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문제 정의
- 본 연구에서는 효모단백질의 분자량에 따른 셀레늄의 분포 및 한 분자량의 단백질을 선택하여 셀레노메티오닌으로 변환되는 양을 측정하고자 하였다.
제안 방법
- )와 PITC를 반응 시켜서 얻어진 유도체를 이용하였다.17-21 분석을 위한 시료준비는 셀레늄을 주입하지 않은 배양효모에서 정제된 47kDT 펩타이드를 대조군 (A)으로 하였고, 상기에서 준비된 셀레늄효모에서 정제된 47kDT 펩타이드는 시험군(B)로 하였다.
- Electroblotting 방법으로 추출된 단백질 중 가장 많은 셀레늄을 함유하는 47 kDT 분자량을 가진 펩타이드(시료 2를 분리하여 산으로 가수분해 한 후 얻어진 아미노산들을 PITC와 반응시켜 유도체화 시킨 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 20여종의 아미노산과 셀레노-D,L-메티오닌을 표준시료 (Fg. 4)로 하여 본 시료에서 얻어진 분석자료와 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 일반적인 아미노산 중 트립토판 20%, 글루타민산 7.
- 다음으로 단백질의 부분정제법으로 이용한 PVDF 막에 electroblotting하는 과정은 위 셀레늄 함유 단백질의 미량 검출을 쉽게 하였고 electroblotting에 의해 추출된 미량 단백질로부터 아미노산을 분석하기 위한 시료를 쉽게 얻을 수 있었다. Electroblotting 방법으로 추출된 단백질 중 가장 많은 셀레늄을 함유하는 47 kDT 분자량을 가진 펩타이드(시료 2를 분리하여 산으로 가수분해 한 후 얻어진 아미노산들을 PITC와 반응시켜 유도체화 시킨 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 20여종의 아미노산과 셀레노-D,L-메티오닌을 표준시료 (Fg.
- 효모막에 부착되어 있는 무기셀레늄의 농도는 MBR법을 이용하였다. 건조된 효모 0.1 g을 7 ml의 환원용액 [0.2 N 인산완충용액 (pH 5.5)에 1-thioglycer 이를 20%(w/v) 혼합한 용액] 에 넣고 밀봉상태에서 3분간 200 rpm로 혼합한 후 지시약인 메틸렌 블루 용액(2%) 한 방울을 떨어뜨린 후 푸른색이 사라지는 시간을 측정함으로써 효모막에 붙어 있는 무기셀레늄의 농도를 측정하였다.
- 1 g을 HNO3 30%, H2O2 20%, 3차증류수 50%의 혼합용액 (10 mL)을 첨가하여 98oC에서 10시간 동안 산분해법으로 유기물을 분해15하였다. 동일한 과정을 2회 반복하여 유기물을 분해한 후 HC1 을 첨가하여 잔류물을 용해시킨 후 이 시료를 ICP-AES 에 도입하여 셀레늄 농도를 측정하였다. 효모막에 부착되어 있는 무기셀레늄의 농도는 MBR법을 이용하였다.
- )을 사용하였다. 본 배양액의 대수기에서 NazSeOa를 약 2〜3회에 나누어 총 1.14X10-3 M 이 되도록 주입하였고 48시간 동안 배양한 후 효모를 3,000Xg, 10분간 원심분리 하였다. 회수된 셀레늄-효모는 0.
- 효모의 생산량이 감소되지만 상대적인 셀레늄의 농도는 많이 증가하지만 이러한 결과는 유기셀레늄의 형태로존재하는 것이 아니라무기형태로세포벽에 부착되여 있는 경우가 대부분이다. 셀레늄-효모막에 흡착된 무기셀레늄 농도를 확인하는 과정으로 셀레늄효모의 MBRT법에 의한 푸른색의 경과시간을 확인하였다 (Fg. 1). MBRT 에서 1.
- 셀레늄을 포함한 단백질 (crude cell-free extract)을 10% SDS-PAGE로서 일차원 전기이 동으로 전개하였다. 분리된 단백질은 PVDF(polyvinylidendifluoride)막에 100 mA의 전류로 2시간 동안 electroblotting하였다.
- 혼합용액을 10,000Xg에서 15분간 원심분리 하였다. 셀레늄을 함유한 단백질 (crude cell-free extract)을 대량으로 정제하는 방법으로 4.1 M(NH1)2SO4를 이용하여 용액의 포화도가 80% 이상 되도록 염석 처리하였다. 염석 처리 후 투석막(Spectra/por4, Spectrum Co.
