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문제 정의
- 현재까지 국내에서는 humanized xenomouse를 제작하려는 시도가 본격적으로 진행되지 않고 있으며 이는 기술상의 어려움뿐만 아니라 특허 문제 및 긴 연구 개발기간과 막대한 연구비의 투자가 선행되어야 하기 때문이라고 생각된다. 본 연구는 humanized xenomouse를 제작하는 데 필수적인 homologous IgH 및 L knockout mouse를 제작하기 위한 기초 연구를 처음으로 수행했다는 데 큰 의미가 있으며 앞으로 IgH knockout 배아줄기 세포의 선별이 끝난 후 IgH knockout mouse의 제작을 시도하고자 한다.
- 본 연구에서는 인간 단일클론 항체의 생산을 위해 사용되는 humanized xenomouse의 제작에 가장 먼저 사용되는 생쥐 Ig 유전자 적중 생쥐의 제작을 위한 유전자 적중 construct를 제작하였다.
- 인간화된 항체 이식 생쥐(humanized xenomouse)는 효과적인 인체 질환의 진단 및 치료 항체 개발을 위한 인간 단클론 항체의 제작에 매우 유용한 도구로 사용될 수 있음은 이미 여러 문헌상에 잘 증명되어 왔으며 그 산업적 가치 역시 충분히 인정되어 왔다(25). 이러한 고부가 가치 상업성을 지닌 humanized xenomouse의 제작을 위한 기초 연구로서 humanized xenomouse의 제작에 쓰이는 IgH 및 L chain knockout mice를 만드는 데 필수적인 mouse IgH 및 L knockout construct를 제작하고자 시행되었다. 우선 mouse IgH knockout construct를 제작하는 데 연구의 초점을 맞추었으며 현재 mouse IgH knockout construct를 pPNT vector를 이용하여 제작하였고 이 construct의 IgH knockout 기능을 in vitro assay를 통해 확인하고자 D3 배아줄기 세포 내로 도입하여 positive 및 negative selection을 진행 중에 있다.
제안 방법
- 7%의 agarose gel로 확인하였다. 1차 검색 결과 positive band가 나타난 줄과 열이 일치하는 well을 같은 조건으로 PCR 하여 signal이 강하게 나온 well을 선택하여 상기와 같은 방법으로 바이러스를 다시 96 well plate에 분주하여 PCR과 Southern blot을 실시함으로써 이차 검색을 시행하였다.
- 줄과 열이 일치하는 positive well은 plate #1에서 17개였고 plate #2에서 18개였으며 이 중 6개 정도가 강한 band가 나타났다(data not shown). 1차 검색에서와 마찬가지로 PCR 결과에서는 보이지 않던 band가 southern blot에서 많이 나타났고 negative control에도 PCR에서 보이지 않던 band가 나타났지만 1차 검색에서 PCR 결과와 southern blot의 결과가 일치하였고 2차 검색에서도 거의 일치하는 결과를 보였으므로 positive control lane에서의 over loading에 의해 나타난 것으로 판단하고 이 중 가장 signal이 강한 1번 plate 7번 well의 positive clone을 선택하여 3차 single plaque의 검색을 진행하였다(data not shown).
- Homologous recombination된 배아줄기 세포의 선별. 24시간 동안 배양한 후 4개의 plate는 300μg/ml의 G418 (Sigma Co.)과 2μM의 ganciclovir를 ES DMEM-15 배지에 첨가하여 선별을 시작하였고, 1개의 plate는 300μg/ml 의 G418만을 첨가하여 선별함으로써 선별 비율을 알아보기 위한 대조군으로 사용하였는데 선별을 시작한 후 5일 동안은 매일 배지를 교체하였고 5일 이후부터는 2일에 한번씩 배지를 교환하면서 10일 동안 선별을 실시하였다. 9일째 되는 날 불활성화된 feeder cell을 48 well plate에 분주하여 10일째에는 이 plate의 배지를 ES DMEM-15로 교체하여 주고, 24 well plate에는 LIF가 첨가되지 않은 ES DMEM-15를 넣어 준비해 둔 다음 96 well plate에는 80μl의 0.
- Positive λ phage의 획득. 2차 검색에서 획득된 positive well의 바이러스를 E. coli에 감염시켜 plaque을 형성시킨 후 각각의 plaque을 sterile pasteur pipet (Corning, USA)으로 분리해낸 후 SM buffer에서 약 2시간 동안 바이러스를 방출시켜 같은 조건으로 PCR을 수행하여 생쥐 Ig 중 사슬과 경사슬 유전자 절편이 삽입되어 있는 바이러스 클론을 획득하였다(20). 최종적으로 획득된 Ig 중사슬과 경사슬 phage 클론으로부터 먼저 Ig 중사슬 phage 클론의 λ DNA를 분리해 내기 위해 phage 입자를 O/N culture 한 XL1-blue MRA P2 배양액 1 ml과 혼합하여 R/T에서 20분간 배양한 후 50℃의 top agar 10 ml을 첨가하여 잘 섞어 준 다음 150 mm plate (Corning)에 plating하여 37℃ 에서 O/N 배양함으로써 증식시켰다.
- 준비된 insert과 벡터를 UV spectrophotometer (Pharmacia Biotech, Sweden)로 260 nm에서 정량한 후 T4 DNA ligase (Promega) 처리하여 16℃에서 O/N ligation한 반응액 1μl을 XL-1 blue competent cell에 잘 섞어준 다음 얼음에 30분 방치하고 42℃에서 90초간 열충격을 주는 방법으로 transformation 하였다. 800μl의 LB 배지를 가하여 37℃ 에서 1시간 동안 배양한 후 LB/Amp plate에 plating한 후 37℃에서 O/N 배양하여 형성된 콜로니를 무작위적으로 30개 선별한 다음 LB/Amp 배지에서 배양한 배양액으로부터 plasmid를 분리하고 Not I 제한 효소로 절단하여 14 kb의 insert를 확인하였다.
