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문제 정의
- 따라서 본 고는 산앵도나무 잎의 메탄올 추출물로부터 얻은 각 분획물들과 6종의 분리화합물을 대상으로 RLAR 억제 활성과 l, l-diphenyL2-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거능 및 쥐의 platelet 응집 억제능을 알아봄으로서 당뇨병성 합병증의 치료 및 억제 가능성에 관하여 알아보았다.
제안 방법
- 21) PRP를 thrombocounter를 사용하여 혈소판의 수를 측정하고 PPP로 혈소판의 수를 100만/mm2로 맞추었다. 이를 0.
- 005 ml를 첨가한다. PPP를 blank로 하여 4분-6분간 600nm에서 투과도의 변화를 측정하였다. 각 농도의저해율을 계산한 후 IC50 값(㎍/ml 및 μM)을 계산하였다.
- Platelet-rich plasma (PRP) 및 platelet-poor platelet (PPP)의 준비 - 체중 180-250g의 Sprague Dawley 웅성렛트를 디에틸에테르로 흡입 마취한후 2.2% trisodium citrate (1 volume)가 든 프라스틱주사기로 심장에서 혈액 (9 volumes)을 채취하여 흔들어 섞은 후 상온에서 1200xg에서 10분간 원심분리하여 상층부의 PRP를 얻었다. PRP를 취하고 남은 층을 3000×g에서 15분간 다시 원심분리하여 PPI를 얻었다.
- 공시험군은 기질인 DL-glyceraldehyde 만을 제외시켜 β-NADPH 이외의 타 요인에 의한 반응치를 보정하였다. 각 농도의 저해율을 계산한 후 IC50 값(㎍/ml 및 μM)을 계산하였다.
- 공시험군은 기질인 DL-glyceraldehyde 만을 제외시켜 β-NADPH 이외의 타 요인에 의한 반응치를 보정하였다. 각 농도의 저해율을 계산한 후 IC50 값(㎍/ml 및 μM)을 계산하였다.
- 공시험군은 기질인 DL-glyceraldehyde 만을 제외시켜 β-NADPH 이외의 타 요인에 의한 반응치를 보정하였다. 각 농도의 저해율을 계산한 후 IC50 값(㎍/ml 및 μM)을 계산하였다.
- 조제한 효소원과 DL-glyceraldehyde를 기질로 하여 반응시키고 340nm에서 NADPH 흡광도의 감소율을 측정하였다. 공시험군은 기질인 DL-glyceraldehyde 만을 제외시켜 β-NADPH 이외의 타 요인에 의한 반응치를 보정하였다. 각 농도의 저해율을 계산한 후 IC50 값(㎍/ml 및 μM)을 계산하였다.
- 메탄올 추출물(150 g>을 얻었다. 메탄올 추출물을 증류수(1000ml)에 현탁시켜 노르말-헥산, 크로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(EtOAc), 노르말-부탄올 순으로 용매 분획하여 각각 96.5 g, 0.6 g, 9.7 g, 10.8 g을 얻었다. 이들 분획 중 EtOAc층으로부터 column chromatography를 반복하여 화합물 3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxyflavone-3-β-glucoside (Ⅰ, isoquercitrin), 2'-(9-caffeoylarbutin (Ⅱ)를 분리하였고, 노르말-부탄올층으로부터 화합물 3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxyflavone (Ⅲ, quercetin), 3, 3\4', 5, 7-pentahydroxyflavone-3-O-α-L- arabinofuranoside (Ⅳ, avicularin), arbutin (Ⅴ) 및 chloro-genic acid (Ⅵ) 을 분리하여 실험에 사용하였다.
- 5×10-4M)을 넣었다. 실온에서 30 분간 놓아둔 후 spectrophotometer를 사용하여 520nm에서 흡광도를 측정하여 남아있는 DPPH의 량을 계산하였다. 각농도의 저해율을 계산한 후 IC50 값 (㎍/ml 및 μM)을 계산하였다.
- 8 g을 얻었다. 이들 분획 중 EtOAc층으로부터 column chromatography를 반복하여 화합물 3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxyflavone-3-β-glucoside (Ⅰ, isoquercitrin), 2'-(9-caffeoylarbutin (Ⅱ)를 분리하였고, 노르말-부탄올층으로부터 화합물 3, 3', 4', 5, 7-pentahydroxyflavone (Ⅲ, quercetin), 3, 3\4', 5, 7-pentahydroxyflavone-3-O-α-L- arabinofuranoside (Ⅳ, avicularin), arbutin (Ⅴ) 및 chloro-genic acid (Ⅵ) 을 분리하여 실험에 사용하였다.3)
- 즉 흰쥐의 수정체를 적출하고, 그 습중량에 따라 일정량의 phosphate buffer를 가하여 homogenization 하였다. 이를 4℃에서 원심분리한 후 그 상등액을 취하여 ammonium sulfate로 40%까지 포화시키고 원심분리한 상등액을 취하여 다시 70%가 되도록 ammonium sulfate를 가하여 1시간 가량 저어준 다음 원심 분리하여 얻어진 pellet을 최소량의 완충액에 현탁하여 투석을 1일정도 한 다음, 효소원으로 하였다. 조제한 효소원과 DL-glyceraldehyde를 기질로 하여 반응시키고 340nm에서 NADPH 흡광도의 감소율을 측정하였다.
