Gonadotropin Releasing Hormone-Agonist가 임신된 흰쥐 황체세포의 세포자연사에 미치는 영향 Effect of Gonadotropin Releasing Hormone-Agonist on Apoptosis of Luteal Cells in Pregnant Rat원문보기
최근 난포에서 GnRH와 그 수용체의 발현이 확인되면서 GnRH가 국소적으로 난소의 기능을 조절하고,특 히 과립세포의 세포자연사(apoptosis)를 유도하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 황체에서 GnRH와 그 수용체의 발현과 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 임신한 흰쥐의 황체세포에서 GnRH와 그 수용체가 발현되는지를 확인하고, 또한 GnRH가 황체세포의 세포자연사를 직접적으로 유발시킬 수 있는지를 알아보고자 시행하였다. 임신된 흰쥐로부터 황체세포를 획득하여 배양한 후 면역조직화학적 염색과 Western blot 방법으로 GnRH와 그 수용체의 발현을 확인한 결과 배양된 황체세포에서 GnRH와 그 수용체가 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. GnRH가 배양된 황체세포의 세포자연사에 미치는 영향을 조사하기 위하여, $10^{-6}$ GnRH-agonist(GnRH-Ag)를 처리한 후 3, 8, 12시간에 TUNEL 방법과 DNA 분절화 검증 방법으로 세포자연사를 조사하였다. TUNEL 결과 세포자연사를 보이는 황체세포는 처리 후 12 시간에 GnRH-Ag 처리군에서 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한 DNA 분절화를 조사한 결과에서도 TUNEL 결과와 유사하게 GnRH-Ag처리 후 12 시간에 DNA 분절화가 유의하게 증가하였다(p<0.05). 이러한 세포자연사의 증가가 cytochrome c 방출과 연관이 있는지를 알아보고자 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c를 Western blot 방법으로 정량한 결과, GnRH-Ag 처리 후 12 시간에 cytochrome c가 미토콘드리아로부터 세포질쪽으로 방출된 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 임신된 흰쥐의 황체세포에서 GnRH와 그 수용체 단백질이 발현되며 GnRH-Ag가 GnRH 수용체에 결합함으로써 cytochrome c가 미토콘드리아로부터 방출되고, 이로 인해 황체세포가 세포자연사하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 국소적으로 분비되는 GnRH가 미토콘드리아로부터 cytochrome c의 방출을 유발시켜 황체세포의 세포자연사를 유도할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
최근 난포에서 GnRH와 그 수용체의 발현이 확인되면서 GnRH가 국소적으로 난소의 기능을 조절하고,특 히 과립세포의 세포자연사(apoptosis)를 유도하는 것으로 보고되고 있다. 그러나 황체에서 GnRH와 그 수용체의 발현과 기능에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 따라서 본 연구는 임신한 흰쥐의 황체세포에서 GnRH와 그 수용체가 발현되는지를 확인하고, 또한 GnRH가 황체세포의 세포자연사를 직접적으로 유발시킬 수 있는지를 알아보고자 시행하였다. 임신된 흰쥐로부터 황체세포를 획득하여 배양한 후 면역조직화학적 염색과 Western blot 방법으로 GnRH와 그 수용체의 발현을 확인한 결과 배양된 황체세포에서 GnRH와 그 수용체가 강하게 발현되는 것을 관찰할 수 있었다. GnRH가 배양된 황체세포의 세포자연사에 미치는 영향을 조사하기 위하여, $10^{-6}$ GnRH-agonist(GnRH-Ag)를 처리한 후 3, 8, 12시간에 TUNEL 방법과 DNA 분절화 검증 방법으로 세포자연사를 조사하였다. TUNEL 결과 세포자연사를 보이는 황체세포는 처리 후 12 시간에 GnRH-Ag 처리군에서 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한 DNA 분절화를 조사한 결과에서도 TUNEL 결과와 유사하게 GnRH-Ag처리 후 12 시간에 DNA 분절화가 유의하게 증가하였다(p<0.05). 이러한 세포자연사의 증가가 cytochrome c 방출과 연관이 있는지를 알아보고자 미토콘드리아로부터 방출된 cytochrome c를 Western blot 방법으로 정량한 결과, GnRH-Ag 처리 후 12 시간에 cytochrome c가 미토콘드리아로부터 세포질쪽으로 방출된 것을 확인할 수 있었다. 결론적으로 임신된 흰쥐의 황체세포에서 GnRH와 그 수용체 단백질이 발현되며 GnRH-Ag가 GnRH 수용체에 결합함으로써 cytochrome c가 미토콘드리아로부터 방출되고, 이로 인해 황체세포가 세포자연사하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 국소적으로 분비되는 GnRH가 미토콘드리아로부터 cytochrome c의 방출을 유발시켜 황체세포의 세포자연사를 유도할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
Since GnRH and its receptor genes are expressed in the ovary, it has been suggested that ovarian GnRH might be involved in the regulation of ovarian function and the apoptosis of ovarian cells. However, it was not known well on the expression and function of GnRH and its receptor in the corpus luteu...
