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문제 정의
- 본 연구는 정상 쥐의 혈청 지방산을 측정하고 동시에 L-carnitine을 투여하여 L-carnitine이 실제로 혈청 지방산과 carnitine에 미치는 영향을 관찰함으로서 비만 환자들에게 L-carnitine을 치료제로 사용할 수 있는지 알아보기 위해 실시하였다.
- 목적: L-carnitine은 carnitine acyltransferase 효소에 의해 장쇄(long chain)지방산을 세포질에서 미토콘드리아로 이동시킬 때 필요한 효소로 미토콘드리아 내로 이동된 장쇄 지방산은 β-산화를 거쳐 신체의 에너지원으로 사용된다. 비만 치료 방법의 하나로 L-carnitine을 투여하여 간과 근육세포의 산화를 증가시켜 혈청 지방을 감소시키려는 시도가 있으며, 실제로 L-carnitine이 혈청 지방산을 낮추는지를 알아보기 위해 본 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 방법: 250 g 내외의 Sprague Dawley 쥐를 두군으로 나누어 실험하였다. A군은 정상 대조군, B군에서 L-carnitine을 200 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. Hitachi 기기를 이용하여 총 콜레스테롤, 중성지방, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤을 측정하였고, 혈청 C6-C18 지방산은 GC/MS 분석에 의해 1일, 1주, 2주에 측정하였다.
- 250 g 내외의 Sprague Dawley 쥐를 두 군으로 나누어 실험하였다. A군은 정상대조군으로 지정하였고, B군은 L-carnitine 투여군으로 L-carnitine을 200 mg/kg씩 2주일간 매일 복강 내로 투여하였다. 투여후 1일, 1주일, 2주일에 복부 대동맥에서 혈액을 채취하여 혈청 지질, 지방산, carnitine을 측정하였다.
- Hitachi 기기를 이용하여 총 콜레스테롤, 중성지방, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤을 측정하였고, 혈청 C6-C18 지방산은 GC/MS 분석에 의해 1일, 1주, 2주에 측정하였다. Cycling 기법을 이용하여 총 carnitine, 유리 carnitine, 아실 carnitine을 정량 분석하였다.
- 유도체화가 완결된 후, 상온에서 10분간 방치 후, gas chromatography/mass selection(GC/MS) 자동분석용 vial에 반응물을 옮기고 GC/MS로 분석하였다. GC/MS 분석을 통해서 다음과 같이 혈청의 C6-C18지방산을 분석하였다(Table 1, Fig. 1).
- A군은 정상 대조군, B군에서 L-carnitine을 200 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다. Hitachi 기기를 이용하여 총 콜레스테롤, 중성지방, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤을 측정하였고, 혈청 C6-C18 지방산은 GC/MS 분석에 의해 1일, 1주, 2주에 측정하였다. Cycling 기법을 이용하여 총 carnitine, 유리 carnitine, 아실 carnitine을 정량 분석하였다.
- L-carnitine은 carnitine dehydrogenases를 사용하여 NADH, thio-NAD＋, carnitine dehydrogenase를 이용한 cycling 기법을 이용하여 415 nm에서 총(total) carnitine, 유리(free) carnitine, 아실(acyl) carnitine을 정량 분석하였다.
- 방법: 250 g 내외의 Sprague Dawley 쥐를 두군으로 나누어 실험하였다. A군은 정상 대조군, B군에서 L-carnitine을 200 mg/kg씩 매일 복강 내로 투여하였다.
- MSTFA 50 μL와 acetonitrile 50μL를 넣고 60℃에서 30분 동안 유도체화 반응시켰다. 유도체화가 완결된 후, 상온에서 10분간 방치 후, gas chromatography/mass selection(GC/MS) 자동분석용 vial에 반응물을 옮기고 GC/MS로 분석하였다. GC/MS 분석을 통해서 다음과 같이 혈청의 C6-C18지방산을 분석하였다(Table 1, Fig.
- 채취한 혈액을 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 혈청을 분리한 후 농축된 염산을 사용하여 pH를 조정하였고 Hitachi기기(모델 번호 7600-110, 일본)를 이용하여 총 콜레스테롤, 중성 지방(triglyceride), 고분자량 지질 콜레스테롤(HDL-cholesterol), 저분자량 지질 콜레스테롤(LDL-cholesterol)을 측정하였다.
- A군은 정상대조군으로 지정하였고, B군은 L-carnitine 투여군으로 L-carnitine을 200 mg/kg씩 2주일간 매일 복강 내로 투여하였다. 투여후 1일, 1주일, 2주일에 복부 대동맥에서 혈액을 채취하여 혈청 지질, 지방산, carnitine을 측정하였다.
- 혈청 시료를 냉동에서 꺼내어 실온에서 녹인 후 혈청 시료 200 μL를 시험관에 넣고 여기에 내부 표준 물질로 사용하는 D15-C18 : 0, D3-C12 : 0, D3-C14 : 0와 C15 : 0 지방산을 넣었다. 각각의 시험관에 1.
