노보비오신은 동물용의약품 중 약산성 항생제이며, 우리나라의 경우 선진국에 비해 항생제의 사용이 높은 만큼 동물용의약품의 잔류 사례는 계속해서 증가하고 있다. 이에 따라 식품 중 잔류동물용의약품의 안전관리를 위해 축산 식품 중 닭고기, 소고기 및 우유에서 노보비오신에 대한 HPLC-UVD를 이용한 잔류 분석법을 확립하였다. 각 시료 일정량에 메탄올을 가하고 균질화하여 대상 성분을 추출하고 액-액분배법으로 지방성분을 제거한다. 대상성분이 추출된 여액을 실리카카트리지를 이용하여 정제한 다음 HPLC-UVD로 분석하였다. 확립된 시험법의 정량한계와 직선성은 CODEX 기준에 적합한 수준으로 각각 0.02 mg/kg과 0.999 ($r^2$)이었으며 회수율은 닭고기, 소고기 및 우유에서 각각 $88.8{\pm}5.6-100.3{\pm}4.4$, $88.8{\pm}7.2-97.0{\pm}3.2$ 및 $88.1{\pm}4.3-92.8{\pm}3.6%$이었다. 본 연구에서 확립된 노보비오신의 시험법은 동물용의약품의 안전관리를 위한 공정시험법으로 활용될 것으로 기대된다.
노보비오신은 동물용의약품 중 약산성 항생제이며, 우리나라의 경우 선진국에 비해 항생제의 사용이 높은 만큼 동물용의약품의 잔류 사례는 계속해서 증가하고 있다. 이에 따라 식품 중 잔류동물용의약품의 안전관리를 위해 축산 식품 중 닭고기, 소고기 및 우유에서 노보비오신에 대한 HPLC-UVD를 이용한 잔류 분석법을 확립하였다. 각 시료 일정량에 메탄올을 가하고 균질화하여 대상 성분을 추출하고 액-액분배법으로 지방성분을 제거한다. 대상성분이 추출된 여액을 실리카 카트리지를 이용하여 정제한 다음 HPLC-UVD로 분석하였다. 확립된 시험법의 정량한계와 직선성은 CODEX 기준에 적합한 수준으로 각각 0.02 mg/kg과 0.999 ($r^2$)이었으며 회수율은 닭고기, 소고기 및 우유에서 각각 $88.8{\pm}5.6-100.3{\pm}4.4$, $88.8{\pm}7.2-97.0{\pm}3.2$ 및 $88.1{\pm}4.3-92.8{\pm}3.6%$이었다. 본 연구에서 확립된 노보비오신의 시험법은 동물용의약품의 안전관리를 위한 공정시험법으로 활용될 것으로 기대된다.
Novobiocin is a coumarin-containing antibiotic, and has a longer half-life in various animals than other veterinary medicines. A simple and rapid high-performance liquid chromatography assay for the determination of residual novobiocin levels in chicken, beef and milk has been developed and validate...
Novobiocin is a coumarin-containing antibiotic, and has a longer half-life in various animals than other veterinary medicines. A simple and rapid high-performance liquid chromatography assay for the determination of residual novobiocin levels in chicken, beef and milk has been developed and validated. The separation condition for HPLC/UVD was optimized by a MG II $C_{18}$ (4.6 mm $ID{\times}250$ mm, 5 ${\mu}m$) column with 0.1% formic acid in $H_2O$/0.1% formic acid in Acetonitrile (40/60, v/v) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 340 nm. Residues were extracted from tissue by blending with methanol. After liquid-liquid partitioning, lipid materials were removed with n-hexane and purification as Silica (1 g, 6 mL) cartridge with 10 mL acetone/dichloromethane (10/90, v/v). Limit of quantification and linearity performed by the analytical method were 0.02 mg/kg and 0.999 ($r^2$), and the recovery range was $88.8{\pm}5.6-100.3{\pm}4.4$, $88.8{\pm}7.2-97.0{\pm}3.2$ and $88.1{\pm}4.3-92.8{\pm}3.6%$. It is expected that this analytical method with regards to novobiocin in chicken, beef and milk could be applied as an official method to administer food safety on veterinary medicines.