- coli XL1-blue MRA P2 배양액 l ml과 129/SV λ genomic library의 106 phage를 혼합하여 상온에서 20분간 배양한 다음 10 mM MgSO4가 포함된 LB 20 ml에 희석하여 96-well plate (Corning, USA)의 각 well에 100μl씩 분주한 후 37℃ 진탕배양기에서 5～6시간 배양시켰다. 96-well plate의 A～H, 1～8 줄별로 각 well의 배양액을 모아 5분간 원심 분리한 상등액에 포함되어 있는 phage를 주형으로 하여 생쥐 중사슬 Ig Cµ와 경사슬 Ig Cκ에 특이적인 PCR primers (Cµ sense primer: 5'-AGAGTCAGTCCTTCGCAAATGT-3', anti-sense primer: 5'-GCACATGCAGATCTCTGTTTTT-3', Cκ sense primer: 5'-CTGCACCAACTGTATCCATCTT-3', anti-sense primer: 5'-CACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3')와 Ex Taq polymerase premix (Takara, Japan)로 94℃ 1분, 61℃ 1분, 72℃ 1분의 조건으로 PCR machine (Perkin Elmer 9600)을 이용하여 각각 약 300 bp의 Cµ 및 Cκ 유전자 절편을 증폭하였다. 획득된 DNA 절편은 TBE buffer를 이용하여 만든 0.
- 생쥐 Ig 중사슬 유전자 적중 (knockout) construct의 제작을 위해 (주)마크로젠으로부터 제공받은 129/SV mouse strain의 brain λ genomic DNA library를 이용하여 생쥐 항체 중사슬 유전자와 경사슬 유전자 절편의 검색을 실시하였다. Bacteriophage λ genomic library의 바이러스를 titer하여 정확한 수를 계산한 후 well당 10,000개 정도가 들어가도록 약 2×106개의 바이러스를 2개의 96-well plate에 8×8 format으로 각각의 well에 seeding하여 이로부터 획득한 상등액을 줄과 열별로 혼합하여 PCR template으로 사용하였다. Ig Cμ에 대한 specific primer를 제작하여 1차 PCR 검색을 실시한 결과 약 300 bp의 Ig Cμ 유전자 절편을 확인할 수 있었다(Fig.
- Ig 중사슬 적중 배아줄기 세포의 획득. D3 배아줄기 세포의 증식을 위하여 STO feeder 세포주를 배양하고 그 위에 D3 배아줄기 세포를 seeding함으로써 D3 배아줄기세포를 배양할 수 있는 배양 기술을 갖추었으며, 이를 이용하여 배양된 배아줄기 세포를 항체 Ig 중사슬 유전자를 적중시키기 위한 electroporation 실험에 사용하였다.
- 증류수로 다시 2회 세척한 후 vacumn blotter (Bio Rad, USA)에 nylon membrane (Amersham Pharmacia, Sweden)을 놓고 그 위에 gel을 올려 90분간 transfer하였다. DNA가 transfer된 membrane을 air dry한 후 UV cross linker (Bio Rad)에 5분간 노출시켜 고정한 다음 42℃에서 2시간 prehybridization한 후 DIG DNA labelling kit (BMB, Germany)와 제조사의 실험 protocol에 의하여 합성된 probe로 42℃에서 overnight (O/N) hybridization시켰다. Hybridization시킨 membrane을 maleic acid -0.
- ATCC에서 구입한 D3 배아줄기 세포 stock을 ES DMEM-15와 혼합하여 미리 분주해 놓은 feeder cell로 seeding 하였다. ES DMEM-15는 standard DMEM 배지에 non essential amino acid (Gibco BRL, USA) 0.1 mM과 15%의 ES cell 배양용 FBS (Gibco BRL), 분화 억제 물질인 LIF (leukemia inhibitory factor) (Gibco BRL) 10 ng/μl을 첨가하여 만들었다. 초기 배양 시 4 well plate에서 배양한 후 12～24시간마다 배지를 교체하면서 약 3일간 배양하여 ES cell의 colony가 적당하게 자라면 상기에서와 마찬가지로 0.
- 약 3시간 후 각 plate의 배지를 교환해 준 다음 48 well의 plate는 약 3일간 배양 후각 well에 10% DMSO가 첨가된 ES DMEM-15로 배지를 교환한 후 크린랩으로 싸서 styrofoam box에 넣어 deep freezer에 보관하였고 24 well plate의 배아줄기 세포는 LIF가 첨가되지 않은 ES DMEM-15로 약 7～10일간 배양한 후 confluent하게 자랐을 때 genomic DNA 분리를 위해 사용하였다. Genomic DNA를 이용하여 PCR과 Southern blot을 실시하기 위해 Neo specific primer를 제작 사용하였다(senseprimer: 5'-TCCTTACTGTTCCC TTGATCCA-3', anti-sense primer: 5'-CATTCAGGGCACCGGACA-3') (24).
- Homologous recombination된 배아줄기 세포의 선별은 생쥐 Ig 중사슬 knockout construct로 제작된 pPNT vector를 Not I 제한효소로 linearization한 후 고순도로 분리 정제하여 30μg의 DNA를 D3 배아줄기 세포 내로 electroporation 방법으로 전달한 후 STO feeder cell 위에 seeding 하여 G418과 gancyclovir를 이용한 positive 및 negative selection을 실시함으로써 knockout construct가 genome내로 homologous recombination된 중사슬 항체 유전자 적중 세포주의 제작을 시도하였다. 우선 Ig 중사슬 유전자 적중 벡터의 배아줄기 세포 내 transfection 여부를 확인하기 위해 electroporation에 사용되었던 배아줄기 세포를 G418이 첨가되었으나 gancyclovir가 첨가되지 않은 배지에서 배양한 결과 Fig.
