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문제 정의
- 위와 같이 피부 화상으로 유도되는 간 손상에 대한 연구 보고들이 외국에서 발표된 사례가 있으나, 국내의 화 상 연구는 거의 찾아보기 힘들뿐만 아니라 아직까지 화상으로 인한 타 장기의 손상기전은 명확히 밝혀지지 않고 있는 실정이다. 따라서 본 실험에서는 상술한 보고들을 근거로 보아 화상으로 인한 손상기전은 유해산소의 생성계 효소와 해독계 효소의 변화가 무엇보다 우선되리라는 가정 하에 횐쥐를 이용하여 피부 화상을 유도한 다음 생화학적 정량법을 통해 간 조직의 손상기전을 검토해 보고자 하였다.
- 화상 시 타 장기에 미치는 원인을 파악하는 것은 시급히 해결해야 할 문제로 받아들여지고 있다. 이에 본 실험에서는 횐쥐를 이용하여 화상을 유발(30% TBSA)시킨 다음, 피부 조직 자체의 손상 변화를 유해산소 생성계 및 해독계 효소의 활성 변화를 통하여 알아보고자 하였다. 그리고 피부화상으로 인한 간 조직의 손상을 유도하는 원인을 알아보기 위해, 간 조직 내 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성변화을 관찰하였다.
제안 방법
- 실험동물은 Sprague-Dawley종 수컷횐쥐를 대한실험동물사로부터 구입하여 실험동물용 고형사료(삼양사)와 물을 충분히 공급하면서, 실내 온도 20±2℃, 습도 60±5 %, 그리고 day/night 자동조절장치가 부착된 사육실에서 1주일간 적응사육을 시켰다. 화상 유발은 체중 300g 내외의 외견상 건강한 횐쥐를 ketamine hydrochloride로 마취시킨 다음, Spector (1956)의 계산법에 따라 등쪽면의 털을 깎고 (30% of TBSA： total body surface area) 100℃물로 10초간 데인 후 각각 5시간과 24시간 후에 처치하였다. 대조군은 같은 방법으로 마취 후 등쪽면의 털을 깎고 22℃ 물로 10초간 담근 후 각각 5시간 후와 24시간 후에 처치하였다.
- 화상 유발은 체중 300g 내외의 외견상 건강한 횐쥐를 ketamine hydrochloride로 마취시킨 다음, Spector (1956)의 계산법에 따라 등쪽면의 털을 깎고 (30% of TBSA： total body surface area) 100℃물로 10초간 데인 후 각각 5시간과 24시간 후에 처치하였다. 대조군은 같은 방법으로 마취 후 등쪽면의 털을 깎고 22℃ 물로 10초간 담근 후 각각 5시간 후와 24시간 후에 처치하였다.
- 실험동물은 처치 24시간 전부터 물만 공급하였으며, 동물의 처치는 일중 변동을 고려하여 일정 시간에 실시하였는데, ether 마취 하에 복부 정중선을 따라 개복한 다음 복부대동맥으로부터 채혈하여 실혈사시킨 후, 피부 조직과 함께 4P 생리식염수로 간 문맥을 통하여 간을 관류하여 간 내에 남아있던 혈액을 제거한 다음 적출하였다. 피부조직은 화상중앙부를 6cm2 크기로 절취하여 각각을 효소 활성도 측정에 사용하였다.
- 간과 피부 조직 내 GSH의 함량 측정은 Ellman (1959)의 방법에 준하였다. 조직 마쇄 균질액 일정량에 4% sulfosalicylic acid 0.5㎖를 가하고 원심분리한 후, 상등액 일정량을 0.1mM 5,5' -dithio-bis(2- nitrobenzoic acid)함유 0.1M 인산완충액 (pH 8.0)에 넣고 반응시켜 생성된 p-nitrothiophenol을 측정하였다. GSH 함량은 조직 g 당 μmol로 표시 하였다.
- (1979)의 방법에 준하였다. 즉 효소시료 속의 과산화지질을 산성조건하에서 thiobarbituric acid 용액과 가열 반응시켜 생긴 물질을 532nm에서 흡광도를 측정하였다. 단위는 조직 lg 당 nmole MDA(malondialdehyde)로 표시하였다.
- 이 마쇄균질액을 초원심 분리기로 fractionation하여 mitochondia 분획과 cytosol 분획을 얻었다. 이 중 mitochondria 분획은 catalase의 활성도 측정에 사용하였으며, cytosol 분획은 xanthine oxidase, glutathione peroxidase, glutathion S-transferase, 그리고 superoxide dismutase의 활성도 측정에 사용하였다.