- 이를 4℃에서 원심분리한 후 그 상등액을 취하여 ammonium sulfate로 40%까지 포화시키고 원심분리한 상등액을 취하여 다시 70%가 되도록 ammonium sulfate를 가하여 1시간 가량 저어준 다음 원심 분리하여 얻어진 pellet을 최소량의 완충액에 현탁하여 투석을 1일정도 한 다음, 효소원으로 하였다. 조제한 효소원과 DL-glyceraldehyde를 기질로 하여 반응시키고 340nm에서 NADPH 흡광도의 감소율을 측정하였다. 공시험군은 기질인 DL-glyceraldehyde 만을 제외시켜 β-NADPH 이외의 타 요인에 의한 반응치를 보정하였다.
- 실시하였다. 즉 흰쥐의 수정체를 적출하고, 그 습중량에 따라 일정량의 phosphate buffer를 가하여 homogenization 하였다. 이를 4℃에서 원심분리한 후 그 상등액을 취하여 ammonium sulfate로 40%까지 포화시키고 원심분리한 상등액을 취하여 다시 70%가 되도록 ammonium sulfate를 가하여 1시간 가량 저어준 다음 원심 분리하여 얻어진 pellet을 최소량의 완충액에 현탁하여 투석을 1일정도 한 다음, 효소원으로 하였다.
대상 데이터
- 실험재료 - 산앵도나무(Vaccinium koreanum Nakai) 잎은 2000년 9월 중순에 충청북도 월악산에 자생하는 것을 채집하여 공주교대의 조선행박사가 정확히 감정한 후 사용하였다. 표본은 서울대학교 천연물과학연구소 표본실(SNUOO-9-3)에 보관되어 있다.
- ADR collagen 등은 Sigma-Aldrich Chemical Co.에서 구입하여 사용하였으며 DMSO 등 용매는 특급시약을 정제하지 않고 사용하였다.
이론/모형
- DPPH radical 소거 효과의 측정은 M.S. Blois20) 의 방법으로 실시하였다. 다양한 농도의 시료가 든 4 ml의 메탄올 용매에 1ml의 DPPHg.
- 혈소판이 응집함에 따른 투과도의 차이를 aggregometer를 사용하여 측정하는 기존의 혈소판 응집 검색법인 Bom and Cross의 turbidometry method에 기초하여 실험하였다.21) PRP를 thrombocounter를 사용하여 혈소판의 수를 측정하고 PPP로 혈소판의 수를 100만/mm2로 맞추었다.
성능/효과
- 각 분획물 중에서 DPPH 소거효과는 RLAR억제활성과 같이 에틸 아세테이트분획과 노르말-부탄올분획에서 각각 5.26와 7.98 μg/ml로 가장 강한 DPPH radical 소거효과를 보였다.
- 메탄올 추출물이 5.4μg/ml에서 RLAR의 활성을 50% 억제하는 비교적 강한 억제 활성을 나타내었으며, 이 추출물을 분획한 분획물들 중에서는 에틸아세테이트분획과 노르말-부탄올분획이 각각 2.4와 3.8 ㎍/ml 로 강한 억제 활성을 나타내었다.
- 나타냈다. 용매 분획들 중에 에틸아세테이트분획이 ADP 와 collagen유도 양쪽 모두에서 IC50값이 각각 0.082와 0.021 μg/ml로 가장 우수한 항혈전효과를 나타내었으며, 다음으로 크로로포름분획, 노르말-부탄올분획, 물분획 순으로 억제활성이 감소하였으며 헥산층의 경우 비극성으로 인하여 바로 침전이 형성되어 측정이 곤란하였다.
- mtrillus에 비하여 그 활용도나 성분 및 활성연구가 아주 미흡한 수준에 있다. 이 산앵도를 대상으로 RLAR 억제효과, DPPH radical 소거효과 및 항혈전효과를 알아 본결과, 비교적 극성이 높은 에틸아세테이트분획과 노르말-부탄올분획의 구성성분들이 RLAR억제활성 , DPPH radical 소거효과 및 항혈전효과를 강하게 가지는 것을 알 수 있었으며, 특히 분리 된 화합물 중 quercetin (Ⅲ)과 arbutin (Ⅴ) 그리고 chlorogenic acid (Ⅵ)가 시험관 실험상에서 우수한 RLAR 억제효과, DPPH radical 소거효과 및 항혈전효과를 나타내었다.
- 이들의 분획에서 분리한 6개 화합물 중 quercetin (Ⅲ)이 IC50(값이 1.4 μM로 가장 강력한 RLAR 억제활성을 나타내었으며 chlorogenic acid (VI), 2'-O-caffeoylarbutin(Ⅱ이 각각 3.54과 5.82 로 표준비교물질인 tetramethylene glutaric acid (TMG) 보다 센 RLAR 억제활성을 보였으며 , 그 다음 arbutin (V)이 TMG와 비슷하고, avicularin (Ⅳ)과 isoquercitrin (Ⅰ)은 RLAR억제활성이 약하게 나타났다.
- 항혈전효과는 물분획을 제외한 모든 용매분획과 분리된 물질에서, ADP에 의한 혈전 응집유도 때 보다 collagen으로 유도한 경우에서 더 민감하게 억제활성을 보이는 특징을 나타냈다. 용매 분획들 중에 에틸아세테이트분획이 ADP 와 collagen유도 양쪽 모두에서 IC50값이 각각 0.
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