Since GnRH and its receptor genes are expressed in the ovary, it has been suggested that ovarian GnRH might be involved in the regulation of ovarian function and the apoptosis of ovarian cells. However, it was not known well on the expression and function of GnRH and its receptor in the corpus luteum. The present study was undertaken to investigate whether GnRH and its receptor are expressed in luteal cells and GnRH has any effect on the apoptosis of luteal cells. Luteal cells obtained from the pregnant rats were cultured and stained for GnRH and its receptor proteins. Cultured luteal cells showed distinct immunoreactivity against both anti-GnRH and anti-GnRH receptor antibodies. In addition, the presence of GnRH receptor protein in cultured cells was confirmed by Western blot analysis. To investigate the effect of GnRH on the apoptosis of luteal cells, luteal cells were cultured in the presence of 10$^{-6}$ M GnRH-agonist(GnRH-Ag) for 3, 8, and 12h. TUNEL assay showed that the number of cells undergoing apoptosis increased 12h after culture(P<0.05). DNA fragmentation analysis confirmed the results such that the cells treated for 12h showed the greatest increase of fragmentation(p<0.05). Further, Western blot analysis of cytochrome c in the mitochondrial and cytoplasmic fractions of the luteal cells showed that GnRH-Ag treatment increased the content of cytochrome c in cytoplasm. These results demonstrate that the luteal cells express GnRH and its receptor and GnRH-Ag treatment induces apoptosis of the luteal cells via mitochondrial release of cytochrome c. The present study suggest that the releasing of cytochrome c from mitochondria might be involved in the luteal cell apoptosis induced by GnRH-Ag.
Since GnRH and its receptor genes are expressed in the ovary, it has been suggested that ovarian GnRH might be involved in the regulation of ovarian function and the apoptosis of ovarian cells. However, it was not known well on the expression and function of GnRH and its receptor in the corpus luteum. The present study was undertaken to investigate whether GnRH and its receptor are expressed in luteal cells and GnRH has any effect on the apoptosis of luteal cells. Luteal cells obtained from the pregnant rats were cultured and stained for GnRH and its receptor proteins. Cultured luteal cells showed distinct immunoreactivity against both anti-GnRH and anti-GnRH receptor antibodies. In addition, the presence of GnRH receptor protein in cultured cells was confirmed by Western blot analysis. To investigate the effect of GnRH on the apoptosis of luteal cells, luteal cells were cultured in the presence of 10$^{-6}$ M GnRH-agonist(GnRH-Ag) for 3, 8, and 12h. TUNEL assay showed that the number of cells undergoing apoptosis increased 12h after culture(P<0.05). DNA fragmentation analysis confirmed the results such that the cells treated for 12h showed the greatest increase of fragmentation(p<0.05). Further, Western blot analysis of cytochrome c in the mitochondrial and cytoplasmic fractions of the luteal cells showed that GnRH-Ag treatment increased the content of cytochrome c in cytoplasm. These results demonstrate that the luteal cells express GnRH and its receptor and GnRH-Ag treatment induces apoptosis of the luteal cells via mitochondrial release of cytochrome c. The present study suggest that the releasing of cytochrome c from mitochondria might be involved in the luteal cell apoptosis induced by GnRH-Ag.
