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문제 정의
- 이상에서 보는 바와 같이 지금까지 항균성 peptide류에 관한 연구는 천연물이나 동물성 단백 peptide에 한정되어 있을 뿐 식물성 저분자 peptide 에 대한 연구는 시도된 바 없다. 본인 등은 가격이 저렴한 밀 단백질을 기질로 저분자 peptide을 제조하여 실용적이고 인체에 무해한 항균제를 개발하고 식품소재로 이용가능성을 조사하기 위하여 밀 단백질인 gluten에 Aspergillus saitoi가 분비하는 protease를 가하여 반응시키고 얻어진 peptide를 분자량별로 분획하고 분자량별 항균활성 분획을 HPLC로 분취하여 얻어진 peptide의 아미노산 결합순서를 분석하여 새로운 결과를 얻었으므로 보고하는 바이다.
- 밀 단백질에 효소가수분해 할 때 생산되는 peptide의 항균활성과 천연항균제로서의 이용가능성을 검토하기 위하여 실험을 행하였다. 밀 단백질에 7종의 단백질가수분해효소를 작용시켜 생성된 가수분해물의 항균활성을 측정하고 한외여과, membrane filtration, HPLC를 이용하여 항균성 peptide를 분리 정제한 후 분자량과 아미노산 결합 순서를 측정한 결과는 다음과 같다.
제안 방법
- Gluten 10g, 증류수 100ml를 삼각 플라스크에 넣고 80℃에서 10분간 열 처리한 후, 이에 단백질 효소 분말 50mg을 넣어 37℃에서 6시간 진탕 반응시켜 80℃에서 5분간 열처리하여 효소를 파괴시킨 후 10,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상징액을 항균활성 측정용 시료로 하였다.
- 항균활성은 paper disc법(33)으로 측정하였다. Nutrient broth에 1.5%의 한천을 가하여 살균한 후 petri dish에 분주하여 기층 배지로 하고 이에 0.75% 한천 함유 nutrient 배지에 항균활성 피검균주를 107/ml의 농도가 되도록 가하여 중층 하였다. 이에 paper disc에 항균활성 피검 용액을 10㎕ loading 하고 건조한 후 반복하여 10회 loading 한후 nutrient agar 배지위에 놓고 멸균수 70㎕를 가하여 4℃의 냉장고에서 1시간 방치하여 paper disc 를 고정시켜 확산되도록 한 후, 37℃에서 48시간 배양하면서 paper disc 주위의 clear zone직경을 측정하여 항균력을 측정하였다.
- 75% 한천 함유 nutrient 배지에 항균활성 피검균주를 107/ml의 농도가 되도록 가하여 중층 하였다. 이에 paper disc에 항균활성 피검 용액을 10㎕ loading 하고 건조한 후 반복하여 10회 loading 한후 nutrient agar 배지위에 놓고 멸균수 70㎕를 가하여 4℃의 냉장고에서 1시간 방치하여 paper disc 를 고정시켜 확산되도록 한 후, 37℃에서 48시간 배양하면서 paper disc 주위의 clear zone직경을 측정하여 항균력을 측정하였다.
- Membrane filter(molecular weight cut-off 10,000, 3,000, 1,000)가 장착된 Amicon kit에 효소 반응액을 넣고 질소가스로 60 psi 압력을 가하여 분자량별로 분획하고 항균활성을 측정하였다.
- 항균활성을 가지고 있는 분자량 3,000이하의 것을 Sephadex G-25가 충진된 column(18mm × 750mm)에 loading 하고 3ml씩 분획하여 220nm, 280nm에서 흡광도를 측정하여 분획물을 얻었으며 이 분획물을 동결 건조하여 상기와 같은 방법으로 항균활성을 측정하였다.
- Gluten 효소 가수분해물을 분자량 3,000 이하의 membrane filter로 여과하여 이를 다음 같은 HPLC 분석 조건으로 gradient 하였으며 유출시간별 유출물을 분획수집기로 수집하여 질량과 항균 활성을 측정하였다.
- Gluten 효소 가수분해물을 HPLC로 분취하여 각 분획물의 mass spectrum을 applied biosystem MALDI-TDF, STR Voyager model, Matrix : α-cyanohydroxy cinnamic acid, reflactor mode, accelerating voltage : 25,000 의 조건으로 분석하였다.
- Gluten의 효소 가수분해물을 HPLC로 분취하여 항균활성을 나타내는 peak 분획물의 아미노산 결합순서를 Hewlitt Packard G 1000A automated protein sequencer, automated Edman chemistry에서 liquid peptide sample을 2% TFA로 loading하여 method 3.5 방법으로 분석하였다.
- 항균활성을 가지는 가수분해물로부터 분자량 3,000 이하를 분획하여 용액상태로 한 다음 80℃에서 10분, 100℃에서 10분, 121℃에서 15분 열처리하여 항균활성을 비교하였다.