- DNA가 transfer된 membrane을 air dry한 후 UV cross linker (Bio Rad)에 5분간 노출시켜 고정한 다음 42℃에서 2시간 prehybridization한 후 DIG DNA labelling kit (BMB, Germany)와 제조사의 실험 protocol에 의하여 합성된 probe로 42℃에서 overnight (O/N) hybridization시켰다. Hybridization시킨 membrane을 maleic acid -0.3% tween 20 buffer로 세척한 후 30분간 blocking한 다음 anti-digoxigenin-AP conjugate (BMB)를 1：5000으로 희석하여 30분간 반응시키고 세척한 후 ECL (Amersham Pharmacia) 용액을 가하여 5분 동안 반응시킨 후 암실에서 X-ray film (BMB)에 노출시켜 반응을 확인하였다.
- Ig Cμ PCR fragment의 DNA 염기배열 확인. Librar 검색에 사용한 PCR fragment가 Ig heavy chain의 5’지역 (exon 1)임을 재확인하기 위하여 TOPO TA cloning vector에 클로닝한 후 DNA sequencing을 통해 염기 배열을 조사하였다. 그 결과 PCR fragment의 DNA sequence가 Genbank blast search를 통해 생쥐 IgM constant 지역 (Mus musculus hybridoma 13F1 Ig heavy chain mRNA.
- 1A). PCR 검색 시 positive control은 λ genomic DNA library의 바이러스를 straight로 108씩 사용하였고 negative control은 template을 넣지 않는 조건으로 검색하였다. PCR 결과를 확인한 후 곧바로 생산물을 Southern blot에 사용하였는데 Fig.
- Southern blot. PCR 검색에 사용한 agarose gel을 southern blot에 이용하기 위해 gel을 0.25 N HCl에 15분간 방치하여 denature시키고 증류수로 2회 세척한 후 0.5 N NaOH에 30분간 방치하여 중화시켰다. 증류수로 다시 2회 세척한 후 vacumn blotter (Bio Rad, USA)에 nylon membrane (Amersham Pharmacia, Sweden)을 놓고 그 위에 gel을 올려 90분간 transfer하였다.
- PCR을 이용한 λ genomic DNA library의 검색. 생쥐 Ig 중사슬 및 경사슬 knockout genomic constructs의 제작을 위하여 우선 129/SV 생쥐 strain의 brain λ genomic DNA library를 (주)마크로젠으로부터 제공받아 이로부터 생쥐 Ig 중사슬 및 경사슬 유전자 절편을 포함하고 있는 λ phage 클론을 분리하고자 PCR과 non-radioactive probe을 이용한 Southern blot (17)으로 library 검색을 다음과 같이 수행하였다(18,19).
- 7% low melting agarose gel (Quantum)에 전기 영동하여 14 kb의 fragment를 gel 상에서 잘라낸 후 Eco RI, Hind III, Xba I, Xho I 등의 제한효소를 사용하여 resctriction mapping을 실시하여 제한 효소의 위치를 확인하고 적중 벡터를 제작하였다. Restriction mapping을 통해 확인된 제한효소의 위치를 이용하여 short arm은 Not I/Xho I, long arm은 Xba I/Xba I의 제한 효소를 선택하여 37℃에서 4시간 동안 처리하여 0.7% low melting agarose gel을 사용해 분리한 후 targeting vector인 pPNT vector에 short arm과 long arm을 차례로 클로닝하였다. 클로닝된 적중 벡터는 최종적으로 Not I 제한 효소로 절단하여 올바른 방향으로 클로닝 되었는지 확인하였다.
- 적중 벡터의 제작. pBluescript SK(-)에 Ig μ chain gene 이 클로닝된 plasmid로부터 Ig μ chain 유전자 절편을 분리하여 Xho I, EcoR I, Xba I, Sma I, Sac I, Bam H I, Kpn I 등의 제한효소로 restriction mapping을 분석하였다. 우선 하나의 제한 효소를 이용하여 절단하고 유전자 절편을 확인하였을 때 Pst I은 절편 내에 제한 효소 자리가 너무 많았기 때문에 제외시켰고 1개의 제한 효소 자리가 확인된 EcoR I과 다른 하나의 제한 효소를 이용한 double digestion을 통하여 더 확실한 restriction mapping을 실시하였다(data not shown).
- 적중 벡터의 제작. pBluescript SK(-)에 클로닝된 중사슬 절편을 Not I 제한 효소로 절단하여 0.7% low melting agarose gel (Quantum)에 전기 영동하여 14 kb의 fragment를 gel 상에서 잘라낸 후 Eco RI, Hind III, Xba I, Xho I 등의 제한효소를 사용하여 resctriction mapping을 실시하여 제한 효소의 위치를 확인하고 적중 벡터를 제작하였다. Restriction mapping을 통해 확인된 제한효소의 위치를 이용하여 short arm은 Not I/Xho I, long arm은 Xba I/Xba I의 제한 효소를 선택하여 37℃에서 4시간 동안 처리하여 0.
- PCR 검색 방법을 통해 획득한 3개의 중사슬 positive clone과 3개의 경사슬 positive clone중 우선적으로 중사슬과 경사슬 positive clone 1개씩을 선택하여 증폭시킨 다음 λ genomic DNA를 분리한 뒤 Not I 제한 효소로 절단하여 Ig genomic DNA fragment의 크기가 중사슬인 경우 약 14 kb, 경사슬인 경우 약 17 kb임을 확인할 수 있었다(data not shown). 또한 restriction mapping을 위한 DNA의 충분한 양을 확보하기 위해 pBluescript SK(-) 클로닝 벡터에 Not I 제한 효소 자리로 절단하여 Ig μ chain gene fragment를 low-melting temperature agarose gel을 이용하여 분리한 후 이를 pBluescript SK(-) vector에 클로닝하였다.