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문제 정의
그러나 이러한 세포자연사가 황체세포에 존재하는 GnRH 수용체에 직접 작용해서 일어나는 것인지 대한 증거는 부족한 상태이다. 따라서 본 실험에서는 GnRH가 황체에 미치는 직접적인 세포자연사 유발 효과를 증명하기 위하여 임신된 흰쥐의 황체세포에 GnRH-Ag를 처리한 후 세포의 변화를 관찰하였다.
따라서 본 연구의 목적은 임신된 흰쥐에서 획득한 황체를 이용하여 먼저 GnRH와 그 수용체가 발현하는지를 조사한 다음 배양된 황체세포에 GnRH-Ag를 처리한 후 세포 자연사가 일어나는지를 확인하고, 세포자연사가 일어난 황체 세포에서 cytochrome c 방출 여부를 확인하고자 하였다.
제안 방법
1:200으로 희석시킨 rabbit polyclonal anti-rat GnRH 와 GnRH 수용체 일차항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 이용하여 I시간동안 상온에서 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. FITC가 결합되어 있는 anti-rabbit IgG 이차항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
)를 이용하여 I시간동안 상온에서 반응시킨 후 PBS로 세척하였다. FITC가 결합되어 있는 anti-rabbit IgG 이차항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.)를가지고 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 증류수로 세척 하고 봉입하였다. GnRH와 GnRH 수용체의 발현은 confocal scanning image analysis system(Fluro View, FV300; Olympus Optical Co.
GnRH-Ag에 의해 유발된 황체세포의 세포자연사를 확인하는 다른 방법으로 DNA 분절화 양상을 조사하였다(Fig. 4A). TUNEL 결과와 동일하게 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 처리 군(3.
GnRH가 직접적으로 황체세포의 세포자연사를 유발시킬수 있는지를 알아보기 위하여 배양된 황체세포에 GnRH-Ag 를 처리한 후 TUNEL 방법을 이용하여 조사하였다. 세포 자연사가 일어난 세포들에서 녹색 형광으로 염색됨을 관찰할 수 있었고, PI로 핵을 이 중 염색을 했을 경우 두 색이 합쳐져 노란색을 보임을 알 수 있었다.
)를가지고 30분 동안 상온에서 반응시킨 후 증류수로 세척 하고 봉입하였다. GnRH와 GnRH 수용체의 발현은 confocal scanning image analysis system(Fluro View, FV300; Olympus Optical Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
DNA는 다시 14, 000xg에서 20분간 원심분리한 후 ethanol로 침전시켰다. Labeled DNA는 40mM Tris-acetate와 ImM EDTA buffer0)] 담겨있는 2% agarose 젤에서 3시간 30분 동안 전기영동(60 volts)을 시행하였다. 젤에서 완전히 물을 제거한 후 Kodak X-Omat films에노출시켜 DNA 분절화 양상을 확인하였다.
1% Tween-20) 용액 에 1시간 동안 담가 비특이 적 결합을 방지 하기 위한 blocking을 수행하였다. Membranee rabbit polyclonal anti-rat GnRH receptor(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.) 일차항체가 1:1, 000으로 희석된 TTBS에서 1시간 동안 반응시켰다. TTBS 로 1분씩 3회 세척 후 이차항체인 anti-rabbit horseradish peroxidase- conjugated antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
) 일차항체가 1:1, 000으로 희석된 TTBS에서 1시간 동안 반응시켰다. TTBS 로 1분씩 3회 세척 후 이차항체인 anti-rabbit horseradish peroxidase- conjugated antibody(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.S.A.)를 TTBS에 1:1,000으로 희석시킨 후 40분동안 상온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 membranee chemiluminescence 용액 (ECL kit; Amersham life science, Buckinghamshire, UK.
세포자연사 정도를 정량하기 위하여 임의적으로 선택된 200 배율 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 700~1,000 개의 세포를 세었다. 그 중 TUNEL에 의해 녹색 형광으로 염색된 세포 수와 “로 염색된 전체 세포 수를 비율로 계산하여 세포자연사 정도를 분석하였다.