- Gluten 현탁액을 80℃에서 5분간 열처리하여 Asp. saitoi protease를 가하고 pH 6.7, 45℃에서 진탕반응 시키면서 반응 시간에 다른 가수분해율과 항균활성을 측정한 결과는 다음과 같았다.
- 밀 gluten에 Asp. saitoi protease로 작용시킨 가수분해물의 항균성 물질을 분리, 정제하기 위하여 ultrafiltration 분획, gel 여과, HPLC를 행한 결과는 다음과 같았다.
- 효소 가수분해물의 항균성 물질을 Sephadex-G 25로 여과하여 3 ml씩 분취하고 220nm, 280nm에서 흡광도를 측정하고 각 분취물을 모아 poly ethylene glycol 6,000으로 농축하여 항균활성을 측정하였다. 그 결과는 Fig.
- Gluten 효소 가수분해물의 gel 여과 유출물을 peak 별로 동량 분취하여 항균활성을 측정한 결과 F2 분획에서 항균활성을 확인할 수 있었다. Gel 여과는 ultrafitration membrane에 비하여 효율적 으로 분획이 어렵기 때문에 차후의 실험에서는 membrane filter를 이용하여 분획하였다.
- 효소 가수분해물을 분자량 3,000 cut-off membrane filter로 여과하여 얻어진 여액의 HPLC chromatogram는 Fig. 4와 같았으며 여러 차례로 반복하여 분취하고 이의 항균활성을 측정하였다.
- 항균활성을 가지는 gluten 가수분해물을 용액 상태로 한 다음, 80℃에서 10분간, 100℃에서 10분간, 121℃에서 15분간 각각 열처리 한 후, 그람 양성균의 항균활성을 측정하고 열에 대한 안정성을 비교하였다. 그 결과는 table 9와 같았다.
- 밀 단백질에 효소가수분해 할 때 생산되는 peptide의 항균활성과 천연항균제로서의 이용가능성을 검토하기 위하여 실험을 행하였다. 밀 단백질에 7종의 단백질가수분해효소를 작용시켜 생성된 가수분해물의 항균활성을 측정하고 한외여과, membrane filtration, HPLC를 이용하여 항균성 peptide를 분리 정제한 후 분자량과 아미노산 결합 순서를 측정한 결과는 다음과 같다. 밀 단백질에 7종의 단백질 분해효소를 적용시켜 제조한 가수분해물중 Asp.
대상 데이터
- 1) 밀 단백질인 gluten, Aspergillus saitoi protease (EC 3.4.23.18), pepsin(porcine stomach, EC 3.4.23.1), trypsin(porcine pancreas, EC 3.4.21.41), α-chymotrypsin(bovine pancreas, EC 3.4.21.1), bromelain(pineapple stem, EC 3.4.22.32), Strypomyces griseus protease, Bacillus lichenifomis protease는 Sigma사 제품을 사용하였으며 ultrafilteratin cell(Amicon)과 membrane은 regenerated cellulose (molecular weight cut-off 10,000 3,000 1,000) Millipore사 제품, Sephadex G-25는 Pharmacia사 제품, 항균활성 측정용 paper disc(9mm)는 Toyorhoshi사 제품, 기타 시약은 특급 분석용 시약을 사용하였다.
- 2) 항균활성 측정용 균주는 Escherichia coli ATCC 10536, Staphylococcus aureus ATCC 6633, Streptococcus faecalis ATCC 13301, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894, Bacillus subtilis ATCC 11778, Salmonella typhimurium ATCC 14028을 사용하였다.
이론/모형
- 2) 가수분해율 측정 (degree of hydrolysis, DH) 효소에 의한 gluten의 가수분해정도는 Yamashita 등(31)의 방법으로 측정하였다.
- 즉, 100ml의 물에 gluten 10g을 넣어 현탁 시키고 micro-Kjeldahl 법(32)에 따라 질소를 정량하고 효소로 작용시킨 gluten 가수분해물 10ml에 동량의 10% TCA 용액을 가하고 12,000g에서 15분간 원심분리 하여 상징액 중의 질소를 정량하여 가수 분해율을 표시하였다.
- 항균활성은 paper disc법(33)으로 측정하였다. Nutrient broth에 1.
성능/효과
- Table 3 과 4에서 보는 것과 같이 gluten 효소 가수분해물의 항균력은 Asp. saitoi protease로 가수분해시킨 것이 가장 높았으며 효소의 종류에 따라 항균활성에 심한차이가 있었다. gluten에 미생물 기원의 단백질 가수분해 효소를 작용하였을 때 항균성 peptide을 생산하는 것으로 보아, 밀 단백질 가수분해물은 곰팡이 protease를 이용하는 고단백질 식품의 보존에 유용한 보존제로서의 가능성이 있을 것으로 생각되었다.
