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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 외국 도입 품종 및 국내 육성 딸기 품종을 대상으로 CaMV 35S 프로모터 조절 하에 감미 단백질 모넬린 유전자가 재조합된 벡터가 들어있는 Agrobacterium을 매개로 형질전환을 수행함으로써 국내 육성 딸기 품종을 위한 형질전환 체계를 확립하고자 하였다.
제안 방법
- ‘여봉’과 ‘매향’ 딸기 식물체로부터 잎 절편을 형질전환 재료로 이용하였다. CaMV 35S promoter에 모넬린 유전자가 연결된 pGA482-pS1D 벡터가 들어있는 아그로박테리움 EHA105 균주를 매개로 형질전환을 수행하였다. 공동배양 후 잎 절편체로부터 캘러스 형성과 식물체 재분화율은 ‘여봉’ 품종이 ‘매향’ 품종보다 높았으며 이들 형질전환 식물체는 정상적으로 생육하여 개화하였다.
- KpnI/BglII 제한효소로 처리한 pGA482 (An 1986) 벡터에 모넬린 유전자를 재조합하여 pGA482-pS1D (Fig. 1) 벡터를 제작한 후 Agrobacterium EHA105로 형질전환 하였다. 형질전환 Agrobacterium의 단일 콜로니를 YEP (10 g/L bacto-trypton, 10 g/L yeast extract, 5 g/L NaCl) + 100 mg/L rifampicin + 50 mg/L Km가 첨가된 10 mL의 액체배지에서 2일 동안 배양한 Agrobacterium 배양액을 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 상등액은 버리고 액체공동 배양배지 10 mL로 O.
- Membrane은 처리(1 M Na2HPO4, 1 M NaH2PO4, 7 % SDS, 1 mM Na2‧EDTA)용액에 약 2시간 동안 65°C에서 처리한 다음 [α-32P]dCTP로 표지된 모넬린 유전자의 PCR 산물을 첨가하여 약 16시간 hybridization하였다.
- 4). PCR로 유전자 도입이 확인된 딸기 잎에서 genomic DNA를 분리하여 Southern blot 분석을 실시하였다. 그 결과 형질전환된 ‘여봉’ 및 ‘매향’ 식물체에서 모넬린 유전자가 각각 1-2 카피 도입된 것을 알 수 있었다(Fig.
- 공동배양 배지는 Murashige & Skoog (MS, 1962) 무기염에 B5 (Gamborg et al. 1968) 비타민, 2.2 mg/L thidiazuron (TDZ), 0.3 mg/L indole-3-butyric acid (IBA) 및 200 μM acetosyringone (AS)이 첨가되었고, 잎 절편체로부터 캘러스 유도 및 선발을 위해 공동배양 배지에 300 mg/L carbenicillin (Cb) + 50 mg/L kanamycin (Km), 캘러스로부터 식물체 재분화는 MS 무기염 + B5 비타민 + 3.0 mg/L 6-benzylaminopurin (BA) + 0.5 mg/L IBA + 300 mg/L Cb + 50 mg/L Km, 식물체로부터 뿌리유도를 위해서는 1/2MS + B5 비타민 + 300 mg/L Cb + 50 mg/L Km를 사용하였다.
- 공동배양 후 절편체를 멸균증류수로 3회 세척한 후 물기를 제거하고 300 mg/L Cb + 50 mg/L Km이 첨가된 선발을 겸한 캘러스 유도배지에 치상하여 25°C, 암조건에서 캘러스 형성 정도에 따라 2-4주 동안 배양하였다.
- 기내 배양 중인 딸기 ‘여봉’ 및 ‘매향’ 잎 절편체에 모넬린 유전자 도입 pGA482-pS1D 벡터(Fig. 1)가 함유된 Agrobacterium EHA105을 매개로 딸기 형질전환을 수행하였다.
- 또한, 유전자 발현을 분석하기 위해 형질전환 딸기 잎 1g을 2% CTAB, 2% PVP (K-30), 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA, 2 M NaCl, 0.5 g/L spermidine, 2% β-mercaptoethanol이 포함된 RNA 추출 버퍼와 LiCl를 사용하여 total RNA를 추출하였다.
- 모든 고체배지에 3% sucrose, 0.6% Phyto Agar (Duchefa Biochemie, Haarlem, The Netherlands)가 첨가되었고 pH 5.6으로 조정하여 121°C, 1.2기압에서 15분간 고압 멸균 후 90 × 15 mm 플라스틱 페트리접시에 25 mL씩 분주하여 사용하였다.
- 뿌리가 유도된 식물체는 순화과정을 거친 후 온실에서 생육시키면서 다수의 자묘(daughter plant)를 발생시킨 후 화아분화를 위해 야냉처리(자묘가 심어져 있는 포트를 오후 6시부터 다음날 오전 8시까지 14시간 동안 15°C 저온상에 암 상태로 넣었다가 낮 동안에는 50% 차광 비가림 하우스에서 관리하는 방법으로 15-20일 동안 처리하여 화아분화 유도)를 거쳐 LMO 격리하우스에 정식하였다.