1mM phenylmethyl-sulfonylfluoride, 5 /zg/ml aprotinin, and 5 " g/ml leupeptin)이 포함된 균질화 용액에서 분쇄한 후 12, 000xg에서 30분간 원심분리하였다. 단백질의 농도는 DC protein assay kit(Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, U.S.A.)를이용하여 측정한 후 동일한 양을 10% SDS-PAGE에서 전기영동을 시행하였다. 전기영동에 의해 분리된 단백질들은 blotting 방법으로 nitrocellulose membrane으로 옮기고, 5% non-fat dry milk가 포함된 Tris-buflered saline(TTBS; 10 mM Tris(pH 7.
0)에 용해시킨 후 I“1의 DNase- free RNase(500 n g/ml; Boehringer-Mannheim, Roche Disno- sties GmbH, Mannheim, Germany)를 첨가하고 60분 동안 37℃ 에서 방치하였다. 동량의 phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1, V:V:V)를 첨가하여 DNA를 추출하였으며, 다시 동량의 chloroform : isoamyl alcohol(24:l, V:V)로 재 추출하였다. 상층액을 모아서 0.
젤에서 완전히 물을 제거한 후 Kodak X-Omat films에노출시켜 DNA 분절화 양상을 확인하였다. 또한 15kb 이하의 DNA fi:actiori들을 젤에서 자른 후 10ml scintillation fluid를 넣어 Gounter로 방사선 방출량을 측정하였다';
EDTA로 처리된 황체들은 200Xg에서 15분간 원심분리한 후 EDTA 용액을 HBSS로 교환하였다. 마지 막으로 pasteur pipet을 이용하여 아직 단일 세포로 분리되지 않은 황체 조직을 위 아래로 pipeting하면서 단일 세포로 만들었다. 이렇게 만들어진 단일 황체세포는 200Xg에서 15분간 원심분리한 후 25mM HEPES buffer, penicillin 100IU, streptomycin 100"g/ml, gentamicin 50 "g/ml, 10% fetal bovine serum이 포함된 Medium 199로 옮겼다.
)를이용하여 배 양하였으며, well 당 세포 수는 5 ¥ IO。개로 하였다. 배양은 37℃에서 95% 공기와 5% CO2가 공급되고 100% 습도가 유지되는 배양기 내에서 수행하였으며 배양된 황체 세포는 GnRH-Ag 처리 후 4, 8, 12시간에 획득하였다. 황체 세포의 Western blot 분석을 위해 급속 냉동 후 -70℃에 보관하였고 일부는 면역조직화학적 염색을 위해 4% paraformaldehyde 용액에 고정하였다.
증류수로 세척한 후 propidium iodide(PI)로 핵을 2차 염색하고 형 광현 미 경 하에서 검 경 하여 황체 세포의 세 포자 연사를 조사하였다. 세포자연사 정도를 정량하기 위하여 임의적으로 선택된 200 배율 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 700~1,000 개의 세포를 세었다. 그 중 TUNEL에 의해 녹색 형광으로 염색된 세포 수와 “로 염색된 전체 세포 수를 비율로 계산하여 세포자연사 정도를 분석하였다.
035M potassium acetate 를 넣고 시료를 잘 섞은 후 60분간 단백질이 가라앉도록 얼음에 방치하였다. 시료는 4℃, 5000xg에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 미량원심분리 시험관으로 옮기고 동량의 phenol : chloroform : isoamyl alcohol(25:24:l, V:V:V)을 첨가하여 DNA를 추출하였으며, 다시 동량의 chloroform : isoamyl alcohol(24:l, V:V)로 재추출하였다. 상층액을 미량 원심 분리 시험관에 옮기고 0℃ 에서 보관한 2.
공급되는 동물실험실에서 사육하였다. 임신된 흰쥐로부터 황체를 획득하기 위하여 먼저 흰쥐를 마취시킨 후 복부를 절개하여 양쪽 난소를 적출하였다. 획득된 난소로부터 분리된 황체들은 sodium bicarbonate가 포함된 Medium 199 (Gibco BRL, Life Technologies, Inc.
)를이용하여 측정한 후 동일한 양을 10% SDS-PAGE에서 전기영동을 시행하였다. 전기영동에 의해 분리된 단백질들은 blotting 방법으로 nitrocellulose membrane으로 옮기고, 5% non-fat dry milk가 포함된 Tris-buflered saline(TTBS; 10 mM Tris(pH 7.6), 150mM NaCl, 0.1% Tween-20) 용액 에 1시간 동안 담가 비특이 적 결합을 방지 하기 위한 blocking을 수행하였다. Membranee rabbit polyclonal anti-rat GnRH receptor(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, U.