- 상기의 PVDF막에 옮겨진 단백질 중 47kDT 펩타이드를 분리한 후 6 N HCl으로 가수 분해 하여 아미노산들을 얻었다. 완전히 건조시킨 아미노산들을 phenylisothiocyanate(PITC)와 반응시켜 유도체화 시킨 후 HPLC(Phamacia Co.)로 pmol의 아미노산을 분석하였다(Table 1). 기존 아미노산들은 표준물질의 retention time과 area를 이용하였고 셀레노아미노산 분석을 위한 표준물질은 셀레노-D, L-메티오닌 [C5H11NO2Se; M.
- 상기에서 얻어진 세포침전물은 셀레늄-효모내의 셀레늄 농도 측정에 사용하였다. 유기물 성분이 셀레늄의 원자화를 저해하는 것을 방지하기 위하여 세포침전물의 건조중량 0.1 g을 HNO3 30%, H2O2 20%, 3차증류수 50%의 혼합용액 (10 mL)을 첨가하여 98oC에서 10시간 동안 산분해법으로 유기물을 분해15하였다. 동일한 과정을 2회 반복하여 유기물을 분해한 후 HC1 을 첨가하여 잔류물을 용해시킨 후 이 시료를 ICP-AES 에 도입하여 셀레늄 농도를 측정하였다.
- 정제된 단백질에 셀레늄이 함유되는 정도를 단백질의 분자량별로 분석하였다. 전기 이동으로 단백질을 7개의 띠로 분리한 후 각각 분리된 단백질에서 셀레늄 농도를 측정하였다(Fig. 2). 분리된 단백질 띠의 셀레늄 농도를 측정 한 결과 55 kDa, 47 kDa, 32 kDg 단백질은 분리된 다른 분자량의 단백질보다 2배 이상의 셀레늄이 포함되어 있는 것으로 나타났다.
- 정제된 단백질에 셀레늄이 함유되는 정도를 단백질의 분자량별로 분석하였다. 전기 이동으로 단백질을 7개의 띠로 분리한 후 각각 분리된 단백질에서 셀레늄 농도를 측정하였다(Fig.
대상 데이터
- 분리된 단백질은 PVDF(polyvinylidendifluoride)막에 100 mA의 전류로 2시간 동안 electroblotting하였다.16 염색은 Coomassie Brillant Blue(CBB), R-250을 사용하였고 탈색 후 PVDF 막을 건조하여 목적 단백질을 얻어내었다.
- )로 pmol의 아미노산을 분석하였다(Table 1). 기존 아미노산들은 표준물질의 retention time과 area를 이용하였고 셀레노아미노산 분석을 위한 표준물질은 셀레노-D, L-메티오닌 [C5H11NO2Se; M.W 196.1](Sigma Co.)와 PITC를 반응 시켜서 얻어진 유도체를 이용하였다.17-21 분석을 위한 시료준비는 셀레늄을 주입하지 않은 배양효모에서 정제된 47kDT 펩타이드를 대조군 (A)으로 하였고, 상기에서 준비된 셀레늄효모에서 정제된 47kDT 펩타이드는 시험군(B)로 하였다.
- 본 실험에서는 Saccharomyces cerevisiae VH-2(JENICO Co.) 균주를 분양 받아 사용하였다. 이 종균에 대한 전 배양은 YM 배지 (yeast extract 0.
- 14%(w/v)의 전배양균을 사용하여 30 ℃, 200 rpm에서 본 배양하였다. 셀레늄의 공급원은 Na2SeO3(Sigma co.)을 사용하였다. 본 배양액의 대수기에서 NazSeOa를 약 2〜3회에 나누어 총 1.
- ) 균주를 분양 받아 사용하였다. 이 종균에 대한 전 배양은 YM 배지 (yeast extract 0.3%, malt extract 0.3%, peptone 0.5%, dextrose 1%(w/v)를 사용하였고, 대량생산을 위하여 production 배지 (Molasses 17.64%, CO(NH2)2 0.616%, H3PO4 0.416%, (NH4)2SO4 0.194%, KCl 0.0554%, MgSO4 0.0428%, CaSO4 0.0286%, ZnSO4 0.001592%, thiamine 0.000214%(w/v)을 사용하였다. 배양조건은 본 배양배지를 기준으로 0.
