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문제 정의
- 곽향과 광곽향은 그 기원 중 속과 종이 전혀 다른데 기인하여 정유성분의 구성성분과 조성의 차이를 비교, 분석한연구는 다수 보고 되었으나9,10,11)비휘발성 물질에 의한 비교, 분석연구는 보고되지 않은 실정으로 본 연구에서는 객관적인 품질평가 방법인 이화학적 평가법의 일환으로 HPLC를 통한 패턴을 비교 분석하여 보다 간편하게 곽향과 광곽향을 구별할 수 있는 기준을 제안하고 아울러 각각의 건조감량, 회분함량 및 산불용성 회분함량을 비교 분석하여 규격기준을 제안하고자 하였다.
제안 방법
- 함량을 측정하기 위해 HPLC법을 이용하였다. HPLC의 분석조건으로는 Phenomenex C18 column을 이용하여 acetonitrile : 2% acetic acid=22 : 78 (v/v)를 유속 1.0ml/min으로 하였고 검출파장은 320㎚에서 고정하여 실시하였다. Rosmarinic acid를 사용하여 검량선을 작성한 결과 직선성이 인정되었으며 회귀직선 방정식은 y = 25344.
- 0ml/min으로 하였고 검출파장은 320㎚에서 고정하여 실시하였다. Rosmarinic acid를 사용하여 검량선을 작성한 결과 직선성이 인정되었으며 회귀직선 방정식은 y = 25344.107x- 35522.000이고 상관계수는 0.998로서 1에 접근하여 이를 이용하여 곽향에 함유된 rosmarinic acid의 함량을 구하였다.
- 45㎛ syringe filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였다. 각각의 검액을 10μl씩 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram의 면적을 구하여 회귀직선 방정식으로부터 각각의 rosmarinic acid 함량을 구하였고 검체에 대해 3회 반복하여 함량을 %로 산출하였다(Scheme Ⅰ).
- 5㎍/ml로 단계적으로 희석하여 검액을 만들어 검량용 표준용액으로 하였다. 각각의 표준용액 10μl를 HPLCS로 분석하여 chromatogram의 면적을 구하고 이들의 면적과 표준용액의 농도를 변수로 한 검량선을 작성하였다.
- 건조감량시험 - 무게를 단 칭량병에 시료 2~6g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 규정시간동안(곽향 : 5시간, 광곽향 : 6시간) 건조하고, 데시케이터에서 방냉한 후 그 무게를 정밀하게 측정하였다. 이것을 다시 105℃에서 1시간 마다 무게를 측정하여 항량이 되었을 때의 감량을 건조 감량(%)으로 하였다.
- 검액의 조제 - 검체 4.0g을 정확히 평량하여 methanol 40ml를 가해 실온에서 1시간씩 3회 sonication으로 추출, 여과 및 감압 농축하여 methanol 추출물을 얻었다. Methanol 추출물을 H2O 10ml에 녹인 후 동량의 ether로 3회 탈지한 다음 H2O층을 감압 농축하였다.
- 건조하였다. 무게를 정밀하게 측정한 사기 도가니에서 3시간 강열(550℃하여 데시케이터에서 방랭한 후 그 무게를 정밀하게 측정하여 산불용성회분량(%)으로 하였다.
- 본 연구에서는 속과 종이 다른 곽향과 광곽향을 보다 간편하게 구분할 수 있는 이화학적 평가법의 일환으로 HPLC를 통한 패턴과 곽향의 rosmarinic acid의 함량을 비교 분석하고자 곽향과 광곽향의 시료를 검체로 사용하였고 건조 감량, 회분함량 및 산불용성 회분함량을 대한약전 일반시험법에 규정하고 있는 방법에 의해 3회 반복 시험하여 얻은 평균치를 Table Ⅰ에 정리하였다.
- 시료 2~4g을 사기도가니에 넣어 무게를 정밀하게 측정한 후회 화로에 넣어 서서히 온도를 올리면서 550℃에서 4시간 이상 가열하여 탄화물이 남지 않을 때까지 회화하여 데시케이터에서 방랭한 다음 무게를 정밀하게 측정하여 회분량(%)으로 하였다.
- 표준액의 조제 - Rosmarinic acid 1.06㎎을 HPLC용 methanol 2ml에 녹이고 이것을 stock solution으로 하여 530, 265, 132.5㎍/ml로 단계적으로 희석하여 검액을 만들어 검량용 표준용액으로 하였다. 각각의 표준용액 10μl를 HPLCS로 분석하여 chromatogram의 면적을 구하고 이들의 면적과 표준용액의 농도를 변수로 한 검량선을 작성하였다.
대상 데이터
- injector (Japan)를 사용하였다. Columne Luna C18 (4.6×250㎜, 5㎛, Phenomenex)를 사용하였고, 이동상으로는 acetonitrile : 2% acetic acid=22 : 78(v/v)이 되도록 하였다. 유속은 1.