Labeled DNA는 40mM Tris-acetate와 ImM EDTA buffer0)] 담겨있는 2% agarose 젤에서 3시간 30분 동안 전기영동(60 volts)을 시행하였다. 젤에서 완전히 물을 제거한 후 Kodak X-Omat films에노출시켜 DNA 분절화 양상을 확인하였다. 또한 15kb 이하의 DNA fi:actiori들을 젤에서 자른 후 10ml scintillation fluid를 넣어 Gounter로 방사선 방출량을 측정하였다'
반응을 중단시키기 위하여 stop buffer를 상온에서 10분간 처리한 후 Tris buffer로 3번 세척한 다음 anti-digoxigenin-FITC로 37℃ 에서 30분간 반응시 켰다. 증류수로 세척한 후 propidium iodide(PI)로 핵을 2차 염색하고 형 광현 미 경 하에서 검 경 하여 황체 세포의 세 포자 연사를 조사하였다. 세포자연사 정도를 정량하기 위하여 임의적으로 선택된 200 배율 시야에서 각각 다른 시야로 5번을 옮기면서 700~1,000 개의 세포를 세었다.
3A). 황체세포에서 세포자연자가 일어난 정도를 정량화하기 위하여 염색된 세포를 계수하여 비율을 계산하였다. GnRH-Ag처리 후 12시간에 대조군(22.
대상 데이터
본 실험에 사용된 임신 8일령의 Sprague-Dawley 흰쥐들은 14시간 명주기와 10시간 암주기가 조절되고 충분한 사료와 물이 공급되는 동물실험실에서 사육하였다. 임신된 흰쥐로부터 황체를 획득하기 위하여 먼저 흰쥐를 마취시킨 후 복부를 절개하여 양쪽 난소를 적출하였다.
황체들은 가위를 이용하여 작은 조각으로 자른 다음 세포 분리용 배 양액 이 들어있는 작은 삼각플라스크에 옮겼다. 세포 분리용 배양액으로는 calcium과 magnesium0] 포함되어 있지 않고, 0.1% BSA, collagenase(50 U/ml), dispase(2.4 U/ml), DNase(200 U/ml) 등이 포함된 HBSS 을 사용하였다. 작은 조각으로 잘린 황체들이 들어있는 삼각플라스크는 37℃ 가 유지 되는 항온 수조에 옮기고 30분씩 4번 흔들어 주었다.
데이터처리
통계학적 유의성 검정은 student's t-test 방법을 사용하였으며 p 값이 0.05보다 작은 경우를 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
3. Detection of apoptotic cells in the luteal cells cultured with saline or GnRH-Ag using TUNEL assay(A). At 12h after saline(a) or GnRH-Ag(b) treatment, apoptotic cells were detected using in situ apoptosis detection kit after fixation.
배양된 황체세포에서 TUNEL 방법으로 세포자연사를 확인하기 위하여 in situ apoptosis detection kit(ApopTag; Intergen, Gaithersburg, MD, U.S.A.)를 사용하였다. 황체세포가 배양된 각각의 well에 4% neutral buffered formalin을 500/zl 씩 넣어 10분간 고정 후 Tris buffer로 세척 하였다.
성능/효과
4A). TUNEL 결과와 동일하게 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 처리 군(3.2±0.53)에서 대조군(1.12±0.21)에 비해 DNA 분절화 정도가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다 0.05)(Fig. 4B).
결론적으로 본 연구 결과 GnRH와 그 수용체 단백질이 임신된 흰쥐의 배양된 황체세포에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 배양된 황체세포에 GnRH-Ag의 처리한 결과 직접적으로 황체세포의 세포자연사를 유도시켰으며, 이는 미토콘드리아로부터 cytochrome c의 방출을 매개로 이루어진 것으로 사료된다.
보이지 않았다. 그러나 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 cytochrome c 양은 미토콘드리아 분획에서는 감소한 반면, 세포질 분획에서 3배 이상 증가한 것을 알 수 있었다(Fig. 5).
