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문제 정의
- 내부표준용액을 이용한 HPLC 분석 결과를 기준분석치로 하고 NIR 투과스펙트럼의 부분 최소제곱법(PLSR)을 사용하여 정량분석을 위한 최적의 검정선을 개발하고, 이를 의약품 허가등록을 위한 국제조화회의 (international conference of harmonization, ICH) 가 권고하는 분석법의 타당성을 검증하였다28). 그리고 본 분석법을 제조회사 간 구분없이 생산되는 모든 페노바르비탈 정제에서 페노바르비탈 정량에 이용하고자 하였다.
- 본 연구에서는 페노바르비탈 정제의 NIR 스펙트럼 특성을 연구하고, 그 결과로 부터 페노바르비탈의 분석법을 개발하여 함량균일성 시험 등에 적용고자 하였다. 내부표준용액을 이용한 HPLC 분석 결과를 기준분석치로 하고 NIR 투과스펙트럼의 부분 최소제곱법(PLSR)을 사용하여 정량분석을 위한 최적의 검정선을 개발하고, 이를 의약품 허가등록을 위한 국제조화회의 (international conference of harmonization, ICH) 가 권고하는 분석법의 타당성을 검증하였다28).
제안 방법
- 얻은 스펙트럼을 2 차 미분한 다음 PLSR 방법으로 분석한 결과와 각각에 대한 HPLC 의 기준 분석치를 가지고 검정선 작성과 검정선 검증에 사용하였다. 80개 시료 스펙트럼 중 50개 시료의 스펙트럼과 그의 기준 분석치를 이용하여 검정선 작정에, 30개 시료의 스펙트럼과 그의 기준 분석치들은 검성선의 정확성을 보는 검증에 사용하였다. 검정 선의 예측성능을 평가하기 위하여 검정선 작성에 포함되지 않은 다른 각 롯트의 시료의 스펙트럼과 기준분석치를 얻어 사용하였다.
- PLSR 방법은 펙터의 수와 PRESS(predicted residual sum of squares) 값을 참조하고 결정계수와 SEC를 비교하여 선정하였다. 최적의 PLSR 법은 먼저 결정계수가 높은 모델을 선정하였으며, 결정계수가 유사한 값을 나타낼 때에는 SEC가 낮은 모델로 선정하였다.
- 개발한 검정선을 가지고 1 롯트의 제품에 대하여 재현성 시험을 하였다. 10회 반복 시험한 결과는 Table 3과 같으며 CV 값이 0.
- 최적의 PLSR 법은 먼저 결정계수가 높은 모델을 선정하였으며, 결정계수가 유사한 값을 나타낼 때에는 SEC가 낮은 모델로 선정하였다. 결정계수와 SEC 가 유사한 값을 가질 경우에는 팩터 수가 작은 것을 최적모델로 결정하였다.
- 따로 페노바르비탈 표준시약 약 30 mg 을 정확하게 달아 50 mL 용량 플라스크에 넣고 시료용액과 같은 방법으로 조작하여 표준용액으로 하였다. 그리고 각 정제를 HPLC 을 이용하여 함량 백분율(%, w/w) 를 구하여 기준 분석치로 하였다. 최적의 검정선을 얻기 위해 총 80개의 시료의 NIR 투과스펙트럼과 기준분석치를 얻었다.
- 근적외선 분광광도법을 이용하여 페노바르비탈정 에서 페노바르비탈의 정량에 대한 검정선을 개발하였다. 검정선용 정제를 여러 농도 별로 제작하지 않고, 시중에 유통되는 정제를 검정선용 시료로 사용하였으며, 단일 회사별로 작성한 검정선보다 여러 회사를 통합하여 얻은 검정선이 더 우수한 결과를 얻었다.
- 하였다. 내부표준용액을 이용한 HPLC 분석 결과를 기준분석치로 하고 NIR 투과스펙트럼의 부분 최소제곱법(PLSR)을 사용하여 정량분석을 위한 최적의 검정선을 개발하고, 이를 의약품 허가등록을 위한 국제조화회의 (international conference of harmonization, ICH) 가 권고하는 분석법의 타당성을 검증하였다28). 그리고 본 분석법을 제조회사 간 구분없이 생산되는 모든 페노바르비탈 정제에서 페노바르비탈 정량에 이용하고자 하였다.