Novobiocin is a coumarin-containing antibiotic, and has a longer half-life in various animals than other veterinary medicines. A simple and rapid high-performance liquid chromatography assay for the determination of residual novobiocin levels in chicken, beef and milk has been developed and validated. The separation condition for HPLC/UVD was optimized by a MG II $C_{18}$ (4.6 mm $ID{\times}250$ mm, 5 ${\mu}m$) column with 0.1% formic acid in $H_2O$/0.1% formic acid in Acetonitrile (40/60, v/v) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min and the detection wavelength was set at 340 nm. Residues were extracted from tissue by blending with methanol. After liquid-liquid partitioning, lipid materials were removed with n-hexane and purification as Silica (1 g, 6 mL) cartridge with 10 mL acetone/dichloromethane (10/90, v/v). Limit of quantification and linearity performed by the analytical method were 0.02 mg/kg and 0.999 ($r^2$), and the recovery range was $88.8{\pm}5.6-100.3{\pm}4.4$, $88.8{\pm}7.2-97.0{\pm}3.2$ and $88.1{\pm}4.3-92.8{\pm}3.6%$. It is expected that this analytical method with regards to novobiocin in chicken, beef and milk could be applied as an official method to administer food safety on veterinary medicines.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 식품 중 잔류될 수 있는 노보비오신에 대하여 보편적인 HPLC-UVD를 사용하여 국제식품규격위원회(Codex) 기준에 부합하고 액-액분배법 등 정제과정을 추가하여 잔류물질의 감도를 높인 시험법을 개발하고자 하였으며, HPLCMS를 이용한 정성시험법도 확립하였다. 확립된 시험법은 동물용 의약품의 안전관리를 위한 공정시험법으로 활용될 것으로 기대된다.
이를 헥산으로 포화된 메탄올과 메탄올로 포화된 헥산을 이용한 액-액분배법으로 비극성 물질들을 제거하고자 하였다. 또한 실리카 카트리지를 이용한 정제 과정을 추가하여 다양한 시료들 에서 잔존하는 간섭물질들을 더 제거하고자 하였다. 예비 실험에서 HLB 카트리지를 이용하여 정제하고자 하였으나 회수율이 낮아 회수율이 높은 실리카 카트리지를 선택하게 되었다.
닭고기, 소고기 및 우유 3종의 식품에 대하여 전처리 과정에서 메탄올로 추출 및 제단백하고, 무수황산나트륨으로 수분을 제거와 동시에 균질화하였다. 이를 헥산으로 포화된 메탄올과 메탄올로 포화된 헥산을 이용한 액-액분배법으로 비극성 물질들을 제거하고자 하였다. 또한 실리카 카트리지를 이용한 정제 과정을 추가하여 다양한 시료들 에서 잔존하는 간섭물질들을 더 제거하고자 하였다.
제안 방법
2에서 보는바와 같이 340 nm에서 좀 더 높은 감도를 확인 할 수 있었고, 간섭물질 대신 노보비오신의 피크가 뚜렷하게 관찰되어서 340 nm 로 검출파장을 선택하였다. Codex 기준(10)을 참고하여 닭고기, 소고기 및 우유 시료에서 MRL 수준의 1/2, 1 및 2배의 농도 범위로 노보비오신 표준품을 첨가한 다음 전처리하였다. 이를 HPLC 로 분석하여 Fig.
1% 개미산이 함유된 물/아세토니트릴 혼합액(40/60, v/v) 을 사용하였고 칼럼 온도, 검출기 파장, 이동상의 유량 및 시료 주입량은 각각 40℃, 340 nm, 1 mL/min 및 20 µL이었다. 검체 중 노보비오신을 확인하기 위하여 액체크로마토그래프-질량분석기 (HPLC-MS, Thermo Finnigan TSQ Quantum Ultra, Waltham, USA)를 사용하였다.