- 간과 피부조직 내 GPx의 활성도 측정은 cytosol 분획을 사용하여 Paglia and Valentine (1967)의 방법에 준하였다. Glutathione 기질과 조효소인 NADPH를 시료와 함께 25P에서 5분 동안 반응시켜 340nm에서 흡광도의 변동을 측정하였다. 활성도 단위는 단백질 1㎎이 1분 동안 산화시킨 NADPH 양을 nmole로 표시 하였다.
- (1974)의 방법에 준하였다. l-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)과 glutathione을 기질로 하여 25℃에서 10분간 반응시키는 동안 생성된 2,4-dinitrobenzene-glutathione conjugate 양을 340nm에서 측정하였다. 활성도 단위는 효소 반응액 중에 함유된 단백질 lmg이 1분 동안 반응하여 생성시킨 conjugate의 양을 nmole로 나타내었다.
- 화상 유발 24시간 후 피부조직 중에 유해산소로 인한 산화적 손상이 초래되었는지를 검토하기 위해 유해산소 생성계 효소인 XO와 해독계 효소인 SOD, catalase, GPx, 그리고 GST의 활성변동은 Table 2. Fig 2와 같다.
- 본 실험은 MODS가 매우 짧은 시간 내에 진행되므로 유발인자를 검출하기 위해서는 화상의 초기 변화를 대상으로 하여야 한다. 따라서 24시간 내의 변화만을 분석하였으며, 다양한 원인인 자들 간의 차이는 있지만 화상 후 5시간 후부터 내부 장기에 뚜렷한 염증성 손상 변화가 나타나기 때문분석의 지표를 화상 유발 후 5시간, 24시간으로 하였다.
- 화상에 의한 피부 손상이 간에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흰 쥐를 이용하여 피부 화상을 유도한 다음 각각 5시간, 24시간 후생화학적 정량법을 통해 간 조직 손상의 발병 기전을 검토해 보고자 하였다. 흰쥐의 화상 유발은 등쪽면의 털을 깎고 (total body surface area 30%) 100℃ 물로 10초간 흡입 손상 없이 피부 화상만을 가하였다.
- 화상에 의한 피부 손상이 간에 미치는 영향을 알아보기 위하여 흰 쥐를 이용하여 피부 화상을 유도한 다음 각각 5시간, 24시간 후생화학적 정량법을 통해 간 조직 손상의 발병 기전을 검토해 보고자 하였다. 흰쥐의 화상 유발은 등쪽면의 털을 깎고 (total body surface area 30%) 100℃ 물로 10초간 흡입 손상 없이 피부 화상만을 가하였다. 생화학적 정량으로는 피부조직, 혈청, 간 조직 내 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성변화를 측정하였다.
- 흰쥐의 화상 유발은 등쪽면의 털을 깎고 (total body surface area 30%) 100℃ 물로 10초간 흡입 손상 없이 피부 화상만을 가하였다. 생화학적 정량으로는 피부조직, 혈청, 간 조직 내 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성변화를 측정하였다.
- 이에 본 실험에서는 횐쥐를 이용하여 화상을 유발(30% TBSA)시킨 다음, 피부 조직 자체의 손상 변화를 유해산소 생성계 및 해독계 효소의 활성 변화를 통하여 알아보고자 하였다. 그리고 피부화상으로 인한 간 조직의 손상을 유도하는 원인을 알아보기 위해, 간 조직 내 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성변화을 관찰하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 Sprague-Dawley종 수컷횐쥐를 대한실험동물사로부터 구입하여 실험동물용 고형사료(삼양사)와 물을 충분히 공급하면서, 실내 온도 20±2℃, 습도 60±5 %, 그리고 day/night 자동조절장치가 부착된 사육실에서 1주일간 적응사육을 시켰다. 화상 유발은 체중 300g 내외의 외견상 건강한 횐쥐를 ketamine hydrochloride로 마취시킨 다음, Spector (1956)의 계산법에 따라 등쪽면의 털을 깎고 (30% of TBSA： total body surface area) 100℃물로 10초간 데인 후 각각 5시간과 24시간 후에 처치하였다.
데이터처리
- 각 실험군 간의 비교를 위한 통계처리는 유의 수준 0.05로 하는 Student- Newman-Keuls multiple cpmparison test를 실시하였다.
이론/모형
- 간과 피부 조직 내 GSH의 함량 측정은 Ellman (1959)의 방법에 준하였다. 조직 마쇄 균질액 일정량에 4% sulfosalicylic acid 0.
