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문제 정의
- 따라서 본 실험은 상업적으로 사용되고 있는 유산균 8종과 비피더스균 2종을 사용하여 대표적인 유해 장내균총이며 식중독 유발균종인 Escherichia coli 와 Salmonella typhimurium 의 생장 억제 측정방법을 비교하였으며 유산균과 병원성균을 혼합배양하여 배양시간에 따른 생장 억제를 시험하여 산업적 이용면에서 유산균의 항균활성에 관한 기초지식을 얻고자 시행되었다
- 본 실험에서는 lactobacilli와 bifidobacteria에의한 E. co〃와 S. iyphi허urium에 대한 생육 억제 능을 조사 하였다. 생육억제활성은 well disc assay와 turbidimetry method로 측정하여 비교하였다.
제안 방법
- E.。coli와 S. thphimurium은 TSA 에 pouring method로 371 18시간 배양하여 전형적 장내세균 군락을 생균수로 측정하였으며 1.acidophilus La-5, L acidophilus NCFM과 L. casei Lc-이은 MRS + 0.02% N&N3 agar를 이용하여 37*C에서 72시간 혐기성배양(Difix) Anaerobic System, U.S.A.) 한 후 측정하였다.
- 사용하였다. 대상시험균주를 초기농도 lx 105 CFU/mL로 접종한 후 32 ℃ 에서 16시간 배양한 다음 spectrophotometer (Agilent Technologies 8453 UV-Vis System, U.S.A.)로 660 nm에서 홉광도(O.D.)를 측정하였다. 유산균 배양액의 생육저해율 계산은 다음과 같이 하였다.
- 동시접종배지 MRS-C broth에 유산균 1시W CFU/mL, enteropathogen 1><107 CFU/mL 농도로 각각 접종하였다. 37℃ 항온기에서 배양하며 시간별로 생균수를 duplicate로 측정하였고 pH 는 pH meter(Orion, model 520A, U.
- TSA 50 J1L 로 아래 쪽을 sealing한 후 agar plate를 4〔C 에서 2~3시간 완전히 굳힌다. 생육억제물질 시료 150 UL를 홈에 주입하고 agar plate를 4P 에서 2시간 시료가 흡수되도록 방치한 후 32P에서 16시간 배양하여 각각의 억제환을 관찰하였다 (Tramer와 Fowler, 1964).
- 생육억제물질 활성측정용 시료를 tryptic soy broth(TSB)에 20%(v/v) 첨가하고 공시험 용액은 열처리(12LC, 20 min)한 배양 상등액을 첨가하여 사용하였다. 대상시험균주를 초기농도 lx 105 CFU/mL로 접종한 후 32 ℃ 에서 16시간 배양한 다음 spectrophotometer (Agilent Technologies 8453 UV-Vis System, U.
- 두 균주의 배양조건은 37℃에서 16시간이었다. 유산균 Direct Vat System(DVS)는 0.5% yeast extract를 포함한 10% reconstituted skim milk에 3회 연속 계대하여 활성화 시켰으며 2주일에 한번씩 활성 유지를 위해 3회 연속 계대 배양하였다. 항균 활성측정용 시료제조(Biffi 등, 1997)에는 0.
- casei Lc-이는 평균적으로 증식억제능이 높은 것으로 나타났다. 항균물질을 함유한 유산균배양액에 의한 항균활성이 경쟁배양시험 시 동일한 억제효과를 내는지 혼합배양시간에 따른 유해균의 사멸속도를 측정하였다. 각각의 생균 수와 pH를 측정한 결과는 Fig.
대상 데이터
- E. coli ATCC 25922와 S. typhimurium ATCC 13311 는 tryptic soy broth(Difco Lab., U.S.A.)에 3회 연속 계대 배양하여 시험에 사용하였으며 균주보존은 tryptic soy agar(Difco Lab., U.S.A.) slant를 사용하여 1 개월 마다 3회 연속 계대한후 냉장 보존하여 사용하였다. 두 균주의 배양조건은 37℃에서 16시간이었다.
- 장내 유해세균으로는 Escherichia coli ATCC 25922와 Salmonella typhimurium ATCC 13311 을 시험대상 균주로 사용하였으며 유산균은 상업적으로 사용되는 균주인 Christian Hansen사 (Denmark) 의 Lactobacillus acidophilus La-5, Lactobacillus casei Lc-01, Lactobacillus bulga- ricus Lb-12, Bifidobacterium bifidum Bb니 2 와 Rodia 사(U.S.A.) 의 Lactobacillus acidophilus NCFM, Lactobacillus casei LC911, Lactobacillus helveticus LH-166, Bifidobacterium longum BBL 및 Lactobacillus reuteri KCTC 3678, Lactobacillus reuteri KCTC 3679를 사용하였다.
이론/모형
- iyphi허urium에 대한 생육 억제 능을 조사 하였다. 생육억제활성은 well disc assay와 turbidimetry method로 측정하여 비교하였다. 시험균주 1。종 중에서 두 가지 방법 모두 평균적으로 높은 항균 활성을 나타낸 균주는 L.
성능/효과
- 70%로 나타났다. E. coli 와 S. typhimurium 각각에 대한 생육억제율은 L. acidophilus La-5과 L. acidophilus NCFM 이 가장 높았으나 두 유해균에 대한 평균억제율은 L casei Lc-이이 가장 높은 것으로 나타났다. 유해세균에 대한 유산균의 증식억제능을 두 가지 항균활성 측정법으로 시험한 결과 well disc assay는 결과측정이 용이하였으나 turbidimetry 법이 정확하게 측정이 가능하였고 재현성이 더 좋은 것으로 나타났다.