대상 데이터
- 250 g 내외의 Sprague Dawley 쥐를 두 군으로 나누어 실험하였다. A군은 정상대조군으로 지정하였고, B군은 L-carnitine 투여군으로 L-carnitine을 200 mg/kg씩 2주일간 매일 복강 내로 투여하였다.
데이터처리
- 각 값의 평균값과 표준 편차를 구하였으며, Student t-test를 이용하여 통계처리를 하였고 유의수준은 P값을 0.05 이하로 정의하였다.
성능/효과
- 1) 혈청 총 콜레스테롤, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤은 두 군 사이에 유의한 차이가 없었으나, 중성지방은 1주일째에 A군은 131.3±±31.3 mg/dL인데 반하여 B군은 90.0±7.0 mg/dL로 의미있는 감소를 보였다.
- 2) 혈청 총 지방산은 A군에 비해 B군에서 1주에만 약간의 감소를 보였으나 통계학적 유의성은 없었다. 1주일째 장쇄 지방산인 리놀레인 산(linoleic acid)이 B 군에서 A군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 2) 혈청 총 지방산은 A군에 비해 B군에서 1주에만 약간의 감소를 보였으나 통계학적 유의성은 없었다. 1주일째 장쇄 지방산인 리놀레인 산(linoleic acid)이 B 군에서 A군에 비해 유의하게 감소하였다.
- 3) L-carnitine투여 후 carnitine(total, free, acyl) 치는 1일째, 1주일째 및 2주일째에 모두 B군이 A군보다 유의하게 높았으나, 유리 carnitine 만이 투여 누적 용량에 따라서 유의한 증가를 보였다.
- L-carnitine 투여 후 측정한 총 carnitine, 유리 carnitine, 아실 carnitine치는 1일째에 173.6±63.9μmol/L, 105.2±6.2 μmol/L, 38.5±1.8 μmol/L, 1주 일째에 172.4±12.3 μmol/L, 120.8±7.9 μmol/L, 51.6±7.2 μmol/L, 2주일째에 180.1±13.7 μmol/L, 134.8±7.6 μmol/L, 45.2±6.1 μmol/L로 모두 B군이 A군보다 유의하게 높았으나 투여 누적 용량에 따라 유리 carnitine만이 유의한 증가를 보였다(P<0.05, Table 5).
- 결론: L-carnitine 투여 후 1주일째에 혈중 중성지방의 농도가 감소하였고, 리놀레인 산이 미토콘드리아 내로 이동함으로 혈중 농도의 감소를 보였다.
- 본 연구 결과에서는 Brady 등10)의 논문과 다르게 중성 지방과 지방산 대사에도 영향을 미침을 알 수 있었다. 또한 L-carnitine 투여 후 두 군 사이의 carnitine(total, free, acyl)치를 측정한 결과 모두 투여 후에 유의하게 증가하였으나, 유리 carnitine 만이 투여 누적 용량의 증가에 따라 유의한 증가를 보였다.
- 본 연구에서 Sprague Dawley 쥐를 A, B군으로 나누어 시험한 결과 carnitine을 투여한 군에서 혈청 지질 중 중성 지방이 1주일째에 90.0±7.0 mg/dL로 의미 있는 감소를 보였고, 비록 총 지방산은 감소하지 않았으나 이를 GC/MS 분석으로 C6에서 C18 지방산으로 세분화하였을 때 장쇄 지방산 중에서 팔미틴 산, 리놀레인 산, 올레인 산이 많은 부분을 차지하였고, 1주일째에 장쇄 지방산 중의 하나인 리놀레인 산이 carnitine 투여한 군에서 62.7±22.9 μmol/L로 유의하게 감소하였다. 이 효과는 비만 쥐에 투여하면 더 효과가 뚜렷할 것으로 생각한다.
- 비만 대상자에서 간과 근육 carnitine 농도 사이에 유의한 상관 관계를 보였다. 혈청 인슐린 농도는 지방침윤의 정도와 양의 상관 관계를, 간의 carnitine의 농도와는 음의 상관관계를 보였다5).
- 05, Table 3). 이들을 GC/MS 분석으로 C6에서 C18 지방산으로 세분화하였을 때, 장쇄 지방산인 C18 : 2(linoleic acid)가 1일째에 A군이 80.7±16.7 μmol/L, B군이 81.9±13.9 μmol/L로 차이가 없었으나 1주일째에 A군이 102.6±11.1 μmol/L, B군이 62.7±22.9 μmol/L로 B군에서 유의하게 감소하였다(P<0.05, Table 4).
- 혈청 총 콜레스테롤, 고분자량 콜레스테롤, 저분자량 콜레스테롤은 두 군 사이에 의미있는 차이가 없었으며, 중성지방은 1주일째에 A군은 131.3±31.3 mg/ dL, B군은 90.0±7.0 mg/dL로 B 군에서 의미있는 감소를 보였다(P<0.05, Table 2).
후속연구
- 비만 쥐에서 L-catnitine이 혈청 지방산 대사와 carnitine acyltransferase 효소에 미치는 영향에 대해서 추후에 연구할 계획이고, 앞으로 이 논문을 기초로하여 비만 환자에서 L-carnitine 치료 후의 혈청 지방산과 carnitine에 미치는 영향에 대해서도 연구할 계획이다.
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