노보비오신을 분석하기 위하여 자외부흡광광도검출기(UVD, Ultraviolet Detector)가 장착된 액체크로마토그래프(High Performance Liquid Chromatograph, Shiseido Nanospace SI-2 HPLC set, Tokyo, Japan)를 이용하였으며 칼럼으로는 MG II C18 (4.6 mm i.d×250 mm, 5 µm, Shiseido, Tokyo, Japan)를 사용하였다.
노보비오신을 분석하기 위한 이동상의 조성을 결정하기 위해 순상크로마토그래피용 이동상은 먼저 제외하였으며(10), 역상 크로마토그래피에 적당한 완충용액으로 0.1% 인산(phosphoric acid)(11)와 0.1% 개미산(formic acid) 중 표준물질의 감도가 조금 더 좋은 0.1% 개미산을 선택하였다.
3종의 축산식품 시료 중 회수율 결과는 Codex 기준에서 규정하는 100 µg/kg 이상의 농도에서 허용되는 회수율의 범위 80-110% 를 만족하는 결과였다. 노보비오신을 확인하기 위하여 HPLC-MS 를 이용하였고 그 분석조건은 Table 1에 나타내었다. 분자량 500-700의 범위에서 노보비오신의 total ion chromatogram(TIC)과 mass spectrum을 Fig.
3분이었다. 닭고기, 소고기 및 우유 3종의 식품에 대하여 전처리 과정에서 메탄올로 추출 및 제단백하고, 무수황산나트륨으로 수분을 제거와 동시에 균질화하였다. 이를 헥산으로 포화된 메탄올과 메탄올로 포화된 헥산을 이용한 액-액분배법으로 비극성 물질들을 제거하고자 하였다.
닭고기와 소고기 시료 5 g에 노보비오신을 각각 0.5, 1.0과 2.0mg/kg 3개 농도가 되도록 표준품을 첨가하여 시료조제과정을 거쳐 분석하였다. 분석 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고 피크에 대한 평균면적을 구하여 검량선을 작성하여 시험용액 중 노보비오신의 함량을 구함으로써 회수율을 구하였으며, 6반복 실험하여 정확성과 정밀성을 평가하였다.
본 연구에서 수행된 모든 시험법의 효율 및 신뢰성을 검정하기 위하여 회수율 시험을 수행하였다. 동물용의약품이 잔류하여 있지 않은 시료에 각각의 분석 물질을 최대잔류허용기준(MRL) 의 1/2배, 1배, 2배 수준이 되도록 처리, 혼화하고 위의 분석과정을 행하여 회수율을 측정하였다. 각 실험은 여섯 번 반복되었다.
95 이상 이었다. 또한 정량한 계는 시료조제과정을 거친 유 시료에 표준품을 0.02 mg/kg 수준 으로 첨가하여 신호대 잡음비(S/N ratio)를 10 이상으로 하여 계산하였다(Fig. 5).
95이상 이었다. 또한 정량한계는 시료조제과정을 거친 닭고기와 소고기 시료에 표준품을 0.02 mg/kg 수준으로 첨가하여 신호대 잡음비(S/N ratio)를 10 이상으로 하여 계산하였다(Fig. 4).
본 연구에서 수행된 모든 시험법의 효율 및 신뢰성을 검정하기 위하여 회수율 시험을 수행하였다. 동물용의약품이 잔류하여 있지 않은 시료에 각각의 분석 물질을 최대잔류허용기준(MRL) 의 1/2배, 1배, 2배 수준이 되도록 처리, 혼화하고 위의 분석과정을 행하여 회수율을 측정하였다.
0mg/kg 3개 농도가 되도록 표준품을 첨가하여 시료조제과정을 거쳐 분석하였다. 분석 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고 피크에 대한 평균면적을 구하여 검량선을 작성하여 시험용액 중 노보비오신의 함량을 구함으로써 회수율을 구하였으며, 6반복 실험하여 정확성과 정밀성을 평가하였다. 그 결과, 확립한 분석법은 회수율이 닭고기는 92.
