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문제 정의
- 선행결과로부터 부가적인 가수분해 효소의 첨가 없이 효모 내에 존재하는 가수분해 효소를 이용하여 자가 효소분해법으로 생산하였고, 본 연구를 통해서 효모에서 생산한 셀레늄 펩타이드가 독성이 낮은 유기 셀레늄 공급원으로서 이용 가능하고 산화적 스트레스로부터 피부 보호능이 있는지를 측정하고자 하였다.
제안 방법
- 셀레늄 단백질을 1% HNO3로 희석하여 Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer (AAS 5EA, Analytik Jena, Germany)를 이용하여 셀레늄의 양을 측정하였다. Palladium (10 ppm)을 첨가하여 각 시료의 안정화에 이용하였다 [19-20].
- Glutathione peroxidase 활성은 Paglia와 Lawrence [21]의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료(0.05 mL)를 50 mM potassium phosphate 완충용액 (pH 7)에 1 mM EDTA, 1 mM NaN3, 0.2 mM NADPH, 1 mM glutathione, 1 U/mL glutathione reductase를 혼합한 용액에 첨가하여 37℃에서 10분간 반응 후 0.05 mL의 H2O2 (5 mM)를 첨가하여 340 nm에서 5분간 흡광도의 감소를 측정하였다. 1 M NADPH 소비량을 1 Unit으로 하였으며, 단백질 정량은 BCA(bicinchoninic acid) 방법을 이용하였다.
- 피부의 펩타이드 공급 또한 영양분의 부족으로 일어나는 피부 노화를 방지하며 섬유아세포의 증식을 높이고 콜라겐의 발현을 증가시킨다고 보고 되어있다 [26]. 따라서 셀레늄 펩타이드의 이러한 효능을 측정하기 위하여 westernblot을 실시하여 type I procollagen 및 MMP-1 발현양을 조사하였다.
- 또한 생산된 셀레늄 펩타이드의 UVB에 의한 피부 보호 효과를 측정하기 위하여 matrix metalloprotease-1 (MMP-1) 분해능을 측정하였다. UV를 조사하지 않고 화합물 무처리를 100%로 잡고 UV 조사 후 화합물 처리 시와 무처리 시의 MMP-1 분해능을 비교한 결과 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 10-5 M 처리구에서 각각 52.
- 생산된 셀레늄 펩타이드의 분자량 측정을 위하여 Waters 사의 Ultrahydrogel 250 gel permeation chromatography (GPC) 컬럼 (1 mL/min, 10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.0)을 이용하였으며, 평균 분자량은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.
- 을 이용하여 60℃에서 12시간 동안 가수분해하였다. 셀레늄 단백질을 1% HNO3로 희석하여 Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer (AAS 5EA, Analytik Jena, Germany)를 이용하여 셀레늄의 양을 측정하였다. Palladium (10 ppm)을 첨가하여 각 시료의 안정화에 이용하였다 [19-20].
- 4시간 후 상등액을 제거하고 200 uL의 dimethylsulfoxide를 첨가하여 formazan 생성물을 녹이고, 이를 ELISA reader를 이용하여 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 실험결과는 대조구 대비 흡광도를 percentage로 표현하였으며, 6반복 시행하였다. 대조구로는 셀레늄이 포함되지 않고 GPx 유사활동이 없는 효모 펩타이드를 이용하였다.
- 인간 피부섬유아세포는 10 cm culture dishes (Falcon Lincol Park. NJ)에 찰 때까지 배양하고, serum이 없는 배지를 이용하여 24시간 배양 후 phosphate-buffered saline으로 교체 후 UV (0-100 mJ/cm2)을 조사하였다. UV 조사 후 세포는 phosphate-buffer saline을 이용하여 세척하고 배지를 첨가하고 시료 처리 혹은 무처리하여 72시간동안 배양하였다 [22].
- 효모의 효소 자가 분해에 의해 생산된 셀레늄 펩타이드는 항산화 효소인 glutathione peroxidase 유사 활성을 가지는데 이를 피부에 적용하기 위해 피부에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 셀레늄 펩타이드는 셀레늄이 가지는 독성이 거의 나타나지 않았으며 오히려 세포 증식 효과를 보였다.
대상 데이터
- 세포 상등액 추출물은 12,000 × g의 속도로 10분간 원심분리하여 단백질을 얻어 westernblot을 실시하였다. 1차 항체로는 monoclonal anti-type I procollagen aminoterminal extension peptide (SP1. D80) antibody (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA)와 monoclonal anti-MMP-1 antibody (Oncogen, Co., Boston, MA)를 이용하였다.
- UV light source는 285-350 nm (peak：310-315 nm)의 emission spectrum을 갖는 F75/85W/UV21 fluorescent sun lamps를 이용하였다.
