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문제 정의
- 본 연구에서는 천연 항생제가 포함된 기능성 가축 사료를 개발하기 위하여 배양이 용이한 효모세포에 박테리오신의 일종인 OR-7의 유전자를 도입하여 항균 활성 효모를 제작하였고, 이를 SDS-PAGE를 통하여 항균활성 발현 여부를 확인하였다. 그람양성 대표세균인 Bacillus subtilis 및 그람음성 대표세균인 Escherichia co/i에 대한 항균 활성을 확인하였으며, 그람음성 세균 중 농흉이나 중이염의 원인이 되는 녹농균인 Pseudomonas aerng湖sa와 식중독균인 Campylobacter 丿功以에 대한 항균 활성을 확인하였다.
- 이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품의 보존성을 향상시킬 수 있는 보존료 대체물질 혹은 가축 사료에서 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제 대체물질로 사용가능한 박테리오신을 산업적으로 대량생산할 수 있는 효모세포를 제작하였다. 이 연구로 제작된 항균활성 효모를 사료 첨가물로 활용하기 위해서는 효모 배양조건에 따른 항균활성의 영향과 다양한 세균들에 대한 항균활성의 확인 등을 통한 생산 최적 조건의 검토가 필요할 것으로 생각된다.
제안 방법
- 1). OR-7 유전자의 용이한 클로닝 및 발현을 위하여 유전자의 5' 말단에 제한효소 Kpnl 인식부위와 개시코돈 ATG를 그리고 3, 말단에 종지코돈 TAA와 제한효소 Xbal 인식부위를 도입하여 제작하였다(Fig. 1). 제작된 OR-7 유전자 단편을 효모 발현 벡터 pAUR123의 A沥I과 Xbal 부위에 연결하였다(Fig.
- OR-7은 유산균의 일종인 L. salivariuse 생산하는 아미노산 54개로 구성된 항균 펩타이드로 OR-7 유전자의 일차구조가 이미 보고되어 있고 그 길이가 비교적 짧으며 세균과 효모 사이에 유전암호 이용성에 차이가 있기 때문에 OR-7을생산하는 L. salivarius 균체로부터 유전자를 클로닝하지 않고 OR-7 유전자를 화학합성하였다(Fig. 1).
- 회수된 플라스미드 DNA 50 ng과 forward primer pAUR123-F (5'-TCTGCACAATATTTCAAGC-3')4 pAUR123-R (5'-TTCGrnTAAAACCTAAGAGrCAC-3')-S- 사용하여 PCR 반응을 행하였고 염기서열 분석으로 확인하였다. PCR 반응산물은 12%의 polyacrylamide gel에서 전기영동 하여 그 위치를 확인하였다.
- 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin을 최종농도가 100 μg/ml가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 1.5%가 되도록 첨가하여 제작하였다.
- 그람양성 대표세균인 B. subtiliseCC 6633)와 그람음성대표세균인 E. c湖(KCTC 2223)는 LB 배지를 이용하여 37℃에서 하룻밤 진탕배양(250 rpm)하였다. 또한, P.
- 확인하였다. 그람양성 대표세균인 Bacillus subtilis 및 그람음성 대표세균인 Escherichia co/i에 대한 항균 활성을 확인하였으며, 그람음성 세균 중 농흉이나 중이염의 원인이 되는 녹농균인 Pseudomonas aerng湖sa와 식중독균인 Campylobacter 丿功以에 대한 항균 활성을 확인하였다.
- 5% NaCl)를 이용하여 37<>C에서 배양하였다. 대장균 형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin을 최종농도가 100 μg/ml가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 1.
- 박테리오신 OR-7의 유전자(180 bp)는 문헌고찰을 통해 확보된 아미노산 서열을 토대로 효모의 유전암호 이용성 (codon usage)에 적합하게 DNA 염기서열로 바꾼 후 (주) 바이오니아(Seoul, Korea)에서 합성하였다(Fig. 1). OR-7 유전자의 용이한 클로닝 및 발현을 위하여 유전자의 5' 말단에 제한효소 Kpnl 인식부위와 개시코돈 ATG를 그리고 3, 말단에 종지코돈 TAA와 제한효소 Xbal 인식부위를 도입하여 제작하였다(Fig.
- ) 가 첨가된 YPD 고체배지에 도말하였다. 배지중앙에 pAUR- OR-7이 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현 벡터(PAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 100 μ1씩 접종하였다. 이를 30℃에서 1~2일 동안 배양한 후 항균작용에 의해 형성된 생육억제환(clear zone)을 비교 · 관찰하였다.
- 본 연구자들은 유산균의 일종인 Leuconostoc gelidum UAL 187 유래의 bacteriocine leucocin A를 형질전환된 효모에서 발현시켜 B. subtilis에 대한 항균능을 확인하였고 [10], B. subtilis JM4 유래의 bacteriocin인 subpeptin JM4를 효모에서 발현시켜 B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa 등에 대한 항균능을 확인하였다[11丄 Nigutova 등은 Enterococcus faecalis 유래의 enterolysin A를 대 장균에서 발현시켜 Enterococcus malodoratuse\ 성장저해 효과를 확인하였다[12].