- 5). 생쥐 Ig 중사슬 genomic DNA 절편상에 존재하는 제한 효소 자리의 위치와 적중벡터로 사용하는 pPNT ((주)마크로젠 공급)의 클로닝 site를 참조하여 3.3 kb의 Not I/Xho I fragment를 short arm, 그리고 4.3 kb의 Xba I fragment를 long arm으로 사용하기로 결정하였다.
- PCR을 이용한 λ genomic DNA library의 검색. 생쥐 Ig 중사슬 및 경사슬 knockout genomic constructs의 제작을 위하여 우선 129/SV 생쥐 strain의 brain λ genomic DNA library를 (주)마크로젠으로부터 제공받아 이로부터 생쥐 Ig 중사슬 및 경사슬 유전자 절편을 포함하고 있는 λ phage 클론을 분리하고자 PCR과 non-radioactive probe을 이용한 Southern blot (17)으로 library 검색을 다음과 같이 수행하였다(18,19). 밤새 배양한 E.
- 생쥐 항체 중사슬 genomic 유전자의 획득. 생쥐 Ig 중사슬 유전자 적중 (knockout) construct의 제작을 위해 (주)마크로젠으로부터 제공받은 129/SV mouse strain의 brain λ genomic DNA library를 이용하여 생쥐 항체 중사슬 유전자와 경사슬 유전자 절편의 검색을 실시하였다. Bacteriophage λ genomic library의 바이러스를 titer하여 정확한 수를 계산한 후 well당 10,000개 정도가 들어가도록 약 2×106개의 바이러스를 2개의 96-well plate에 8×8 format으로 각각의 well에 seeding하여 이로부터 획득한 상등액을 줄과 열별로 혼합하여 PCR template으로 사용하였다.
- 생쥐 Ig 중사슬 적중 벡터의 제작을 위하여 우선 3.3 kb의 Not I/Xho I fragment를 pPNT vector에 삽입하여 3.3 kb의 insert과 7.2 kb의 벡터를 확인할 수 있었고 short arm이 클로닝된 pPNT vector에 다시 4.3 kb의 Xba I/Xba I fragment를 클로닝하여 4.3 kb의 insert과 10.5 kb의 벡터를 확인함으로써 성공적으로 유전자 적중 construct를 제작하였다(Fig. 6). 획득된 생쥐 Ig 중사슬 genomic 절편에서 Cμ exon 1의 위치를 확인하기 위해서 library 검색에 사용되었던 PCR 증폭지역(Cμ exon 1)의 위치를 short arm, deletion region 그리고 long arm DNA fragment를 PCR template로 하여 library 검색 시 사용했던 PCR primer set를 이용해 조사한 결과 Cμ exon 1의 위치는 deletion fragment에 존재함이 확인되었으며 따라서 deletion fragment의 크기가 약 8 kb임을 감안할 때 최소한 본 연구 결과 제작된 mouse Ig heavy chain targeting construct는 Ig heavy chain 유전자의 JH 지역과 Cμ 지역이 deletion 될 수 있으며 따라서 효과적으로 mouse Ig heavy chain의 DNA rearrangement를 적중시킬 수 있으리라는 판단할 수 있었다.
- Feeder cell의 배양. 세포 배양에 필요한 4 well, 12 well, 24 well, 48 well, 96 well, 60 mm, 100 mm, 150 mm plate (Corning)를 0.1% gelatin (Sigma Co., USA)으로 coating하여 30분간 방치하였다가 걷어 낸 후 2시간 가량 clean bench 내에서 dry시킨 다음 150 mm plate에 G418 저항성이 있는 STO cell을 10%의 FBS (Gibco BRL, USA)가 첨가된 DMEM (Gibco BRL) 배지(DMEM-10)에 배양하여 feeder cell로 이용하였다. 약 3일간 feeder cell을 배양하여 confluent하게 자라면 유사 분열을 방지하기 위해 mitomycin C (Sigma Co.
- 25% trypsinEDTA가 담겨져 있는 well에 한 개씩 넣어주고 37℃ incubator에서 약 3분간 방치한 후 pipet으로 20회 정도 pipetting하여 배아줄기 세포 콜로니가 single cell이 되도록 한 다음 각각 35μl은 24 well plate에 분주하고 45μl은 48-well plate에 분주하였다. 약 3시간 후 각 plate의 배지를 교환해 준 다음 48 well의 plate는 약 3일간 배양 후각 well에 10% DMSO가 첨가된 ES DMEM-15로 배지를 교환한 후 크린랩으로 싸서 styrofoam box에 넣어 deep freezer에 보관하였고 24 well plate의 배아줄기 세포는 LIF가 첨가되지 않은 ES DMEM-15로 약 7～10일간 배양한 후 confluent하게 자랐을 때 genomic DNA 분리를 위해 사용하였다. Genomic DNA를 이용하여 PCR과 Southern blot을 실시하기 위해 Neo specific primer를 제작 사용하였다(senseprimer: 5'-TCCTTACTGTTCCC TTGATCCA-3', anti-sense primer: 5'-CATTCAGGGCACCGGACA-3') (24).
- 중사슬 λ DNA를 제한 효소 Not I (Takara, Japan)으로 절단하여 Ig Cμ genomic 유전자의 크기를 확인한 후 restriction mapping에 필요한 충분한 DNA를 확보하기 위해 pBluescript SK (-) 벡터(Stratagene, USA)에 클로닝하였다. 우선 Ig 중사슬 λ DNA를 제한 효소 Not I으로 절단한 후 0.7% low melting agarose gel (Quantum, Canada)에 전기 영동하여 14 kb의 절편을 gel 상에서 잘라 phenol/chloroform extraction방법과 에탄올 침전법으로 농축하였고 벡터는 같은 제한 효소로 절단하여 30 U의 calf intestinal phosphatase (BMB)를 37℃에서 1시간 처리한 후 1μl의 0.5 M EDTA를 넣고 65℃에서 1시간 동안 불활성화하였다. 준비된 insert과 벡터를 UV spectrophotometer (Pharmacia Biotech, Sweden)로 260 nm에서 정량한 후 T4 DNA ligase (Promega) 처리하여 16℃에서 O/N ligation한 반응액 1μl을 XL-1 blue competent cell에 잘 섞어준 다음 얼음에 30분 방치하고 42℃에서 90초간 열충격을 주는 방법으로 transformation 하였다.