- 실험결과는 대조구 대비 흡광도를 percentage로 표현하였으며, 6반복 시행하였다. 대조구로는 셀레늄이 포함되지 않고 GPx 유사활동이 없는 효모 펩타이드를 이용하였다.
- 파쇄된 세포에 5% NaCl을 첨가하여 250 rpm의 속도로 50℃에서 48시간 동안 반응한 후 세포 부유물을 제거하기 위하여 3,000 × g의 속도로 30분간 원심 분리하여 상등액을 취하였다 [17-18]. 생산된 셀레늄 펩타이드 (Se-pep)의 농도는 10-9, 10-7, 10-5 M의 농도로 준비하고 대조구로는 셀레늄을 이용하였다. 셀레늄이 포함되지 않은 배지에서 생산된 효모 펩타이드(Y-pep)는 펩타이드의 평균분자량을 기본으로 하여 실험에 이용하였다.
- 배양기에서 배양하였다. 섬유아세포는 90% 정도 자라면 계대 배양하였고, 세포는 5 세대 이후부터 실험에 이용하였다.
- 인간 피부 섬유아세포의 초대배양은 성인의 foreskin으로부터 얻어 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine, and penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 μg/mL)이 포함된 Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM)를 이용하여 37°C, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 모든 p 값은 양측검정을 실시하였고, p ≤ 0.05를 유효값으로 하였다.
- 자료의 분석은 Student t-test를 이용하여 통계 분석하였으며 결과 값은 평균 (Means) ± 구조 방정식 (Structural Equation Modeming, SEM)으로 표현하였다.
이론/모형
- 05 mL의 H2O2 (5 mM)를 첨가하여 340 nm에서 5분간 흡광도의 감소를 측정하였다. 1 M NADPH 소비량을 1 Unit으로 하였으며, 단백질 정량은 BCA(bicinchoninic acid) 방법을 이용하였다.
- Glutathione peroxidase 활성은 Paglia와 Lawrence [21]의 방법에 따라 측정하였다. 각 시료(0.
성능/효과
- Saccharomyces cerevisiae의 의해 생산 된 자가 단백질 분해효소에 의하여 auto lysis를 유도하고 세포유래 단백질을 작은 펩타이드로 분해하여 상대적으로 반응 면적을 높이고, 일반적으로 단백질 분해에 이용되는 산 가수분해에 의해 항산화 활성이 저하되는 것을 막아 산업적 효용성을 용이하게 하였다.
- 또한 생산된 셀레늄 펩타이드의 UVB에 의한 피부 보호 효과를 측정하기 위하여 matrix metalloprotease-1 (MMP-1) 분해능을 측정하였다. UV를 조사하지 않고 화합물 무처리를 100%로 잡고 UV 조사 후 화합물 처리 시와 무처리 시의 MMP-1 분해능을 비교한 결과 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 10-5 M 처리구에서 각각 52.1%, 45.2%의 저해 활성을 보였다 (Fig. 3).
- 효모의 효소 자가 분해에 의해 생산된 셀레늄 펩타이드는 항산화 효소인 glutathione peroxidase 유사 활성을 가지는데 이를 피부에 적용하기 위해 피부에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 셀레늄 펩타이드는 셀레늄이 가지는 독성이 거의 나타나지 않았으며 오히려 세포 증식 효과를 보였다. 또한 셀레늄 펩타이드가 효모 펩타이드보다 더 높은 세포 증식과 UVB 조사에 의한 세포 보호 효과를 보였고 이는 셀레늄이 세포 내 항산화 활성을 증가시키는 것으로 사료된다.
- 7%의 성장 저해율로 효모에 대한 독성이 거의 없었다 [23]. 또한 생산된 셀레늄 펩타이드의 인간 피부 섬유아세포에 대한 세포 독성을 확인하기위하여 10-9, 10-7, 10-5 M 농도로 섬유아세포에 첨가하고 대조군으로 셀레늄을 함유하지 않은 효모 펩타이드를 첨가하여 셀레늄에 의한 세포 독성을 측정한 결과 무기 셀레늄의 첨가는 10-9 M에서 세포가 거의 죽었으나(data not shown) 셀레늄 펩타이드는 Fig. 1에서와 같이 10-5 M에서도 셀레늄에 의한 독성이 나타나지 않았다. 따라서 효모의 자가분해로 생성된 셀레늄 펩타이드는 미생물에서의 저독성을 보인 것과 같이 인간 피부 섬유아세포에 대한 독성에 유사한 결과를 보여 주고 있다.