- 선발과정을 거쳐 순화된 딸기 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 모넬린 특이 염기서열 primer와 선발마커로 사용된 nptII primer를 이용하여 PCR로 분석하였다. 그 결과 대부분 형질전환 식물체에서는 약 300 bp 크기에서 모넬린 유전자의 단편이 증폭되었고(Fig.
- 선발과정을 거친 순화된 식물체의 잎에서 DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Germany)을 사용하여 프로토콜에 따라 genomic DNA를 분리하여 PCR 분석을 수행하였다. PCR에 사용된 primer는 모넬린 특이적 primer (Forward: GGGAATGGGAAATTATCGAT, Reverse: CTATTATGGTGGTGGAACTGG)와 nptII 특이적 primer (Forward: GAGGCTATTCGGCTATGACTG, Reverse: ATCGGGAGCGGCGATACCGTA)이다.
- 2B). 정상적인 소식물체를 분리하여 발근배지로 옮겨 뿌리 발달을 유도하였고(Fig. 2C), 온실에서의 순화과정(Fig. 2D)을 거쳐 포복경을 증식시킨 후 자묘의 화아분화를 위해 야냉처리를 실시한 후 LMO 격리포장에 정식하여 재배하였으며(Fig. 2E), 이 후 두 품종 모두 정상적으로 개화하였다(Fig. 3).
- 이와 같은 결과는 antimicrobial peptide-D gene (APD) 유전자가 도입된 6개의 ‘Toyonoka’ 품종의 형질전환체의 경우 1 copy 도입 3개체, 2 copy 도입 1개체, 5 copy 이상 도입 2개체를 얻었다는 결과와 유사하였다(Qin and Zhang 2007). 한편, 형질전환 딸기 식물체로부터 도입유전자의 발현을 확인하기 위하여 잎에서 total RNA를 분리하여 Northern blot 분석을 수행하였다. 그 결과 형질전환된 딸기 식물체에서는 두 품종 모두 모넬린 유전자가 발현되었으나 형질전환 되지 않은 대조구에서는 전혀 유전자가 전사되지 않았다(Fig.
대상 데이터
- ‘여봉’과 ‘매향’ 딸기 식물체로부터 잎 절편을 형질전환 재료로 이용하였다.
- 본 연구팀은 모넬린 유전자 이외에도 면역단백질 락토페린과 트레할로스 합성 TPSP 유전자가 도입된 매향 딸기 형질전환체를 확보하고 있다. 딸기 형질전환 식물체를 기내(1/2MS + B5 비타민 + 25 mg/L Km)에서 3개월에 한번씩 장기간(약 5년간) 계대배양을 통해 유지한 후, PCR로 도입유전자의 유지여부를 확인하였던 바 모넬린이 들어있는 형질전환체에서는 유전자가 대부분 escape되는 현상을 보였으나, TPSP 및 락토페린이 들어 있는 형질전환체의 경우는 같은 조건에서도 유전자의 escape이 거의 일어나지 않음을 알 수 있었다(데이터 미제시).
- 외국 도입 국내 재배 품종인 ‘여봉’(Fragaria × ananassa Duch. ‘Yeobong’)과 국내 육성 품종인 ‘매향’(Fragaria × ananassa Duch.‘Maehyang’) 딸기 식물체의 정단분열조직 유래 기내 식물체를 논산딸기시험장으로부터 분양 받아 1/2MS 배지에서 계대배양하여 증식시킨 다음, 계대배양 1-2개월된 각각의 식물체로부터 잎을 채취하여 그 절편체(약 5 × 7 mm)를 형질전환 재료로 사용하였다.
이론/모형
- PCR에 사용된 primer는 모넬린 특이적 primer (Forward: GGGAATGGGAAATTATCGAT, Reverse: CTATTATGGTGGTGGAACTGG)와 nptII 특이적 primer (Forward: GAGGCTATTCGGCTATGACTG, Reverse: ATCGGGAGCGGCGATACCGTA)이다. PCR로 유전자 도입이 확인된 딸기 형질전환체의 genomic Southern 분석을 위해 약 30 ㎍ DNA를 XbaⅠ제한효소를 처리하여 0.7% agarose gel에 전기영동한 후 10X SSC 용액에서 capillary transfer 방법(Southern 1975)으로 Zeta-Probe GT blotting membrane (Bio-Rad, USA)에 전이시켰다. Membrane은 처리(1 M Na2HPO4, 1 M NaH2PO4, 7 % SDS, 1 mM Na2‧EDTA)용액에 약 2시간 동안 65°C에서 처리한 다음 [α-32P]dCTP로 표지된 모넬린 유전자의 PCR 산물을 첨가하여 약 16시간 hybridization하였다.
성능/효과
- 공동배양 후 잎 절편체로부터 캘러스 형성과 식물체 재분화율은 ‘여봉’ 품종이 ‘매향’ 품종보다 높았으며 이들 형질전환 식물체는 정상적으로 생육하여 개화하였다. PCR 및 Southern blot 분석을 통해 1-2 카피의 모넬린 유전자가 형질전환 딸기 식물체에 도입되었음을 확인하였으며, Northern blot 분석을 통하여 두 품종에서 모두 모넬린 유전자가 발현됨을 확인하였다. 비록 장기간 계대배양된 이들 딸기 형질전환 식물체에서는 모넬린 유전자가 escape 되는 경향을 보였지만, 본 연구에서 확립된 형질전환 시스템은 딸기의 유전적 개량을 위한 새로운 기회를 제공할 수 있을 것이다.