- 1과 같다. E. coli는 25 ℃ 16시간 배양한 후 억제환을 관찰하였는데 L. acidophilus La<의 억제환이 18.67mm로 항균력이 가장 컸으며 L. casei Lc*이 18.00mm, L acidophilus NCFM 17.67mm, B. longum BBL 16.83mm의 순으로 억제효과가 나타났다. S.
- 2와 같다. E. coli에 대한 생육 저해율이 가장 높은 유산균은 L. acidophilus La-5 로 55.79% 였고 L acidophilus NCFMe 52.45%이고 L casei Lc-이은 55.02%로 높게 나타났다. S.
- Fig. 3은 L. acidophilus La5와 E. coll 혼합배양 결과로 pH가 감소하는 시점인 6시간부터균수가 감소하였고 12시간(pH 4.23) 배양 시는 7.94 X 105 CFU/mL, 24시간(pH 3.97)에는 3.09x102 CFU/mL로 생균수가 급격히 감소하였다. Fig.
- 09x102 CFU/mL로 생균수가 급격히 감소하였다. Fig. 4는 L acidophilus La-5와 S. typhimurium 혼합배양 결과로 배양 9시간까지 생균수가 유지되었으며 12시간 배양 시는 2.09씨 O’ CFU/ mL, 18시간에는 2.4x10, CFU/mL로 생균 수가 감소하였다.
- 83mm의 순으로 억제효과가 나타났다. S. typhimurium 의 경우는 L. acidophilus 와 L. acidophilus NCFM이 18.00mm로 억제능이 동일했으며 다음은 B. longum BBL 1767mm, L. casei Lc*이 16, 67mm로 생육저해능이 높았다. 최근 관심의 대상이 되고 있는 L.
- S.。typhimurium 에 대한 저해율은 L acidophilus NCFM이 63.64%로 가장 저해율이 높았는데 이 결과는 Gilliland와 Speck(1977)의 연구 결과와 일치하였으며 L casei Lc-01은 62.98%, 1.acidophilus La-5는 55.70%로 나타났다. E.
- acidophilus NCFM이 생육억제능이 우수하였다. 결과적으로 유해 세균과 혼합배양시 유산균의 종류에 따라 상이한 생육억제 효과를 나타낸다고 사료된다.
- acidophilus NCFM이었다. 또한 L. casei Lc-이는 평균적으로 증식억제능이 높은 것으로 나타났다. 항균물질을 함유한 유산균배양액에 의한 항균활성이 경쟁배양시험 시 동일한 억제효과를 내는지 혼합배양시간에 따른 유해균의 사멸속도를 측정하였다.
- 상기한 두 가지 방법으로 유산균 배양액의 항균 활성을 측정한 결과 E. coll ATCC 25922 에 대한 증식억제능이 제일 뛰어난 유산균은 L. acidophilus La-5 이었고 S. typhimurium ATCC13311에 대한 증식억제능이 가장 우수한 균주는 L. acidophilus NCFM이었다. 또한 L.
- acidophilus NCFM와 L casei Lc-이인 것으로 나타났다. 선택된 3가지 유산균과 대표적 enteropathogenH E co〃와 S. typhimuriunre: 각각의 혼합 배양하여 생균 수를 측정한 결과 병원성균 생육억제는 생균 수가 급격히 감소하는 배양 9시간 이후부터 나타났으며 30시간 혼합배양 후에는 병원성균의 생균 수는 거의 존재하지 않았다. 실험결과 유산균의 항균활성은 pH 저하 만에 의한 것이 아니었고 유산균의 종류에 따라 생육억제활성에 차이가 있었다.
- typhimuriunre: 각각의 혼합 배양하여 생균 수를 측정한 결과 병원성균 생육억제는 생균 수가 급격히 감소하는 배양 9시간 이후부터 나타났으며 30시간 혼합배양 후에는 병원성균의 생균 수는 거의 존재하지 않았다. 실험결과 유산균의 항균활성은 pH 저하 만에 의한 것이 아니었고 유산균의 종류에 따라 생육억제활성에 차이가 있었다.
- co”.와 혼합배양 시는 L. acidophilus La-5과 L. casei Lc-01 이 L acidophilus NCFM보다 저해 경향이 우수하였고 S. typhimurium에 대해서는 L. acidophilus NCFM이 생육억제능이 우수하였다. 결과적으로 유해 세균과 혼합배양시 유산균의 종류에 따라 상이한 생육억제 효과를 나타낸다고 사료된다.
- 혼합배양의 경우는 pH가 감소함에 따라 유해 세균의 생육이 억제되는데 배양 24시간 이상 경과함에 따라 생균수가 거의 존재하지 않았다. 유산균 세 종류와 2종의 유해세균의 경쟁적 억제작용을 살펴본 결과 well disc assay 및 turbidi- metry 법에 의한 결과와 유사한 결괴를 얻을 수 있었으며 공통적으로 일정한 배양시간 9시간 이후부터 유해세균에 증식 억제효과를 나타내어 생균 수가 급격히 줄어들었다. E.
- acidophilus NCFM 이 가장 높았으나 두 유해균에 대한 평균억제율은 L casei Lc-이이 가장 높은 것으로 나타났다. 유해세균에 대한 유산균의 증식억제능을 두 가지 항균활성 측정법으로 시험한 결과 well disc assay는 결과측정이 용이하였으나 turbidimetry 법이 정확하게 측정이 가능하였고 재현성이 더 좋은 것으로 나타났다.
- 생육억제활성은 well disc assay와 turbidimetry method로 측정하여 비교하였다. 시험균주 1。종 중에서 두 가지 방법 모두 평균적으로 높은 항균 활성을 나타낸 균주는 L. acidophilus La-5, L. acidophilus NCFM와 L casei Lc-이인 것으로 나타났다. 선택된 3가지 유산균과 대표적 enteropathogenH E co〃와 S.
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