- saitoi protease로 가수분해시킨 것이 가장 높았으며 효소의 종류에 따라 항균활성에 심한차이가 있었다. gluten에 미생물 기원의 단백질 가수분해 효소를 작용하였을 때 항균성 peptide을 생산하는 것으로 보아, 밀 단백질 가수분해물은 곰팡이 protease를 이용하는 고단백질 식품의 보존에 유용한 보존제로서의 가능성이 있을 것으로 생각되었다. Tomita 등(37)은 인간 및 소의 lactoferrin에 pepsin을 작용시켜 얻어진 peptide 물질을 lactoferricin이라 명명하고 Gram 양성, Gram 음성 균주에 대하여 강한 항균활성을 나타내었다고 보고한 바 있다.
- Manachini 등(26)의 Bac. licheniformis protease가 50～60℃에서 잘 작용한다는 보고와 비교해 볼 때, 효소의 종류에 따른 작용 최적 온도가 각기 다름을 알 수 있었다.
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 분자량 1,000이상의 분획에서 항균활성이 있었고 1,000이하에서는 항균활성이 나타나지 않는 점으로 보아 분자량 1,000-3,000의 peptide가 항균활성이 있는 것으로 확인할수 있었다. 각 분획물의 수율은 효소반응 원액이 반응 기질에 대하여 56.
- 2에서 보는 바와 같이 분자량 1,000이상의 분획에서 항균활성이 있었고 1,000이하에서는 항균활성이 나타나지 않는 점으로 보아 분자량 1,000-3,000의 peptide가 항균활성이 있는 것으로 확인할수 있었다. 각 분획물의 수율은 효소반응 원액이 반응 기질에 대하여 56.8%, 분자량 10,000 이하의 분획물이 32.6%, 분자량 3,000이하 분획물이 26.3%, 분자량 1,000 이하의 분획물이 20.5%로서 비교적 높은 수준이었다. 또한, 가수분해물과 membrane filter 여과물에 공존하고 있는 peptide의 분포를 확인하기 위하여 membrane filter로 여과시켜 본 결과 분자량 cut-off 별로 분획되었음을 알 수 있 었다.
- 5%로서 비교적 높은 수준이었다. 또한, 가수분해물과 membrane filter 여과물에 공존하고 있는 peptide의 분포를 확인하기 위하여 membrane filter로 여과시켜 본 결과 분자량 cut-off 별로 분획되었음을 알 수 있 었다.
- Gluten 효소 가수분해물의 gel 여과 유출물을 peak 별로 동량 분취하여 항균활성을 측정한 결과 F2 분획에서 항균활성을 확인할 수 있었다. Gel 여과는 ultrafitration membrane에 비하여 효율적 으로 분획이 어렵기 때문에 차후의 실험에서는 membrane filter를 이용하여 분획하였다.
- Gluten의 효소적 가수분해물의 HPLC 유출물을 retention time 1～3분 간격으로 반복하여 분획한다음 항균 활성을 측정한 결과 retention time 31.1-31.8min에서 활성이 나타났다.
- 03으로 측정되었다. 본 실험에서 얻어진 항균성 물질의 질량은 Dionysius 등(20)이 보고한 lactoferrin의 질량 3,195, 2,673, 5,851보다 적었으며 Pellegrini(22)이 보고한 lactoglubulin의 trypsin 가수분해물인 항균성 peptide보다는 큰 것이었다. 또한, 항균성 peptide의 아미노산 결합 순서를 HP G1000 A automated protein sequence를 측정한 결과는 Fig.
- Gluten을 가수분해하였을 때 생산되는 항균성 peptide의 열에 대한 안정성을 실험해 본 결과, 열에 대해 대단히 안정함을 알 수 있었다. 즉, 100℃에서의 열처리와 121℃에서 15min 열처리에 의해서도 두 균주의 생육 저해환의 크기가 대조구와 비슷한 것으로 보아 gluten의 Asp.
- 밀단백 효소가수분해물은 membrane filtration에 의하여 분자량 1,000～3,000에서 항균활성이 나타났다. Membrane filtration으로 얻어진 항균활성분획을 HPLC로 분리한 결과 retention time 31.1～31.8 min에서 항균활성을 나타내었다. 밀단백 효소가수분해물은 121℃에서 15분간 가열하여도 효소활성이 유지되는 매우 안정한 화합물이었다.
후속연구
- 본 실험의 결과는 값이 저렴한 식물성 단백질과 미생물 기원의 protease를 이용하여 항균성 peptide 를 생산하는데 기초 연구자료로서 활용될 것이며, 단백질 가수분해물의 항균성에 대한 지금까지 타 연구자들의 연구가 시도된 바 없어 결과의 비교가 어려웠다.
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