1 mg/kg 3개 농도가 되도록 표준품을 첨가하여 시료 조제과정을 거쳐 분석하였다. 분석 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고 피크에 대한 평균면적을 구하여 검량선을 작성하여 시험용액 중 노보비오신의 함량을 구함으로써 회수율을 구하였으며, 6번 반복 실험하여 정확성과 정밀성을 평가하였다. 그 결과, 확립한 분석법은 회수율이 89.
우유 시료 5 mL에 노보비오신을 각각 0.025, 0.05과 0.1 mg/kg 3개 농도가 되도록 표준품을 첨가하여 시료 조제과정을 거쳐 분석하였다. 분석 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고 피크에 대한 평균면적을 구하여 검량선을 작성하여 시험용액 중 노보비오신의 함량을 구함으로써 회수율을 구하였으며, 6번 반복 실험하여 정확성과 정밀성을 평가하였다.
이동상으로 개미산 0.1%가 함유된 물/아세토니트릴 혼합액(40/60, v/v)으로 기울기 용리를 하는 것이 노보비오신의 감도 및 분리능에 가장 우수하여 적용시켰고, 칼럼 온도, 검출기 파장, 이동상의 유량 및 시료 주입량은 각각 선행연구를 참고하여(6) 40℃, 340 nm, 1 mL/min 및 20 µL로 선택하였다.
축산 식품에 잔류하는 노보비오신의 분석 방법에서 시료전처리 조건, 고정상, 이동상 조성, 검출 파장 등을 변경하면서 최적의 감도, 간섭물질로부터 분리능, 머무름 시간 등을 설정하였다. 그 결과 개발한 분석 조건에서 얻은 무처리 시료와 표준 물질을 spike한 시료의 크로마토그램을 Fig.
대상 데이터
이를 아세톤/디클로로메탄 혼합액(10/90, v/v) 10 mL를 가하여 용해시킨 후 실리카 카트리지에 아세톤/디클로로메탄 혼합액(10/90, v/v) 5 mL를 넣고 유출시켰다. 고정상 상단이 노출되기 직전에 상기 아세톤/디클로로메탄 혼합액(10/90, v/v) 10 mL에 용해된 시료를 유출시킨 다음, 고정상 상단이 노출되기 직전에 아세톤/디클로로메탄 혼합액(10/90, v/v) 5 mL를 유출시키고, 고정상 상단이 노출되기 직전에 메탄올/아세톤 혼합액 (10/90, v/v) 10 mL를 용출시켜 시험관에 받았다. 이를 40 ℃ 이하의 수욕상에서 완전히 질소 농축한 다음 잔류물을 0.
노보비오신 표준품(93%)은 Dr. Ehrenstorfer GmbH(Augsburg, Germany)에서 구입하였고, 헥산, 메탄올, 디클로로메탄 및 아세토니트릴 등은 HPLC grade로써 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 무수황산나트륨은 Wako(Osaka, Japan)로부터, 실리카 카트리지(Silica, 1 g, 6 mL)은 Waters(Massachusetts, USA)로부터 구입하였다.
Ehrenstorfer GmbH(Augsburg, Germany)에서 구입하였고, 헥산, 메탄올, 디클로로메탄 및 아세토니트릴 등은 HPLC grade로써 Merck(Darmstadt, Germany)에서 구입하여 사용하였다. 무수황산나트륨은 Wako(Osaka, Japan)로부터, 실리카 카트리지(Silica, 1 g, 6 mL)은 Waters(Massachusetts, USA)로부터 구입하였다.
사용된 시료(닭고기, 소고기 및 우유 등)는 유통 대형마트에서 구입하여 사용하였으며, 축산물의 경우는 구입 후 각각 균질화한 후 폴리에틸렌 지퍼팩에 담아 −70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.
또한 실리카 카트리지를 이용한 정제 과정을 추가하여 다양한 시료들 에서 잔존하는 간섭물질들을 더 제거하고자 하였다. 예비 실험에서 HLB 카트리지를 이용하여 정제하고자 하였으나 회수율이 낮아 회수율이 높은 실리카 카트리지를 선택하게 되었다.