이론/모형
- 동일한 과정을 2회 반복하여 유기물을 분해한 후 HC1 을 첨가하여 잔류물을 용해시킨 후 이 시료를 ICP-AES 에 도입하여 셀레늄 농도를 측정하였다. 효모막에 부착되어 있는 무기셀레늄의 농도는 MBR법을 이용하였다. 건조된 효모 0.
성능/효과
- 1.14X10-3M의 Na2SeO3을 주입하여 얻은 효모의 셀레늄 농도를 ICP-AES로 측정한 결과 1,074 μg Se/g yeast(ppm：로 얻어졌다. 이 효모는 초음파 분쇄기를 이용하여 파쇄 하였고 효모의 건조중량에 대하여 약 16.
- 셀레늄의 생체이용성과 체내에서의 대사 및 독성에 대한 영향을 고려한 결과이다. 1.14X10-3M의 셀레늄을주입하여 얻은효모내의 셀레늄의 농도를 ICP-AES로 분석한 결과 g 건조중량^ 대하여 600~1,000 μg Se/g yeast 이상의 셀레늄을 함유하였다. Na2SeO3 첨가량에 따른 셀레늄-효모의 생산량은 셀레늄의 농도가 일정량 증가함에 따라 효모의 생 산량도 증가하지만 과도한 양의 Na2SeO3이 투여 되였을 경우 효모의 생산량이 감소한다.
- 다음으로 단백질의 부분정제법으로 이용한 PVDF 막에 electroblotting하는 과정은 위 셀레늄 함유 단백질의 미량 검출을 쉽게 하였고 electroblotting에 의해 추출된 미량 단백질로부터 아미노산을 분석하기 위한 시료를 쉽게 얻을 수 있었다. Electroblotting 방법으로 추출된 단백질 중 가장 많은 셀레늄을 함유하는 47 kDT 분자량을 가진 펩타이드(시료 2를 분리하여 산으로 가수분해 한 후 얻어진 아미노산들을 PITC와 반응시켜 유도체화 시킨 후 HPLC를 이용하여 분석하였다.
- 14X10-3M 이상의 셀레늄을 주입하여 얻어진 셀레늄-효모의 경우 5분 이내에 지시약의 푸른색이 사라졌으며 이는 셀레늄이 효모세포벽에 흡착되어 무기셀레늄 형태로 존재하고 있음을 나타낸다. 또한 1.14X10-3M 이내의 셀레늄을 주입하여 얻어진 셀레늄-효모의 경우 15분 이상 지시약의 푸른색이 지속되는 결과로 무기셀레늄이 세포벽에 흡착되어 있는 것이 아니라 셀레늄이 효모세포내로 유입되어 유기 셀레늄 형태로 전환됨을 예측할 수 있었다. 즉, 상대적으로 유기 셀레늄의 농도를 가늠함으로써 점차적으로 셀레늄 주입농도가 높아짐에 따라 유기셀레늄으로의 전환되는 최적의 농도를 얻게 되고 이러한 발효조건을 응용하여 유기 셀레늄이 최대 농도로 함유된 효모를 얻을 수 있다.
- 2). 분리된 단백질 띠의 셀레늄 농도를 측정 한 결과 55 kDa, 47 kDa, 32 kDg 단백질은 분리된 다른 분자량의 단백질보다 2배 이상의 셀레늄이 포함되어 있는 것으로 나타났다. Fig.
- 염석에서 얻어진 단백질의 셀레늄 함량을 ICP-AES로 측정한 결과 651 μg Se/g protein(ppmE로 얻어졌다. 이 결과를 효모내의 셀레늄 농도와 비교하였을 때 약 60.6%의 셀레늄이 단백질 내에 존재함을 확인하였다.
- 4)로 하여 본 시료에서 얻어진 분석자료와 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 일반적인 아미노산 중 트립토판 20%, 글루타민산 7.0 %, 글라이신 11.0%, 알라닌 8.2%, 발린 6.7%, 루이신 6.6%, 이소루이신 4.5% 등의 비율로 확인되었으며 셀레노메티오닌은 2.0%로 확인되었다 (Fig. 6). 또한 셀레늄을 주입하지 않은 효모의 일반적인 아미노산은 셀레늄-효모와 비슷한 분포를 보였고 셀레노메티오닌은 0.
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