 간, 심장, 난소에서도 검출됨을 확인하였고, 특히 Fas는 난소내 과립세포와 황체세포에서만 발현되고, 난자에서는 발현되지 않는 것으로 보고하였다. 그러나 본 실험 결 과에서 Fas와 Fas ligand가 난자와 과립세포 모두에서 발현되는 것을 확인할 수 있었다. Kondo 등 (1996)은 난포의 발달 단계에 따라 Fas의 발현을 조사한 결과 정상적인 난포에서는 강소를 형성할 때까지 난자에서만 발현되다가 배란전 난포 가 되면 난자와 과립세포에서는 발현되지 않고 협막세포에서만 발현된다고 보고하였다.
- , 1994). 그러나 본 연구에서 난자의 상태에 따라서 정상적인 난자, 퇴화된 난자와 분절화된 난자로 나누어 Fas와 Fas ligand의 발현을 조사한 결과 그들 의 mRNA 및 단백질 발현 정도에는 큰 차이가 없었다. Fas와 Fas ligand의 발현 정도의 차이가 없고 Fas가 발현되 었음에도 불구하고 세포자연사가 일어나지 않은 난자가 있는 것으로 보아 난자내 Fas의 발현만으로 난자가 퇴화되어 난포폐쇄가 일어나지는 않는 것으로 사료된다.
- 대조군의 원시난포 및 강소형성전난포에서 TUNEL 양성 염색을 보이는 과립세포는 거의 관찰되지 않았으나, 강소형 성난포와 배란전 난포에서는 많은 수의 TUNEL 양성 염색을 보이는 과립세포들을 확인할 수 있었다(Fig. 2G, I). Fas와 Fas ligand의 면역조직화학 염색 결과와 비교했을 때, Fas가 주로 강하게 염색된 강소형성난포내 과립세포와 난자에서 세포자 연사가 일어났음을 확인할 수 있었다.
- 먼저 난소 조직에서 Fas와 Fas ligand mRNA가 모두 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 과립세포와 난자를 분리해서 RT-PCRi- 수행한 결과에서도 Fas와 Fas ligand가 모두 발현되는 것을 알 수 있었다. 한편, 난자의 상태에 따른 RT-PCR 결과에서도 정상인 난자와 퇴화된 난자 모두 동일하게 Fas와 Fas ligand mRNA가 증폭되는 결과를 나타냈다.
- 0)을 사용할 경우 단백질의 변성을 야기할 수 있음을 고려하여 투명대를 가진 난자를 그대로 염색하였다. 또한 난소 염색 결과에 나타난 바와 같이 Fas와 Fas ligand가 강소형성전난포 상태인 난자의 투명대에 염색 되지 않고 강소형성난포에서 투명대에 염색되는 것으로 보아, Xu 등과 Geo 등의 결과와는 달리 Fas와 Fas ligand가 난포 의 발달단계에 따라 난자의 투명대를 통해 상호작용을 하는 것으로 사료된다.
- 초기강소난포의 난자에 서는 Fas ligand가 난자 내부에 염색되었으며, 투명대에 좀 더 강하게 염색되는 결과를 얻었다. 반면 난자들만을 염색하였을 때는 성숙단계와 상태에 따라 Fas와 Fas ligand가 동일하게 투명대에 염색되는 것을 확인하였다. 이는 난자의 획득 단계에서 이미 그 난포는 성숙이 완료된 상태이므로 난소 조 직의 면역조직화학적 염색 결과 중에서 초기 강소형성난포 내 난자의 투명대 염색 결과와 일치하는 것으로 판단된다.
- 특히 강소형성전난포와 초기 강소난포의 강소 주변에 pyknotic nuclei를 보이는 과립세 포들에서 세포자연사가 일어났다. 반면에 일부 Fas와 Fas ligand의 발현을 보이는 난포에서 세포자연사가 일어나지 않는 과립세포도 존재함을 확인할 수 있었다. 한편 난자에서 Fas와 Fas ligand 발현을 관찰해본 결과, 강소형성전난포내 난자들이 Fas를 발현하지만 투명대에는 전혀 염색되지 않고 난자의 내부에 약하게 염색되었다.
- 본 실험의 결과들을 종합해 볼 때 Fas와 Fas ligand가 발현 되고 있는 난포임에도 불구하고 세포자연사가 일어나지 않은 것은 세포 내 신호전달과정 중 특정 단계의 억제 가능성을 시사한다. 이와 더불어 Fas 및 Fas ligand의 발현은 세포자연 사의 유도에 필요조건이지만 충분조건은 아니라고 생각된다.
- 2F). 생리식염수를 주사한 대조군의 난소내 과립세포에서 Fas와 Fas ligand는 난포의 발달단계에 따라 염색정도를 보이며 발현하고 있음을 관찰할 수 있었다. Fas는 원시난포에서는 나타나지 않았으나 강소형성전난포(PAF)에서 약하게 염색되었고, 초기 강소형성난포(EAF)에서는 가장 강한 염색을 보였다(Fig.
- 2J). 특히, 난소내 난자에서 Fas 와 Fas lignad의 발현을 확인할 수 있었는데, Fas는 주로 원시 난포와 강소형성 전난포내 난자들에서 염색되었고, 일부는 투명대에 강한 염색 정도를 나타내었다. 그러나 Fas ligand는 난포의 발달단계에 관계없이 약한 염색 정도를 보였다.
- 반면에 일부 Fas와 Fas ligand의 발현을 보이는 난포에서 세포자연사가 일어나지 않는 과립세포도 존재함을 확인할 수 있었다. 한편 난자에서 Fas와 Fas ligand 발현을 관찰해본 결과, 강소형성전난포내 난자들이 Fas를 발현하지만 투명대에는 전혀 염색되지 않고 난자의 내부에 약하게 염색되었다. 초기강소난포의 난자에 서는 Fas ligand가 난자 내부에 염색되었으며, 투명대에 좀 더 강하게 염색되는 결과를 얻었다.
- 또한 과립세포와 난자를 분리해서 RT-PCRi- 수행한 결과에서도 Fas와 Fas ligand가 모두 발현되는 것을 알 수 있었다. 한편, 난자의 상태에 따른 RT-PCR 결과에서도 정상인 난자와 퇴화된 난자 모두 동일하게 Fas와 Fas ligand mRNA가 증폭되는 결과를 나타냈다.
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