- 그 결과 셀레늄 펩타이드는 셀레늄이 가지는 독성이 거의 나타나지 않았으며 오히려 세포 증식 효과를 보였다. 또한 셀레늄 펩타이드가 효모 펩타이드보다 더 높은 세포 증식과 UVB 조사에 의한 세포 보호 효과를 보였고 이는 셀레늄이 세포 내 항산화 활성을 증가시키는 것으로 사료된다. 이를 통해 셀레늄 펩타이드는 독성이 적은 유기 셀레늄 화합물로 피부에 적용하기 위한 항산화제로서의 가능성을 보여주었다.
- 산화적 스트레스에 대한 셀레늄 펩타이드의 세포보호효과 측정을 위하여 배양중인 인간 피부섬유아세포에 100 mJ/cm2의 UVB를 조사하고, 10-9, 10-7, 10-5 M의 셀레늄 펩타이드를 처리한 후 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정한 결과 Table 1에서와 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 모두 UVB에 의한 손상으로부터 세포 보호효과를 나타내었으며, 특히 셀레늄 펩타이드가 세포의 증식을 더욱 촉진시키는 것으로 나타났다.
- 셀레늄 펩타이드 및 효모 펩타이드를 10-5 M의 농도로 세포에 처리하여 UVB에 의해 유발되는 산화적 스트레스로부터 type I procollagen 수준의 감소를 막고 이에 따른 MMP-1의 수준을 저해하는지 확인한 결과, UVB 조사는 procollagen I의 발현을 감소시키는데 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 10-5 M에서 각각 24.7%, 9.9%의 발현 증가를 보였으나 UVB에 의한 발현 감소를 회복시키지 못하였다 (Fig. 2). 위의 결과는 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 모두 인간 피부 섬유아세포에 UVB 조사시 감소 되는 type 1 procollagen을 회복시키지 못하는 것으로 보이며, 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 간에도 차이가 없으므로 셀레늄의 영향은 없는 것으로 판단된다.
- 위의 결과는 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 모두 10-5 M의 고농도에서 회복시켰고, 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 간의 비교에서는 셀레늄 펩타이드가 좀 더 많이 감소는 되었으나 이 결과가 셀레늄 펩타이드의 특징이라고 보기에는 두 데이터 간의 유의차가 없으므로 셀레늄의 영향이 아닌 효모 펩타이드의 특징으로 생각되어진다.
- 2). 위의 결과는 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 모두 인간 피부 섬유아세포에 UVB 조사시 감소 되는 type 1 procollagen을 회복시키지 못하는 것으로 보이며, 효모 펩타이드와 셀레늄 펩타이드 간에도 차이가 없으므로 셀레늄의 영향은 없는 것으로 판단된다.
- 1과 Table 1의 결과로부터 셀레늄만을 인간 피부 섬유아세포 처리 시에는 10-9 M의 농도에서 UVB 조사 시 세포가 대부분 사멸하였으므로 효모 펩타이드보다 셀레늄 펩타이드가 인간 피부 섬유아세포의 분화를 촉진시키는 것으로 사료된다. 이러한 결과는 세포 증식효과가 있는 효모 펩타이드에 셀레늄을 결합시킴으로써 셀레늄의 독성이 소멸되고 성장 혹은 분화 촉진을 일으키는 결과를 가져온 것으로 UVB에 의한 손상으로부터 세포를 보호할 수 있는 소재로서의 가능성을 보인 것으로 보였다고 할 수 있다. 그러나 무작위로 들어간 것이므로 인간 피부 섬유아세포가 셀레늄과 접촉하지 못한 이유인지 효모 펩타이드에 구조적인 영향을 미쳐서 이루어진 결과인지는 추후 정확히 밝혀야 할 문제이다.
- 또한 셀레늄 펩타이드가 효모 펩타이드보다 더 높은 세포 증식과 UVB 조사에 의한 세포 보호 효과를 보였고 이는 셀레늄이 세포 내 항산화 활성을 증가시키는 것으로 사료된다. 이를 통해 셀레늄 펩타이드는 독성이 적은 유기 셀레늄 화합물로 피부에 적용하기 위한 항산화제로서의 가능성을 보여주었다.
후속연구
- 이러한 결과는 세포 증식효과가 있는 효모 펩타이드에 셀레늄을 결합시킴으로써 셀레늄의 독성이 소멸되고 성장 혹은 분화 촉진을 일으키는 결과를 가져온 것으로 UVB에 의한 손상으로부터 세포를 보호할 수 있는 소재로서의 가능성을 보인 것으로 보였다고 할 수 있다. 그러나 무작위로 들어간 것이므로 인간 피부 섬유아세포가 셀레늄과 접촉하지 못한 이유인지 효모 펩타이드에 구조적인 영향을 미쳐서 이루어진 결과인지는 추후 정확히 밝혀야 할 문제이다.
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