이동상으로 0.1% 개미산이 함유된 물/아세토니트릴 혼합액(40/60, v/v) 을 사용하였고 칼럼 온도, 검출기 파장, 이동상의 유량 및 시료 주입량은 각각 40℃, 340 nm, 1 mL/min 및 20 µL이었다.
데이터처리
닭고기와 소고기 시료로부터 노보비오신 0.1-5.0 mg/L의 농도에 대한 노보비오신의 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였으며, 각 검량선의 상관계수(correlation coefficient, r)를 구하였다. 노보비오신 표준용액 0.
우유 시료로부터 노보비오신 0.05-2.0 mg/L의 농도에 대한 노보비오신의 피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였으며, 각 검량선의 상관계수(correlation coefficient, r)를 구하였다. 노보비오신 표준용액 0.
이론/모형
축산식품 중에 잔류하는 노보비오신의 분석은 Lee 등(6)에 의해 선행된 연구를 참고하였고, 선행연구에서 피크의 폭과 대칭성이 우수한 ODS 칼럼을 사용한 것에 참고하여 MG II C18(4.6 mm I.D.×250 mm, 5 µm, Shiseido, Tokyo, Japan), 칼럼을 사용하였다.
성능/효과
3종의 축산식품 시료 중 회수율 결과는 Codex 기준에서 규정하는 100 µg/kg 이상의 농도에서 허용되는 회수율의 범위 80-110% 를 만족하는 결과였다.
분석 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고 피크에 대한 평균면적을 구하여 검량선을 작성하여 시험용액 중 노보비오신의 함량을 구함으로써 회수율을 구하였으며, 6번 반복 실험하여 정확성과 정밀성을 평가하였다. 그 결과, 확립한 분석법은 회수율이 89.9-92.4, 90.0-95.0, 82.3-93.2%이었으며, 상대표준편차가 1.0-4.8%로 만족할 만한 수준으로 평가되었다(Table 3).
분석 크로마토그램으로부터 머무름 시간을 비교하고 피크에 대한 평균면적을 구하여 검량선을 작성하여 시험용액 중 노보비오신의 함량을 구함으로써 회수율을 구하였으며, 6반복 실험하여 정확성과 정밀성을 평가하였다. 그 결과, 확립한 분석법은 회수율이 닭고기는 92.5-103.8, 83.8-105.7, 85.7-104.8%, 소고기는 94.3-101.4, 86.1-91.9, 84.5-102.7%, 상대표준편차가 닭고기는 4.4-7.9%, 소고기는 2.4-8.1%로 만족할 만한 수준으로 평가되었다(Table 2).
노보비오신의 검출파장 선택에 있어 문헌(12)에서는 254 nm와 340 nm를 사용하여 분석하였으나 본 연구에서는 Fig. 2에서 보는바와 같이 340 nm에서 좀 더 높은 감도를 확인 할 수 있었고, 간섭물질 대신 노보비오신의 피크가 뚜렷하게 관찰되어서 340 nm 로 검출파장을 선택하였다. Codex 기준(10)을 참고하여 닭고기, 소고기 및 우유 시료에서 MRL 수준의 1/2, 1 및 2배의 농도 범위로 노보비오신 표준품을 첨가한 다음 전처리하였다.
최근에는 다양한 축·수산물 식품에 새로운 분석방법을 도입하여 효율성과 신속성을 향상시켰지만, 몇몇 시료에서 회수율이 다소 감소한 결과를 보여주었다 (9). 따라서 본 연구에서는 3종의 축산 식품을 대상으로 효과적인 시료 전처리 방법과 최적의 정제 과정을 확립하였으며, 분석법 검증을 통하여 만족스러운 결과를 확인할 수 있었다.
후속연구
따라서 본 연구에서는 식품 중 잔류될 수 있는 노보비오신에 대하여 보편적인 HPLC-UVD를 사용하여 국제식품규격위원회(Codex) 기준에 부합하고 액-액분배법 등 정제과정을 추가하여 잔류물질의 감도를 높인 시험법을 개발하고자 하였으며, HPLCMS를 이용한 정성시험법도 확립하였다. 확립된 시험법은 동물용 의약품의 안전관리를 위한 공정시험법으로 활용될 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
노보비오신이란 무엇인가?