- 간과 피부 조직 중과산화지질 함량 (lipid peroxide)은 Ohkawa et al.(1979)의 방법에 준하였다. 즉 효소시료 속의 과산화지질을 산성조건하에서 thiobarbituric acid 용액과 가열 반응시켜 생긴 물질을 532nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 간과 피부조직 내 GST의 활성도 측정은 cytosol 분획을 사용하여 Habig et al.(1974)의 방법에 준하였다. l-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB)과 glutathione을 기질로 하여 25℃에서 10분간 반응시키는 동안 생성된 2,4-dinitrobenzene-glutathione conjugate 양을 340nm에서 측정하였다.
- 간과 피부조직 내 GPx의 활성도 측정은 cytosol 분획을 사용하여 Paglia and Valentine (1967)의 방법에 준하였다. Glutathione 기질과 조효소인 NADPH를 시료와 함께 25P에서 5분 동안 반응시켜 340nm에서 흡광도의 변동을 측정하였다.
- 간과 피부조직 내 GST의 활성도 측정은 cytosol 분획을 사용하여 Habig et al.(1974)의 방법에 준하였다.
- 간과 피부조직 mitochondria 분획의 catalase 활성도 측정은 hydrogen peroxide를 기질로 하여 환원되는 정도를 240nm에서 흡광도를 읽고 분자 흡광계수 (0.041mM-1•cm-1)를 이용하여 활성을 산출하는 Aebi(1974)의 방법에 준하였다. 활성도 단위는 조직효 소액 중에 함유된 단백질 lmg이 1분 동안에 반응하여 감소시킨 H2O2 양을 nmole로 표시하였다.
- 간과 피부조직의 cytosol 분획 내 SOD의 활성도는 hematoxylin 자동산화의 억제 정도를 관찰하는 Martin et al.(1987)의 방법에 준해 0.1mM EDTA가 함유된 50mM인산완충액 (pH 7.5)에 10μM hematoxylin 및 효소액을 가해 2SC에서 반응시켜 생성된 hematein을 560nm에서 측정하여 효소의 활성을 산정하였다. 활성도 단위는 효소액을 넣지 않고 반응시킨 액 중의 hematoxylin의 자동산화를 50% 억제하는 정도를 1 unit로 나타내었다.
성능/효과
- 유해산소해독계 효소인 GPx의 기질인 GSH의 함량과 유해산소에 의한 지질과 산화산물인 LPO의 함량 변동을 측정한 결과는 Table 1, Fig 1에 나타내었다. GSH의 함량은 화상 유발 24시간 후 대조군과 비교하여 0.541 ±0.244에서 0.284±0.020으로 47.50%로 급격한 감소를 나타내었고, LPO의 함량은 화상 유발 24시간 후 대조군의 함량과 비교하여 볼 때 6.939±1.101에서 9.509±2.694로 37.01% 증가되었으나 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
- 화상으로 인한 간 조직 내 유해산소 conjugator인 GSH의 함량과 지질과 산화물의 생성양상을 알아보기 위해, 간 조직 중의 GSH와 LPO의 함량 변동을 측정한 결과는 Table 3, Fig 3과 같다. 간 조직 중의 GSH와 LPO는 모두 화상 후 5시간군에서 감소되었다가 24시간 군에서 증가되는 양상을 보였는데. GSH는 5시간 군이 0.
- 하지만 각 군 간의 유의한 차이는 보이지 않았다. SOD 의 경우 화상 후 24시간 군에서 27.82±2.65에서 31.04 ±2.43으로 11.57% 증가되었고, catalase는 5시간군에서 70.15±3.99에서 65.15±5.38로 7.13%, 24시간 군에서는 70.14±6.이에서 52.79±1.49로 24.74% (p<0.05) 감소 되었다. GPx의 활성은 각 군 간의 활성차이는 거의 보이지 않은 반면 GST의 경우 약간의 변화를 보였는데, 대조군과 비교하여 화상 후 5시간군에서는 488.
- 05) 감소 되었다. GPx의 활성은 각 군 간의 활성차이는 거의 보이지 않은 반면 GST의 경우 약간의 변화를 보였는데, 대조군과 비교하여 화상 후 5시간군에서는 488.50±45.51에서 562.75±25.22로 15.20% 증가되었으나 24시간 군에서는 오히려 0.59% 감소되어 나타났다.
- 화상손상을 받은 피부조직에서 나타난 GSH와 LPO 함량 변화를 살펴보면, GSH의 함량은 47.50% 감소되었으나 지질과 산화물의 함량은 대조군과 비교하여 1.37배 증가되어 나타났다. 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성 변화에서는 생성계 효소인 XO의 활성이 화상 24시간 후 61.