- 이러한 고부가 가치 상업성을 지닌 humanized xenomouse의 제작을 위한 기초 연구로서 humanized xenomouse의 제작에 쓰이는 IgH 및 L chain knockout mice를 만드는 데 필수적인 mouse IgH 및 L knockout construct를 제작하고자 시행되었다. 우선 mouse IgH knockout construct를 제작하는 데 연구의 초점을 맞추었으며 현재 mouse IgH knockout construct를 pPNT vector를 이용하여 제작하였고 이 construct의 IgH knockout 기능을 in vitro assay를 통해 확인하고자 D3 배아줄기 세포 내로 도입하여 positive 및 negative selection을 진행 중에 있다. 본 연구를 진행하면서 방사선 동위 원소의 사용없이 PCR을 이용하여 genomic library로부터 원하는 genomic DNA fragment를 지닌 bacteriophage clone을 선별하는 방법이 정착되었으며 또한 많은 비용이 소모되는 배아줄기 세포 배양 기술을 단시간 내에 확보할 수 있었다.
- pBluescript SK(-)에 Ig μ chain gene 이 클로닝된 plasmid로부터 Ig μ chain 유전자 절편을 분리하여 Xho I, EcoR I, Xba I, Sma I, Sac I, Bam H I, Kpn I 등의 제한효소로 restriction mapping을 분석하였다. 우선 하나의 제한 효소를 이용하여 절단하고 유전자 절편을 확인하였을 때 Pst I은 절편 내에 제한 효소 자리가 너무 많았기 때문에 제외시켰고 1개의 제한 효소 자리가 확인된 EcoR I과 다른 하나의 제한 효소를 이용한 double digestion을 통하여 더 확실한 restriction mapping을 실시하였다(data not shown). 그 결과를 토대로 생쥐 Ig 중사슬 genomic DNA 절편의 restriction mapping을 완성하였다(Fig.
- 획득된 생쥐 Ig 중사슬 genomic 절편에서 Cμ exon 1의 위치를 확인하기 위해서 library 검색에 사용되었던 PCR 증폭지역(Cμ exon 1)의 위치를 short arm, deletion region 그리고 long arm DNA fragment를 PCR template로 하여 library 검색 시 사용했던 PCR primer set를 이용해 조사한 결과 Cμ exon 1의 위치는 deletion fragment에 존재함이 확인되었으며 따라서 deletion fragment의 크기가 약 8 kb임을 감안할 때 최소한 본 연구 결과 제작된 mouse Ig heavy chain targeting construct는 Ig heavy chain 유전자의 JH 지역과 Cμ 지역이 deletion 될 수 있으며 따라서 효과적으로 mouse Ig heavy chain의 DNA rearrangement를 적중시킬 수 있으리라는 판단할 수 있었다. 위와 같은 과정을 통해 획득된 적중 벡터의 plasmid를 배아 세포주의 chromosomal DNA로 적중시키기 위해 map상의 short arm과 long arm 그리고 neo gene과 tk gene에 포함되지 않으면서 1개의 자리만 존재하는 제한 효소인 Not I을 이용하여 절단한 후 phenol/chloroform extraction을 통해 정제하여 30μg의 linearized DNA를 electroporation에 이용하였다.
- 형성된 콜로니를 10개 선별하여 LB/Amp broth가 담긴 시험관에 접종하고 O/N 배양한 후 이로부터 plasmid를 분리한 다음 EcoR I 제한 효소로 37℃에서 4시간 동안 처리하여 절단한 후 1% agarose gel에 전기 영동하여 유전자 절편을 확인하였다. 유전자 절편이 확인된 클론의 plasmid는 SV miniprep kit (Promega)를 이용하여 깨끗하게 분리한 후 (주)Bionex에 DNA sequencing을 의뢰하였다.
- 일차 검색 결과 positive 반응을 보인 96 well plate의 줄과 열이 일치하는 각각의 well로부터 상등액을 취하여 Ig Cμ genomic phage clone의 이차 PCR 검색을 수행하였다. 줄과 열이 일치하는 positive well은 plate #1에서 17개였고 plate #2에서 18개였으며 이 중 6개 정도가 강한 band가 나타났다(data not shown).
- 클로닝된 적중 벡터는 최종적으로 Not I 제한 효소로 절단하여 올바른 방향으로 클로닝 되었는지 확인하였다. 제작된 적중 벡터는 배아 세포내의 염색체로 효율적으로 integration시키기 위해 Not I 제한효소로 처리하여 linearization하였다.
- 5 M EDTA를 넣고 65℃에서 1시간 동안 불활성화하였다. 준비된 insert과 벡터를 UV spectrophotometer (Pharmacia Biotech, Sweden)로 260 nm에서 정량한 후 T4 DNA ligase (Promega) 처리하여 16℃에서 O/N ligation한 반응액 1μl을 XL-1 blue competent cell에 잘 섞어준 다음 얼음에 30분 방치하고 42℃에서 90초간 열충격을 주는 방법으로 transformation 하였다. 800μl의 LB 배지를 가하여 37℃ 에서 1시간 동안 배양한 후 LB/Amp plate에 plating한 후 37℃에서 O/N 배양하여 형성된 콜로니를 무작위적으로 30개 선별한 다음 LB/Amp 배지에서 배양한 배양액으로부터 plasmid를 분리하고 Not I 제한 효소로 절단하여 14 kb의 insert를 확인하였다.