- 공동배양 후 잎 절편체로부터 캘러스 형성과 식물체 재분화율은 ‘여봉’ 품종이 ‘매향’ 품종보다 높았으며 이들 형질전환 식물체는 정상적으로 생육하여 개화하였다.
- 선발과정을 거쳐 순화된 딸기 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 모넬린 특이 염기서열 primer와 선발마커로 사용된 nptII primer를 이용하여 PCR로 분석하였다. 그 결과 대부분 형질전환 식물체에서는 약 300 bp 크기에서 모넬린 유전자의 단편이 증폭되었고(Fig. 4A), 선발마커로 사용된 nptII 유전자의 경우는 약 700 bp 크기의 밴드가 보였으나(Fig. 4B), 형질전환 시키지 않은 식물체에서는 밴드가 전혀 보이지 않았다(Fig. 4). PCR로 유전자 도입이 확인된 딸기 잎에서 genomic DNA를 분리하여 Southern blot 분석을 실시하였다.
- 그 결과 형질전환된 ‘여봉’ 및 ‘매향’ 식물체에서 모넬린 유전자가 각각 1-2 카피 도입된 것을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 한편, 형질전환 딸기 식물체로부터 도입유전자의 발현을 확인하기 위하여 잎에서 total RNA를 분리하여 Northern blot 분석을 수행하였다. 그 결과 형질전환된 딸기 식물체에서는 두 품종 모두 모넬린 유전자가 발현되었으나 형질전환 되지 않은 대조구에서는 전혀 유전자가 전사되지 않았다(Fig. 6).
- 본 연구팀은 모넬린 유전자 이외에도 면역단백질 락토페린과 트레할로스 합성 TPSP 유전자가 도입된 매향 딸기 형질전환체를 확보하고 있다. 딸기 형질전환 식물체를 기내(1/2MS + B5 비타민 + 25 mg/L Km)에서 3개월에 한번씩 장기간(약 5년간) 계대배양을 통해 유지한 후, PCR로 도입유전자의 유지여부를 확인하였던 바 모넬린이 들어있는 형질전환체에서는 유전자가 대부분 escape되는 현상을 보였으나, TPSP 및 락토페린이 들어 있는 형질전환체의 경우는 같은 조건에서도 유전자의 escape이 거의 일어나지 않음을 알 수 있었다(데이터 미제시). 이러한 원인은 8배체의 복잡한 유전성을 가지는 딸기 게놈에 모넬린 유전자가 불안정한 site에 도입되었다가 선발 항생제의 농도가 다소 낮은 배지에서의 장기간 계대배양으로 인한 유전자의 소실로 추정되며, 추후 TPSP 및 락토페린이 도입된 딸기 형질전환체에서도 그와 같은 경향이 있는지 추적 관찰 및 원인 분석이 필요할 것이다.
후속연구
- 본 연구에서 확립된 딸기 형질전환 체계는 향후 다양한 유용유전자를 국내 육성 딸기 품종에 안정적으로 도입할 수 있도록 도움을 줌으로써 우수 신품종 개발에 기여할 수 있을 것이다.
- PCR 및 Southern blot 분석을 통해 1-2 카피의 모넬린 유전자가 형질전환 딸기 식물체에 도입되었음을 확인하였으며, Northern blot 분석을 통하여 두 품종에서 모두 모넬린 유전자가 발현됨을 확인하였다. 비록 장기간 계대배양된 이들 딸기 형질전환 식물체에서는 모넬린 유전자가 escape 되는 경향을 보였지만, 본 연구에서 확립된 형질전환 시스템은 딸기의 유전적 개량을 위한 새로운 기회를 제공할 수 있을 것이다.
- 딸기 형질전환 식물체를 기내(1/2MS + B5 비타민 + 25 mg/L Km)에서 3개월에 한번씩 장기간(약 5년간) 계대배양을 통해 유지한 후, PCR로 도입유전자의 유지여부를 확인하였던 바 모넬린이 들어있는 형질전환체에서는 유전자가 대부분 escape되는 현상을 보였으나, TPSP 및 락토페린이 들어 있는 형질전환체의 경우는 같은 조건에서도 유전자의 escape이 거의 일어나지 않음을 알 수 있었다(데이터 미제시). 이러한 원인은 8배체의 복잡한 유전성을 가지는 딸기 게놈에 모넬린 유전자가 불안정한 site에 도입되었다가 선발 항생제의 농도가 다소 낮은 배지에서의 장기간 계대배양으로 인한 유전자의 소실로 추정되며, 추후 TPSP 및 락토페린이 도입된 딸기 형질전환체에서도 그와 같은 경향이 있는지 추적 관찰 및 원인 분석이 필요할 것이다.
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