- 22를 이용하였다. 또한 기준분석치를 얻기 위하여 사용한 HPLC systeme UV 검출기와 auto-injector가 장착된 Shiseido사의 Semi-micro HPLC system(model SI-I) 을 사용하였으며, 칼럼은 Capcellpak C1s(3.5 x 150 mm)을 사용하였다.
- 본 연구에서는 제조사간의 구별없이 통일된 검정 선을 얻기 위하여 검정선용 정제를 별도로 제작하지 않고, 시판되는 4개 회사 제품 중 1 롯트씩 20 정을 가지고 NIR 스펙트럼을 얻었다. 얻은 스펙트럼을 2 차 미분한 다음 PLSR 방법으로 분석한 결과와 각각에 대한 HPLC 의 기준 분석치를 가지고 검정선 작성과 검정선 검증에 사용하였다.
- 시료 정제를 이용하여 검정선을 얻을 때 함량(%, w/w)이 비슷한 시료의 HPLC 에 의한 기준분석치는 매우 정밀하여야 하므로 내부표준용액을 이용한 재현성시험을 하였다. 동일 시료를 10회 반복 측정하여 주성분과 내부표준물질에 대한 봉우리 면적비를 계산하여 분석한 결과는 Table 2와 같이 분산계수(coefficcient of variance, CV) 값이 0.
- 그리고 각 정제를 HPLC 을 이용하여 함량 백분율(%, w/w) 를 구하여 기준 분석치로 하였다. 최적의 검정선을 얻기 위해 총 80개의 시료의 NIR 투과스펙트럼과 기준분석치를 얻었다.
대상 데이터
- 이는 같은 회사 1 롯트만의 경우 검정선에 이용된 시료가 아주 비슷한 함량을 가지기 때문으로, 단일 롯트로 작성된 검정선은 적절한 검정선이 될 수 없는 것으로 사료되었다. 따라서 4개 회사의 제품 중 각 1 롯트씩(57 정)을 가지고 검정선을 작성하였다. 이때 파장 영역은 600—1400 nm, Segment size는 2 nm의 조건으로 2차 미분한 다음 PLSR 방법에 따라 분석하였다.
- 본 분석법으로 다른 4 롯트의 분석치를 가지고 예측성능을 평가하였다. 그 결과는 Fig.
- 시료 페노바르비탈정을 회사별로 롯트 당 각각 20 정씩 취하여 시료로 하였다. 시료 페노바르비탈정 각 1 정씩을 취하여 600-1400 nm 파장에서 NIR 스펙트럼을 측정한 다음 각각의 무게를 단다.
-
1.1 시료와 시약
시판되는 페노바르비탈정(30 mg)을 각각 2 롯트 씩구입하여 검정선 개발 과 분석법에 대한 검증에 사용하였다
. 회사별 (D, H, W, S 사) 제품조성은 Table 1과 같다. - 페노바르비탈의 표준시약은 KFDA 표준시약을 사용하였으며, 시료 전처리 및 표준용액 제조 등에 사용된 메탄올은 시약급을, HPLC 이동상으로 사용한 용매는 HPLC 급 아세토니트릴과 탈이온수를 사용하였다.
데이터처리
- 80개 시료 스펙트럼 중 50개 시료의 스펙트럼과 그의 기준 분석치를 이용하여 검정선 작정에, 30개 시료의 스펙트럼과 그의 기준 분석치들은 검성선의 정확성을 보는 검증에 사용하였다. 검정 선의 예측성능을 평가하기 위하여 검정선 작성에 포함되지 않은 다른 각 롯트의 시료의 스펙트럼과 기준분석치를 얻어 사용하였다. 모든 통계적 처리는 VISION 2.
- NIR 스펙트럼을 얻었다. 얻은 스펙트럼을 2 차 미분한 다음 PLSR 방법으로 분석한 결과와 각각에 대한 HPLC 의 기준 분석치를 가지고 검정선 작성과 검정선 검증에 사용하였다. 80개 시료 스펙트럼 중 50개 시료의 스펙트럼과 그의 기준 분석치를 이용하여 검정선 작정에, 30개 시료의 스펙트럼과 그의 기준 분석치들은 검성선의 정확성을 보는 검증에 사용하였다.