노보비오신은 동물용의약품 중 약산성 항생제이며, 우리나라의 경우 선진국에 비해 항생제의 사용이 높은 만큼 동물용의약품의 잔류 사례는 계속해서 증가하고 있다. 이에 따라 식품 중 잔류동물용의약품의 안전관리를 위해 축산 식품 중 닭고기, 소고기 및 우유에서 노보비오신에 대한 HPLC-UVD를 이용한 잔류 분석법을 확립하였다.
식품 중 잔류동물용의약품에 대한 관리는 언제부터 시작하였는가?
식품 중 잔류동물용의약품에 대한 관리는 1989년 잔류허용기 준을 설정하면서 시작되었으며 2011년 현재 143종에 대한 잔류 기준을 마련하면서 지속적으로 안전관리를 수행해오고 있다. 다만 국내에서 이미 사용 허가된 약품 중 잔류허용기준이 없거나 또는 제 외국에서 사용 중이나 우리나라에서 관리가 되지 않는 약품 등에 대해서는 잔류허용기준 설정이 요구되고 있으며, 과학이 발달하면서 기존의 잔류시험법 등을 개선하는 시험법 선진화가 추진되고 있는 실정이다(1).
잔류동물용의약품의 안전관리를 위해 축산 식품 중 닭고기, 소고기 및 우유에서 노보비오신에 대한 HPLC-UVD를 이용한 잔류 분석법을 확립한 이유는 무엇인가?
노보비오신은 동물용의약품 중 약산성 항생제이며, 우리나라의 경우 선진국에 비해 항생제의 사용이 높은 만큼 동물용의약품의 잔류 사례는 계속해서 증가하고 있다. 이에 따라 식품 중 잔류동물용의약품의 안전관리를 위해 축산 식품 중 닭고기, 소고기 및 우유에서 노보비오신에 대한 HPLC-UVD를 이용한 잔류 분석법을 확립하였다.
참고문헌 (12)
Shin HC. Planning study on the development of residue standardization for veterinary drugs. Report of NIFDS. Korea Food & Drug Administration, Osong, Korea. pp. 20-50 (2010)
Maxwell A. DNA gyrase as a drug target. Trends Microbiol. 5: 102-109 (1997)
Reeves VB. Liquid chromatographic procedure for the determination of novobiocin residues in bovine milk. interlaboratory study. J. AOAC. 78: 55-58 (1995)
French P. Venuti E. Fraimow HS. In vitro activity of novobiocin against multiresistant strains of Enterococcus faecium, Antimicrob. Agents Ch. 37: 2736-2739 (1993)
Montecalvo MA. Horowitz H. Wormser GP. Seiter K. Caronaro CA. Effect of novobiocin-containing antimicrobial regimens on infection and colonization with vancomycin-resistant Enterococcus faecium, Antimicrob. Agents Ch. 39: 794 (1995)
Lee BK. Lee CW. Lee SJ. Jung EH. Lin HK. Han SB. Determination of residual novobiocin in livestock products and fisheries products by HPLC, Anal. Sci. Technol. 20: 347-354 (2007)
Code of Federal Regulations. Title 21. Part 556.460. U.S. Government Printing Office. Washington, DC, USA (1992)
Kim HJ. Hwang LH. Joeng JH. Yoon ES. Park NW. Han IG. A study on determination of novobiocin residues in milk by high performance liquid chromatography, Korean J. Vet. Serv. 21: 261-266 (1998)
Inoue K. Nitta S. Hino T. Oka H. LC-MS/MS and centrifugal ultrafiltration method for the determination of novobiocin in chicken, fish tissues, milk and human serum. J. Chromatogr. B 877: 461-464 (2009)
Zuhowski EG. Gutheil JC Egorin MJ. Rapid and sensitive highperformance liquid chromatographic assay for novobiocin in human serum, J. Chromatogr. B 655: 147-152 (1994)
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