- , Sungnam, Korea)가 첨가된 Columbia Broth(Bacton, Dicknson and Company) 배지를 이용하여 37。(2에서 2일간 정치 배양하였다. 사용직전에 100배 희석한 균 희석액을 YPD 고체배지에 도말하였고, C. jejuni 희석액은 5% Defibrinated whole sheep blood (Komed Co. Ltd.) 가 첨가된 YPD 고체배지에 도말하였다. 배지중앙에 pAUR- OR-7이 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현 벡터(PAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 100 μ1씩 접종하였다.
- 2). 이렇게 제작된 재조합 DNA를 대장균(E. coli DH5a)에 형질전환시킨 후, 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소로 삽입된 180 bp의 OR-7 유전자 단편을 확인하였고 pAUR-OR-7으로 명명하였다. pAUR-OR-7을 이용한 효모 세포(S.
- 배지중앙에 pAUR- OR-7이 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현 벡터(PAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 100 μ1씩 접종하였다. 이를 30℃에서 1~2일 동안 배양한 후 항균작용에 의해 형성된 생육억제환(clear zone)을 비교 · 관찰하였다.
- 1). 제작된 OR-7 유전자 단편을 효모 발현 벡터 pAUR123의 A沥I과 Xbal 부위에 연결하였다(Fig. 2). 이렇게 제작된 재조합 DNA를 대장균(E.
- 형질전환 효모를 aureobacidin A(Takara, Korea)(최종농도 0.2 ug/ml)가 첨가된 YPD 배지 4 ml에 접종하여 30℃에서 하룻밤 동안 배양한 후, 원심분리(14, 000 xg, 5분)하여 균체를 회수하였다. 여기에 yeast lysis buffer(2% Triton X-100, 1% SDS, 10 mM tris-HCl(pH 8.
- 2). 형질전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별 마커로 사용되는 aureobacidin A의 최종농도를 0.1 ug/ml에서 0.5 μg/ml까지 다양하게 사용하여 형질전환 효모 콜로니의 형성효율을 검토하였다. 그 결과, 이 연구에서는 aureobacidin A 의 최종농도가 0.
- 형질전환된 효모로부터 세포추출 액을 제작하고 15% SDS- polyarylamide gel을 이용하여 박테리오신 OR-7의 생산을 확인하였다. 그 결과, pAUR123-OR-7 플라스미드가 형질 전환된 효모에서 박테리오신 OR-7의 생산을 확인할 수 있었다(Fig.
- cerevisiae KCTC 7913)의 형질전환은 elec- troporation(Cell-Porator, Life Technologies, MD, USA)법으로 행하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A(Takara, Korea)를 최종농도가 0.2(_ig/mL 가 되게 첨가한 후 3VC에서 3일간 배양하여 형질전환된 효모를 선별하였다.
- 회수된 플라스미드 DNA 50 ng과 forward primer pAUR123-F (5'-TCTGCACAATATTTCAAGC-3')4 pAUR123-R (5'-TTCGrnTAAAACCTAAGAGrCAC-3')-S- 사용하여 PCR 반응을 행하였고 염기서열 분석으로 확인하였다. PCR 반응산물은 12%의 polyacrylamide gel에서 전기영동 하여 그 위치를 확인하였다.
대상 데이터
- 2, Taq DNA poly- merase는 Takara Korea(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E. coli DH5a)를 사용하였다. 대장균은 LB 배지 (1% bacto tryptone, 0.
- 제한효소, DNA ligation kit ver. 2, Taq DNA poly- merase는 Takara Korea(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E.
- 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter(ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123(Takara Korea, Seoul Korea)을사용하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A (Takara Korea)를 최종농도가 0.2 가 되게 첨가한 배지를 사용하였다.
- 2% D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter(ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123(Takara Korea, Seoul Korea)을사용하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A (Takara Korea)를 최종농도가 0.
- 효모의 배양에는 YPD 배지 (1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter(ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123(Takara Korea, Seoul Korea)을사용하였다.
이론/모형
- 5) buffer를 첨가하여 재현탁시킨 후, sonication을 행하여 균체를 파쇄한 후, 4℃에서 원심분리 (14, 000 xg, 20분)를 행한 후 상층 액을 분리하여 세포추출액으로 하였다. SDS-PAGE는 15% polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 행하였다[9]. 세포추출액을 5분간 끓인 후 gel에 주입하였고 Coomassie brilliant blue R-250(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, US A)窪로 염색한 후 관찰하였다.