- 투과도 측정이 가능한 FOSS NIR systems 사의 NIR-6500 spectrometer를 사용하였으며, 각 롯트별 정제의 크기와 동일한 알루미늄재질의 sample holder를 주문 제작 하였고, 검출기로는 PbS 검출기, 가동 및 통계프로그램은 VISION 2.22를 이용하였다. 또한 기준분석치를 얻기 위하여 사용한 HPLC systeme UV 검출기와 auto-injector가 장착된 Shiseido사의 Semi-micro HPLC system(model SI-I) 을 사용하였으며, 칼럼은 Capcellpak C1s(3.
이론/모형
- 4와 같다. 검정 선을 바탕으로 검증시 얻어지는 예측표준오차(standard error of prediction, (SEP)는 (2)식을 이용하여 계산 하였다. SEP 가 0.
- 따라서 4개 회사의 제품 중 각 1 롯트씩(57 정)을 가지고 검정선을 작성하였다. 이때 파장 영역은 600—1400 nm, Segment size는 2 nm의 조건으로 2차 미분한 다음 PLSR 방법에 따라 분석하였다. 이차미분법은 스펙트럼 곡선에서의 기울기 변화의 특성을 나타내기 때문에 기준선 보정과 함께 계의 잡음 등으로 인한 오차를 제거하는 장점이 있다.
성능/효과
- 시험을 하였다. 10회 반복 시험한 결과는 Table 3과 같으며 CV 값이 0.46%로서 일반적인 허용한계 1.0%22 보다 낮아 NIR 기기의 안정성과 측정회수에 의한 기기 감도의 변화 등은 극히 미미한 것으로 나타났다. HPLC에 의한 분석치의 CV 값 0.
- 검정 선을 바탕으로 검증시 얻어지는 예측표준오차(standard error of prediction, (SEP)는 (2)식을 이용하여 계산 하였다. SEP 가 0.21%, 상관계수가 0.9947로 검정선 모델이 매우 양호함을 알 수 있었다. 따라서 본 검정 선은 페노바르비탈 정에 대한 분석법으로 적절한 것으로 사료된다.
- 각 회사마다 1 롯트만을 가지고 검정선을 얻은 결과 기준 분석치와의 정확한 상관성이 얻어지지 않았다. 이는 같은 회사 1 롯트만의 경우 검정선에 이용된 시료가 아주 비슷한 함량을 가지기 때문으로, 단일 롯트로 작성된 검정선은 적절한 검정선이 될 수 없는 것으로 사료되었다.
- 개발하였다. 검정선용 정제를 여러 농도 별로 제작하지 않고, 시중에 유통되는 정제를 검정선용 시료로 사용하였으며, 단일 회사별로 작성한 검정선보다 여러 회사를 통합하여 얻은 검정선이 더 우수한 결과를 얻었다. 본 분석법은 각 회사에서 생산하는 페노바르비탈정의 함량분석을 신속 정확하게 할 수 있는 분석법으로 이용할 수 있다
- 평가하였다. 그 결과는 Fig. 5와 같으며 SEP 가 0.39%, 상관계수가 0.9887로 직선성이 양호하였으며. HPLC의 기준 분석치와의 편차범위는 -0.
- 9947로 검정선 모델이 매우 양호함을 알 수 있었다. 따라서 본 검정 선은 페노바르비탈 정에 대한 분석법으로 적절한 것으로 사료된다.
- 0% 이하22로 나타났다. 또시험날자와 분석자 간의 변화를 2 way-ANOVA를 사용하여 평가하였는데 계통오차를 일으키는 어떤 요인도 나타나지 않아 정밀도가 매우 양호함을 알 수 있었다.
- 분석자간의 차이, 시험 날자 간의 차이에 대한 정밀도 시험을 한 결과는 Table 4 및 Table 5와 같으며 CV 값이 각각 0.45(평균)% 및 0.56(평균)%로 이 시험의 일반적인 허용 한계 2.0% 이하22로 나타났다. 또시험날자와 분석자 간의 변화를 2 way-ANOVA를 사용하여 평가하였는데 계통오차를 일으키는 어떤 요인도 나타나지 않아 정밀도가 매우 양호함을 알 수 있었다.
- 이때 검정선의 YKi는 HPLC에 의한 기준 분석치이고 YR는 NIRS로 분석한치이다. 얻은 된 검정 선의 표준오차가 0.18%, 상관계수, R은 0.9931 으로 매우 직선적인 결과를 얻을 수 있었다. Fig.
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