- 중사슬 Ig 유전자 절편의 subcloning. 중사슬 λ DNA를 제한 효소 Not I (Takara, Japan)으로 절단하여 Ig Cμ genomic 유전자의 크기를 확인한 후 restriction mapping에 필요한 충분한 DNA를 확보하기 위해 pBluescript SK (-) 벡터(Stratagene, USA)에 클로닝하였다. 우선 Ig 중사슬 λ DNA를 제한 효소 Not I으로 절단한 후 0.
- 생쥐 항체 경사슬 genomic 유전자의 획득. 중사슬 항체 유전자의 검색과 같은 방법으로 일차 검색을 실시한 결과 줄과 열이 일치하는 positive well을 1번 plate에서 17개, 2번 plate에서 19개를 선별하여(Fig. 3) 각각 상등액을 취하여 PCR을 이용한 이차 검색을 수행하였다. 이차 검색 결과 positive 반응을 보인 96-well plate 각 well 중에서 1번 well의 바이러스를 plating하여 얻은 single plaque 5개로부터 얻은 단클론 바이러스 상등액을 이용하여 삼차 검색을 실시한 결과 Ig Cκ genomic phage clone 3개를 최종적으로 획득할 수 있었다.
- coli에 감염시켜 plaque을 형성시킨 후 각각의 plaque을 sterile pasteur pipet (Corning, USA)으로 분리해낸 후 SM buffer에서 약 2시간 동안 바이러스를 방출시켜 같은 조건으로 PCR을 수행하여 생쥐 Ig 중 사슬과 경사슬 유전자 절편이 삽입되어 있는 바이러스 클론을 획득하였다(20). 최종적으로 획득된 Ig 중사슬과 경사슬 phage 클론으로부터 먼저 Ig 중사슬 phage 클론의 λ DNA를 분리해 내기 위해 phage 입자를 O/N culture 한 XL1-blue MRA P2 배양액 1 ml과 혼합하여 R/T에서 20분간 배양한 후 50℃의 top agar 10 ml을 첨가하여 잘 섞어 준 다음 150 mm plate (Corning)에 plating하여 37℃ 에서 O/N 배양함으로써 증식시켰다. 증식된 바이러스는 SM buffer 14 ml을 가하여 4℃에서 O/N 방출시켰고 phenol/chloroform extraction 1 를 거쳐 얻은 상등액으로부터 λ DNA purification kit (Promega, USA)를 이용하여 λ DNA를 분리하였다.
- 7% low melting agarose gel을 사용해 분리한 후 targeting vector인 pPNT vector에 short arm과 long arm을 차례로 클로닝하였다. 클로닝된 적중 벡터는 최종적으로 Not I 제한 효소로 절단하여 올바른 방향으로 클로닝 되었는지 확인하였다. 제작된 적중 벡터는 배아 세포내의 염색체로 효율적으로 integration시키기 위해 Not I 제한효소로 처리하여 linearization하였다.
- coli XL-1 blue strain 500μl과 혼합하여 상온에서 20분간 배양한 후 50℃의 top agar 10 ml을 첨가하고 LB agar plate에 plating 하여 37℃에서 O/N 배양하였다. 형성된 single plaque을 disposable pasteur pipet을 이용하여 picking한 후 100μl의 SM buffer에 넣어 상온에서 6시간 가량 바이러스를 방출시킨 다음 상등액 1μl을 취하여 single λ phage clone의 최종 검색을 실시하였다. 그 결과 Fig.
- 얼음에서 30분간 방치한 후 42℃에서 90초간 열충격 방법으로 transformation하여 1 ml의 LB 배지를 가한 다음 37℃ 진탕 배양기에서 1시간 가량 배양한 후 이 중 100μl을 취하여 LB/Amp plate에 plating하여 37℃ 에서 O/N 배양하였다. 형성된 콜로니를 10개 선별하여 LB/Amp broth가 담긴 시험관에 접종하고 O/N 배양한 후 이로부터 plasmid를 분리한 다음 EcoR I 제한 효소로 37℃에서 4시간 동안 처리하여 절단한 후 1% agarose gel에 전기 영동하여 유전자 절편을 확인하였다. 유전자 절편이 확인된 클론의 plasmid는 SV miniprep kit (Promega)를 이용하여 깨끗하게 분리한 후 (주)Bionex에 DNA sequencing을 의뢰하였다.
- 96-well plate의 A～H, 1～8 줄별로 각 well의 배양액을 모아 5분간 원심 분리한 상등액에 포함되어 있는 phage를 주형으로 하여 생쥐 중사슬 Ig Cµ와 경사슬 Ig Cκ에 특이적인 PCR primers (Cµ sense primer: 5'-AGAGTCAGTCCTTCGCAAATGT-3', anti-sense primer: 5'-GCACATGCAGATCTCTGTTTTT-3', Cκ sense primer: 5'-CTGCACCAACTGTATCCATCTT-3', anti-sense primer: 5'-CACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3')와 Ex Taq polymerase premix (Takara, Japan)로 94℃ 1분, 61℃ 1분, 72℃ 1분의 조건으로 PCR machine (Perkin Elmer 9600)을 이용하여 각각 약 300 bp의 Cµ 및 Cκ 유전자 절편을 증폭하였다. 획득된 DNA 절편은 TBE buffer를 이용하여 만든 0.7%의 agarose gel로 확인하였다. 1차 검색 결과 positive band가 나타난 줄과 열이 일치하는 well을 같은 조건으로 PCR 하여 signal이 강하게 나온 well을 선택하여 상기와 같은 방법으로 바이러스를 다시 96 well plate에 분주하여 PCR과 Southern blot을 실시함으로써 이차 검색을 시행하였다.