- 37배 증가되어 나타났다. 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성 변화에서는 생성계 효소인 XO의 활성이 화상 24시간 후 61.40%의 현저히 감소 (p〈0.001)되어 나타났다. 해독계 효소들의 변화를 살펴보면 대조군과 비교하여 볼 때 SOD는 36.
- 001)되어 나타났다. 해독계 효소들의 변화를 살펴보면 대조군과 비교하여 볼 때 SOD는 36.55% (p<0.001), GST는 51.97% (p〈0.001)의 활성감소를 보였고, catalase 활성도는 대조군과 비교하여 5.53배(p<0.05) 증가 되어 나타났다. 화상에 의한 이러한 변화는 언급된 바 없으나, 화상에 의한 직접적인 단백질의 변성과 상피조직의 손상으로 인한 결과로 여겨지며, 피부조직 내 산화-항산화 작용의 불균형이야기되었음을 알 수 있었다.
- 따라서 일반적으로 이와 같은 유해산소 생성계 및 해독계 효소들의 불균형은 조직 내 유해산소의 축적의 결과를 초래하여 조직 손상을 일으키는 것으로 알려져 있다(Leibovitz and Siegel, 1980； Freemann and Crapo, 1982).본 실험에서 유해산소해독에 관여하는 효소 및 생리활성 물질을 측정한 결과, 화상 유발 24시간 후에 피부조직 내 GSH의 함량은 감소되었고 LPO의 함량은 증가되었다. 이러한 결과는 화상에 의해 유해산소인 superoxide, hydrogen peroxide 및 hydroxyl radical이 조직 내 축적된 것으로 생각되며, 더욱이 SOD와 GST의 활성이 감소된 것은 유해산소의 축적과 함께 해독계 효소 기능의 저하로 지질과산화 반응이 가중되었기 때문으로 생각된다.
- 간 조직 내 GSH 함량은 대조군과 비교하여 화상 후 5시간군이 60.71% (p<0.01), 24시간 군은 41.90% (p<0.01) 감소 되었고, LPO의 함량은 변화가 없었다. 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성은 간 조직 내 유해산소 생성계 효소인 XO의 활성은 화상 유발 5시간 후 51.
- 01) 감소 되었고, LPO의 함량은 변화가 없었다. 유해산소 생성계 효소와 해독계 효소의 활성은 간 조직 내 유해산소 생성계 효소인 XO의 활성은 화상 유발 5시간 후 51.14%, 24시간 후 14.66%의 감소율을 보였다.
- 결론적으로 본 실험과 다른 연구자들의 보고들로부터 유추해 볼 수 있는 가설은 유해산소해독계 효소인 SOD 의 활성을 저하시켜 피부조직 내 유해산소의 축적을 유도하고 지질 과산화물의 생성을 증가시키게 된다(Cetikale et al., 1997). 화상자극은 급성 염증반응을 유도하게 되어 헐관의 충혈과 histamine과 같은 혈관투과성 증대 물질의 유리(Till et al.
- 하지만 화상은 면역억제 (Peter et al., 1999)와 조혈 작용의 변화 (Faunce et al., 1999X 초래하여 MODS를 심화시키는 등 실로 다양하고 복잡한 경로를 통해 이루어지고 있는 것이 사실이지만 본 실험 결과를 통해서 볼 때, 간 조직 자체에서도 산화적 손상이 유발되는데 그것은 GSH의 함량 감소와 catalase의 활성 저하에 의한 유해산소 생성계와 해독계의 불균형 때문인 것으로 나타났다.
- 실험 결과, 화상 후 피부조직 내 glutathione의 함량은 감소(47.50%)된 반면 지질과 산화물 함량은 증가(37.01%)되었다. 그리고 superoxide dismutase의 활성이 감소(p〈0.
- 01%)되었다. 그리고 superoxide dismutase의 활성이 감소(p〈0.001)되어 유해산소 해독계 기능의 감소로 피부조직의 산화적 손상이유도되었음을 알 수 있었다. 간 조직의 경우 화상 유발 후 glutathione의 함량이 감소(p〈0.
- 001)되어 유해산소 해독계 기능의 감소로 피부조직의 산화적 손상이유도되었음을 알 수 있었다. 간 조직의 경우 화상 유발 후 glutathione의 함량이 감소(p〈0.01)되고 catalase의 활성 역시 감소(p〈0.05)되어, 유해산소 해독계 효소의 활성 감소에 의한 유해산소 생성계와 해독계 효소사이의 불균형이 초래된 것으로 나타났다.
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