- coli DH5a)에 형질전환시킨 후, 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소로 삽입된 180 bp의 OR-7 유전자 단편을 확인하였고 pAUR-OR-7으로 명명하였다. pAUR-OR-7을 이용한 효모 세포(S. cerevisiae KCTC 7913)의 형질전환은 elec- troporation(Cell-Porator, Life Technologies, MD, USA)법으로 행하였다. 형질전환된 효모의 선별에는 YPD 배지에 aureobacidin A(Takara, Korea)를 최종농도가 0.
- 효모로부터 플라스미드 DNA를 회수한 후에 OR-7 유전자 단편의 확인은 pAUR123 vector에 특이적 인 primer set을 이용한 PCR (polymerase chain reaction) 법으로 행하였다. 회수된 플라스미드 DNA 50 ng과 forward primer pAUR123-F (5'-TCTGCACAATATTTCAAGC-3')4 pAUR123-R (5'-TTCGrnTAAAACCTAAGAGrCAC-3')-S- 사용하여 PCR 반응을 행하였고 염기서열 분석으로 확인하였다.
성능/효과
- 2 μg/ml에서 가장 효과적으로 형질전환 콜로니를 형성하였다. Aureobacidin A의 최종농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질전환되지 않은 야생효모의 콜로니의 형성빈도가 높아지고, 최종농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 필요로한다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, pAUR123-OR-7 플라스미드가 형질 전환된 효모에서 박테리오신 OR-7의 생산을 확인할 수 있었다(Fig. 4B).
- 5 μg/ml까지 다양하게 사용하여 형질전환 효모 콜로니의 형성효율을 검토하였다. 그 결과, 이 연구에서는 aureobacidin A 의 최종농도가 0.2 μg/ml에서 가장 효과적으로 형질전환 콜로니를 형성하였다. Aureobacidin A의 최종농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질전환되지 않은 야생효모의 콜로니의 형성빈도가 높아지고, 최종농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 필요로한다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 그람양성 대표세균인 B. 物况汤s와 그람음성 대표세균인 E. coli, 녹농균인 P. aeruginosa, 식중독균인 C. jejuni 등에 대한 형질전환 효모의 항균활성에 의해 생성된 생육억제환 (clear zone)을 비교 · 분석한 결과, pAUR123-OR-7이 도입된 형질전환 효모의 경우는 이들 세균 모두에서 생육을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 반면, 효모 발현 vector (pUAR123) 만을 도입한 형질전환 효모의 경우는 생육억제를 나타내지 않았다(Fig.
- 유전자 재조합이 대량생산 공정에 유용하지만, 외래유전자의 발현에 많이 이용되고 있는 대장균을 포함하는 세균들의 경우는 도입된 박테리오신 유전자 산물의 항균활성 때문에 생산 균주로서의 활용이 불가능하다. 따라서 항균활성 펩타이드의 생산을 위해서는 일반적으로 박테리오신에 대한 생육 저해 활성을 나타내지 않는 진핵생물에 속하는 효모 (Saccharomyces cerevisiaee: 숙주로 사용함으로써 이러한 문제점을 해결할 수 있다. 또한, 효모세포로부터 추출한 yeast extract는 현재 세균배양 배지에 첨가하는 영양성분으로서 질소화합물, 당, 무기영양소 및 유기영양소 등을 함유하고 있기 때문에 배양된 효모 균체만으로도 가축사료의 좋은 영양성분으로 활용될 수 있다.
- 5). 이 결과로 이들 세균 모두에 대해 항균활성을 나타내는 형질전환 효모가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었다.
- 3). 이 결과로 형질전환 효모가 나타내는 항균활성이 효모 자체에 의한 활성이 아닌 형질전환에 의해 도입된 pAUR123-OR-7의 유전자에 의한 것이라는 사실을 확인할 수 있었다.
- 형질전환된 효모로부터 pAUR123-OR-7 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA를 분리하였고, 이를 주형 (template)으로발현 vectoH 특이적인 primerf- 이용하여 PCR을 행한 결과, pAUR123-OR-7의 유전자에 해당하는 약 180 bp의 유전자 단편을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이 결과로 형질전환 효모가 나타내는 항균활성이 효모 자체에 의한 활성이 아닌 형질전환에 의해 도입된 pAUR123-OR-7의 유전자에 의한 것이라는 사실을 확인할 수 있었다.
- 효모 ($. cerevisiae)^ pAUR123-OR-7 을 도입하고 aureobacidin A를 포함하는 YPD 배지에서 선별하여 OR-7 발현 유전자가 도입된 형질전환 효모를 얻을 수 있었다(Fig. 2). 형질전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별 마커로 사용되는 aureobacidin A의 최종농도를 0.
후속연구
- 이 연구로 제작된 항균활성 효모를 사료 첨가물로 활용하기 위해서는 효모 배양조건에 따른 항균활성의 영향과 다양한 세균들에 대한 항균활성의 확인 등을 통한 생산 최적 조건의 검토가 필요할 것으로 생각된다.
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