대상 데이터
- 배아줄기 세포의 배양. ATCC에서 구입한 D3 배아줄기 세포 stock을 ES DMEM-15와 혼합하여 미리 분주해 놓은 feeder cell로 seeding 하였다. ES DMEM-15는 standard DMEM 배지에 non essential amino acid (Gibco BRL, USA) 0.
- 이차 검색 결과 positive 반응을 보인 96-well plate 각 well 중에서 1번 well의 바이러스를 plating하여 얻은 single plaque 5개로부터 얻은 단클론 바이러스 상등액을 이용하여 삼차 검색을 실시한 결과 Ig Cκ genomic phage clone 3개를 최종적으로 획득할 수 있었다. 이와 같은 PCR 검색 방법을 이용하여 129/SV λ genomic DNA library로부터 최종적으로 Ig Cμ genomic DNA fragment가 삽입되어 있는 λ phage clone 3개와 Ig Cκ genomic DNA fragment가 삽입되어 있는 λ phage clone 3개를 획득하였다(Fig. 4)
성능/효과
- Bacteriophage λ genomic library의 바이러스를 titer하여 정확한 수를 계산한 후 well당 10,000개 정도가 들어가도록 약 2×106개의 바이러스를 2개의 96-well plate에 8×8 format으로 각각의 well에 seeding하여 이로부터 획득한 상등액을 줄과 열별로 혼합하여 PCR template으로 사용하였다. Ig Cμ에 대한 specific primer를 제작하여 1차 PCR 검색을 실시한 결과 약 300 bp의 Ig Cμ 유전자 절편을 확인할 수 있었다(Fig. 1A). PCR 검색 시 positive control은 λ genomic DNA library의 바이러스를 straight로 108씩 사용하였고 negative control은 template을 넣지 않는 조건으로 검색하였다.
- 중사슬 genomic DNA 절편의 클로닝. PCR 검색 방법을 통해 획득한 3개의 중사슬 positive clone과 3개의 경사슬 positive clone중 우선적으로 중사슬과 경사슬 positive clone 1개씩을 선택하여 증폭시킨 다음 λ genomic DNA를 분리한 뒤 Not I 제한 효소로 절단하여 Ig genomic DNA fragment의 크기가 중사슬인 경우 약 14 kb, 경사슬인 경우 약 17 kb임을 확인할 수 있었다(data not shown). 또한 restriction mapping을 위한 DNA의 충분한 양을 확보하기 위해 pBluescript SK(-) 클로닝 벡터에 Not I 제한 효소 자리로 절단하여 Ig μ chain gene fragment를 low-melting temperature agarose gel을 이용하여 분리한 후 이를 pBluescript SK(-) vector에 클로닝하였다.
- PCR 검색 시 positive control은 λ genomic DNA library의 바이러스를 straight로 108씩 사용하였고 negative control은 template을 넣지 않는 조건으로 검색하였다. PCR 결과를 확인한 후 곧바로 생산물을 Southern blot에 사용하였는데 Fig. 1B에서 볼 수 있듯이 PCR 결과에서 나타난 band와 일치하는 signal이 southern blot에서도 나타난 것을 확인할 수 있었고 probe의 특이성과 민감성으로 인해 PCR로 확실히 확인할 수 없던 band도 Southern blot에서는 signal이 나타나는 것을 알 수 있었다.
- 형성된 single plaque을 disposable pasteur pipet을 이용하여 picking한 후 100μl의 SM buffer에 넣어 상온에서 6시간 가량 바이러스를 방출시킨 다음 상등액 1μl을 취하여 single λ phage clone의 최종 검색을 실시하였다. 그 결과 Fig. 2에서 볼 수 있듯이 최종적으로 3개의 positive clone을 획득할 수 있었다. Ig Cμ PCR fragment의 DNA 염기배열 확인.
- Librar 검색에 사용한 PCR fragment가 Ig heavy chain의 5’지역 (exon 1)임을 재확인하기 위하여 TOPO TA cloning vector에 클로닝한 후 DNA sequencing을 통해 염기 배열을 조사하였다. 그 결과 PCR fragment의 DNA sequence가 Genbank blast search를 통해 생쥐 IgM constant 지역 (Mus musculus hybridoma 13F1 Ig heavy chain mRNA. Genebank accession No.: AF052835)과 완벽한 유사성을 지닌 μ chain임을 확인하였다(data not shown)
- 우선 하나의 제한 효소를 이용하여 절단하고 유전자 절편을 확인하였을 때 Pst I은 절편 내에 제한 효소 자리가 너무 많았기 때문에 제외시켰고 1개의 제한 효소 자리가 확인된 EcoR I과 다른 하나의 제한 효소를 이용한 double digestion을 통하여 더 확실한 restriction mapping을 실시하였다(data not shown). 그 결과를 토대로 생쥐 Ig 중사슬 genomic DNA 절편의 restriction mapping을 완성하였다(Fig. 5). 생쥐 Ig 중사슬 genomic DNA 절편상에 존재하는 제한 효소 자리의 위치와 적중벡터로 사용하는 pPNT ((주)마크로젠 공급)의 클로닝 site를 참조하여 3.
- 우선 mouse IgH knockout construct를 제작하는 데 연구의 초점을 맞추었으며 현재 mouse IgH knockout construct를 pPNT vector를 이용하여 제작하였고 이 construct의 IgH knockout 기능을 in vitro assay를 통해 확인하고자 D3 배아줄기 세포 내로 도입하여 positive 및 negative selection을 진행 중에 있다. 본 연구를 진행하면서 방사선 동위 원소의 사용없이 PCR을 이용하여 genomic library로부터 원하는 genomic DNA fragment를 지닌 bacteriophage clone을 선별하는 방법이 정착되었으며 또한 많은 비용이 소모되는 배아줄기 세포 배양 기술을 단시간 내에 확보할 수 있었다. 현재까지 국내에서는 humanized xenomouse를 제작하려는 시도가 본격적으로 진행되지 않고 있으며 이는 기술상의 어려움뿐만 아니라 특허 문제 및 긴 연구 개발기간과 막대한 연구비의 투자가 선행되어야 하기 때문이라고 생각된다.