- HPLC 조건 - HPLC는 Shimadzu LC-10Avp System으로서 SCL-lOAvp system controller, LC-lOATvp liquid chromatograph, SPD-lOAvp UV-VIS detector, SIL-lOADyp auto injector (Japan)를 사용하였다. Columne Luna C18 (4.
- A) HPLC grade 제품을 사용하였고, 분석 기기로 사용된 HPLC는 Shimadzu사 (Japan)의 SCL- lOAvp system controller, SIL-lOADvp auto injector, SPD-lOAvp UV-VIS detector, LC-lOATyp liquid chromatograph 를 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254(Merck) 와 RP-18 F254s(Merck)를 사용하였다. 회화로는 Bamstead Ther-molyne사의 F4800 Fumace를 사용하였다.
- 시약 및 기기 - 분석용 시약 중 표준시약인 rosmarinic acid는 ICN Biochemicals사 제품을 사용하였고, 시료의 추출 및 분석에는 1등급 용매를 사용하였으며 methanol, ethyl ethere TEDIA사 (U.S.A) HPLC grade 제품을 사용하였고, 분석 기기로 사용된 HPLC는 Shimadzu사 (Japan)의 SCL- lOAvp system controller, SIL-lOADvp auto injector, SPD-lOAvp UV-VIS detector, LC-lOATyp liquid chromatograph 를 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60 F254(Merck) 와 RP-18 F254s(Merck)를 사용하였다.
- 실험재료 - 본 연구에 사용한 국산인 곽향(蕾香, 4종)과 중국산인 광곽향(廣蕾香, 6종)은 2002년 우석대학교 한의과대학 본초학교실에서 수집하여 주영승 교수님이 감정한 후 분쇄하여 사용하였으며 표품(KIOM-02-12)은 한국한의학연구원 생약표본실에 보관되어 있다.
- TLC plate는 Kieselgel 60 F254(Merck) 와 RP-18 F254s(Merck)를 사용하였다. 회화로는 Bamstead Ther-molyne사의 F4800 Fumace를 사용하였다.
이론/모형
- 곽향과 광곽향의 pattern을 분석하고 곽향의 rosmarinic acid의 함량을 측정하기 위해 HPLC법을 이용하였다. HPLC의 분석조건으로는 Phenomenex C18 column을 이용하여 acetonitrile : 2% acetic acid=22 : 78 (v/v)를 유속 1.
성능/효과
- 1. 곽향과 광곽향의 크로마토그램 패턴은 전반적으로 다른 것으로 나타났다. 광곽향에서는 양의 차이는 있으나retention time 6.
- 2. 대한약전 외 한약(생약) 규격집과 대한약전에는 곽향과 광곽향의 건조감량을 13.0% 이하로 규정하고 있는데 각각의 시료에 대한 건조감량 시험 결과 평균 및 표준편차는 각각 8.964±1.556%, 8.901±1.239%이었고 시료 모두 13.0% 이하이므로 곽향과 광곽향은 건조감량 기준을 13.0% 이하로 규정하는 것이 타당하다고 생각된다.
- 3. 대한약전 외 한약(생약) 규격집과 대한약전에는 곽향과 광곽향의 회분함량을 각각 13.0% 이하, 3.0% 이하로 규정하고 있는데 각각의 건조감량 시험 결과 평균 및 표준편차는 6.305±0.735%, 7.062±1.312%이었으므로 곽향의 회분함량 기준은 13.0% 이하로 광곽향은 3.0% 이하에서 10.0% 이하로 상향조정하는 것이 타당하다고 생각된다.
- 4. 대한약전 외 한약(생약) 규격집에는 곽향의 산불용성 회분함량을 3.0% 이하로 규정하고 있는데 시험결과 곽향과 광곽향의 평균 및 표준편차는 각각 0.445±0.084%, 1.359± 1.371%이었으므로 곽향과 광곽향 모두 산불용성 회분함량 기준은 3.0% 이하로 규정하는 것이 타당하다고 생각된다.
- 곽향과 광곽향의 크로마토그램 패턴은 전반적으로 다른 것으로 나타났다. 광곽향에서는 양의 차이는 있으나retention time 6.458분과 8.162분대에서 2개의 주 peak가 공통적으로 검출되었고 곽향에서는 광곽향의 주 peak들이 검출되지 않았으나 retention time 14.996분대에서 rosmarinic acid가 평균 0.183±0.183%(n=4) 정도 검출되어 광곽향의 2개의 peak와 곽향의 1개의 peak는 곽향과 광곽향을 보다 간편하게 구분할 수 있는 마커가 될 수 있을 것으로 사료된다.
- 0% 이하를 초과하였다. 따라서 건조감량 규정을 곽향은 13.0% 이하로 광곽향은 3.0% 이하에서 10.0% 이하로 상향 조정 하는 것이 타당하다고 생각된다.
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