배양된 황체세포에 GnRH-Ag를 처리한 후 미토콘드리아로부터 방출되는 cytochrome c의 양을 조사하기 위하여 세포질 분획과 미토콘드리아 분획을 분리하여 Western blot을 수행한 결과, 처리 후 4시간과 8시간에서 두 분획 간에 cytochrome c의 양은 대조군 또는 GnRH-Ag 처리군 모두에서 차이를 보이지 않았다. 그러나 GnRH-Ag 처리 후 12시간에 cytochrome c 양은 미토콘드리아 분획에서는 감소한 반면, 세포질 분획에서 3배 이상 증가한 것을 알 수 있었다(Fig.
배양된 황체세포에서 GnMI가 강하게 염색된 반면(Fig.lc), GnRH 수용체는 상대적으로 약하게 염색된 것을 알 수 있었다(Fig. If), 일차 항체를 제거한 후 동일하게 염색을 시행한 음성대조군에서는 GnRH 및 GnRH 수용체 모두 염색이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다(Fig. lb, e).
배양된 황체세포에서 GnRH 수용체의 발현을 정확히 확인하기 위하여 Western blot 방법을 시행한 결과, 황 체세포에서 다량 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용한 뇌하수체에서 다량의 GnRH 수용체 단백질이 검출된 반면, 음성대조군으로 사용한 시상하부에서는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig.
세포 자연사가 일어난 세포들에서 녹색 형광으로 염색됨을 관찰할 수 있었고, PI로 핵을 이 중 염색을 했을 경우 두 색이 합쳐져 노란색을 보임을 알 수 있었다. 또한 TNEL에 의해 염색된 세포들은 대부분 세포자연사의 형태적인 특징인 응축된 모양을 보여주었다(Fig.
발현되는 것을 확인할 수 있었다. 양성대조군으로 사용한 뇌하수체에서 다량의 GnRH 수용체 단백질이 검출된 반면, 음성대조군으로 사용한 시상하부에서는 검출되지 않음을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
, 1999). 이러한 결과들을 종합하여 볼 때, GnRH-Ag에 의한 황체세포의 자극은 세포 내 NO의 변화를 유도하면서 Bax, Bcl-xL와 Bcl-2와 같은 단백질의 발현을 조절함으로써 미토콘드리아의 막 투과성을 증가시키고, 이로 인하여 cytochrome c가 세포질 쪽으로 방출되면서 세포자연사가 일어나는 것으로 사료된다.
이를 위하여 본 연구에서는 먼저 배양된 황체세포에서 GnRH와 그 수용체의 발현을 확인한 결과, GnRH 수용체의 발현은 배양 후에도 그대로 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한 다른 조직과 비교해 볼 때 황체에서 다량 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 황체세포가 난소 내 다른 세포들보다 더 효과적으로 GnRH에 의해 직접적인 조절을 받을 수 있다는 것을 시사한다.
이러한 결과는 황체세포가 난소 내 다른 세포들보다 더 효과적으로 GnRH에 의해 직접적인 조절을 받을 수 있다는 것을 시사한다. 한편 배양된 황체 세포에서 GnRH 수용체의 발현 정도는 체내 황체조직에 비해 발현되는 양이 감소해 있는 것을 알 수 있었고, 이는 체외에서 황체세포를 배양하는 조건이 체내 환경과 비교해서 GnRH 수용체 발현을 유지시키기 위한 중요한 요소들이 결핍되어 일어난 것으로 사료된다. 이러한 임신된 흰쥐의 황체 세포에서 GnM와 그 수용체의 발현은 이미 오래 전부터 GnRH-like mRNA가 난소의 협막세포, 과립세포, 그리고 황체 등에서 발현된다는 결과를 뒷받침하는 증거라고 할 수 있다.
한편 본 실험 결과에서 GnRH-Ag 처리 후 황체세포 내 미토콘드리아에서 cytochrome c가 세포질 쪽으로 방출되는 것을 확인할 수 있었다. 미토콘드리아의 cytochrome c 방출은 세포 자연사가 진행되는 세포에서 일어나는 일련의 현상으로 미토콘드리아의 막 투과성을 잃어버림으로써 나타난다.
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