- Homologous recombination된 배아줄기 세포의 선별은 생쥐 Ig 중사슬 knockout construct로 제작된 pPNT vector를 Not I 제한효소로 linearization한 후 고순도로 분리 정제하여 30μg의 DNA를 D3 배아줄기 세포 내로 electroporation 방법으로 전달한 후 STO feeder cell 위에 seeding 하여 G418과 gancyclovir를 이용한 positive 및 negative selection을 실시함으로써 knockout construct가 genome내로 homologous recombination된 중사슬 항체 유전자 적중 세포주의 제작을 시도하였다. 우선 Ig 중사슬 유전자 적중 벡터의 배아줄기 세포 내 transfection 여부를 확인하기 위해 electroporation에 사용되었던 배아줄기 세포를 G418이 첨가되었으나 gancyclovir가 첨가되지 않은 배지에서 배양한 결과 Fig. 7의 (A)와 같이 confluent한 feeder 세포주 상층부에 전형적인 건강한 형태의 배아줄기 세포가 성장함을 관찰할 수 있었으며 따라서 많은 수의 배아줄기 세포에 Ig 중사슬 유전자 적중 벡터가 성공적으로 genomes 내에 삽입되어 neomycin 저항성을 나타냄이 확인되었다. 한편 배아줄기 세포의 genome에 Ig 중사슬 적중 벡터가 무작위적으로 non-homologous recombination이 일어날 경우 G418에 대한 저항성을 가지면서 동시에 gancyclovir에 대해서는 sensitive하기 때문에 G418과 gancyclovir가 첨가된 배지에서 Fig.
- 3) 각각 상등액을 취하여 PCR을 이용한 이차 검색을 수행하였다. 이차 검색 결과 positive 반응을 보인 96-well plate 각 well 중에서 1번 well의 바이러스를 plating하여 얻은 single plaque 5개로부터 얻은 단클론 바이러스 상등액을 이용하여 삼차 검색을 실시한 결과 Ig Cκ genomic phage clone 3개를 최종적으로 획득할 수 있었다. 이와 같은 PCR 검색 방법을 이용하여 129/SV λ genomic DNA library로부터 최종적으로 Ig Cμ genomic DNA fragment가 삽입되어 있는 λ phage clone 3개와 Ig Cκ genomic DNA fragment가 삽입되어 있는 λ phage clone 3개를 획득하였다(Fig.
- 7의 (A)와 같이 confluent한 feeder 세포주 상층부에 전형적인 건강한 형태의 배아줄기 세포가 성장함을 관찰할 수 있었으며 따라서 많은 수의 배아줄기 세포에 Ig 중사슬 유전자 적중 벡터가 성공적으로 genomes 내에 삽입되어 neomycin 저항성을 나타냄이 확인되었다. 한편 배아줄기 세포의 genome에 Ig 중사슬 적중 벡터가 무작위적으로 non-homologous recombination이 일어날 경우 G418에 대한 저항성을 가지면서 동시에 gancyclovir에 대해서는 sensitive하기 때문에 G418과 gancyclovir가 첨가된 배지에서 Fig. 7 (B)에서 보여주는 바와 같이 배아줄기 세포가 자라지 못하고 죽는 것을 관찰함으로써 Ig Cμ 유전자가 적중된 배아줄기 세포의 획득을 위한 positive 및 negative selection이 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. 현재 homologous recombination을 통한 적중 배아줄기 세포를 선별하고 있으며 선별된 약 200개의 배아줄기 세포는 neo primer를 이용한 PCR과 southern blot을 통해 확인함으로써 세포주를 확립한 후 IgH knockout mouse의 제작을 시도할 예정이다.
- 6). 획득된 생쥐 Ig 중사슬 genomic 절편에서 Cμ exon 1의 위치를 확인하기 위해서 library 검색에 사용되었던 PCR 증폭지역(Cμ exon 1)의 위치를 short arm, deletion region 그리고 long arm DNA fragment를 PCR template로 하여 library 검색 시 사용했던 PCR primer set를 이용해 조사한 결과 Cμ exon 1의 위치는 deletion fragment에 존재함이 확인되었으며 따라서 deletion fragment의 크기가 약 8 kb임을 감안할 때 최소한 본 연구 결과 제작된 mouse Ig heavy chain targeting construct는 Ig heavy chain 유전자의 JH 지역과 Cμ 지역이 deletion 될 수 있으며 따라서 효과적으로 mouse Ig heavy chain의 DNA rearrangement를 적중시킬 수 있으리라는 판단할 수 있었다. 위와 같은 과정을 통해 획득된 적중 벡터의 plasmid를 배아 세포주의 chromosomal DNA로 적중시키기 위해 map상의 short arm과 long arm 그리고 neo gene과 tk gene에 포함되지 않으면서 1개의 자리만 존재하는 제한 효소인 Not I을 이용하여 절단한 후 phenol/chloroform extraction을 통해 정제하여 30μg의 linearized DNA를 electroporation에 이용하였다.
후속연구
- 7 (B)에서 보여주는 바와 같이 배아줄기 세포가 자라지 못하고 죽는 것을 관찰함으로써 Ig Cμ 유전자가 적중된 배아줄기 세포의 획득을 위한 positive 및 negative selection이 진행되고 있음을 확인할 수 있었다. 현재 homologous recombination을 통한 적중 배아줄기 세포를 선별하고 있으며 선별된 약 200개의 배아줄기 세포는 neo primer를 이용한 PCR과 southern blot을 통해 확인함으로써 세포주를 확립한 후 IgH knockout mouse의 제작을 시도할 예정이다.
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