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문제 정의
- 본 실험은 양하 근경의 에탄올 추출물에 대해 activity-guided fractionation을 실시하여 항균유효성분으로 예상되는 3가지 화합물을 silica gel column chromatography 및 재결정 등을 이용하여 분리하였고, >H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 'H-'H COSY HMQC, HMBC 및 적외선 스펙트럼 등을 토대로 화학구조를 결정하였기에 그 결과를 보고한다.
제안 방법
- Mass 스펙트럼은 JEOL JMS-700 spectrometer(Japan)를 이용하였으며, 적외선 스펙트럼은 Broker IFS66 분광기 (FT-IR)를 사용하여 얻었다. 핵자기 공명 (H, "C-NMR, DEPT, 'H-'H COSY HMQC, HMBC) 스펙트럼은 Bruker-AW500(500 MHz, Germany) 분광기를 이용하여 측정하였다. 화학적 이동값(chemical shift)은 tetramethylsilane(TMS)을 기준물질로하여 ppm으로 나타내었다.
- 41)이 각각 상관관계를 보이므로 두개의 aldehyde group이 존재함을 알 수 있었다. 'H-'H COSY에서 proton간의 상관관계를 그리고 HMBC에서 long range coupling을 결정하였다. 화합물 II는 화합물 Ⅰ과 비교해 특징적으로 두개의 aldehyde group이 없어졌으며, aC-NMR spectrum에서 &71.
- 45μm membrane filter(Milipore, USA)로 여과하여 제균하고 멸균된 filter paper disk(Toyo, 8 pm, Japan)에 20μl씩을 흡수시킨 후, 용매를 완전히 휘산시키고 시험용 평판 배지 위에 놓아 밀착시키고 4℃ 냉장고에서 1시간 방치한 후, 32℃ incubator에서 12~24시간 배양한 다음 disk 주변의 clear zone의 직경을 측정하였다. Bioscreen C를 이용한 증식억제 효과검정은 각 균을 배양한 사면배지에서 1백금이를 취해 10m/ 액체배지에 접종하여 32℃ incubator에서 24시간 배양시킨 후 이배양액 0.1 ml를 다시 10mZ 액체배지에 접종하여 32℃ incubator에서 24시간 배양하여 균체 배양액을 만들었다. 분리한 화합물 중 가장 활성이 강한 화합물 I을 50, 25, 10 ppm이 되게 에탄올로 희석한 후 0.
- , UK)를 사용하여 측정하였으며 온도는 보정하지 않았다. Mass 스펙트럼은 JEOL JMS-700 spectrometer(Japan)를 이용하였으며, 적외선 스펙트럼은 Broker IFS66 분광기 (FT-IR)를 사용하여 얻었다. 핵자기 공명 (H, "C-NMR, DEPT, 'H-'H COSY HMQC, HMBC) 스펙트럼은 Bruker-AW500(500 MHz, Germany) 분광기를 이용하여 측정하였다.
- 에탄올 추출물을 농축하여 물층만 남긴 후 분별깔때기를 이용하여 약 5배의 핵산을 가하여 핵산분획물을 얻고(2회 반복) 동일한방법으로 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차로 가하여 각각의 순차 용매 분획물을 얻었다. 각 분획물을 rotary vacuum evaporator로 농축시킨 후 항균효과를 실험한 결과 에틸아세테이트층에서 활성이 나타나, 이 분획물(21g)을 소량의 클로로포럼에 용해시킨 후 silica gel(70~230mesh ASTM)로 충진시킨 column(7X 17 cm)에 loading하여 hexane/ethylacetate의 비율을 순차적으로 높이면서 column chromatography를 실시하여 얻어진 분획물들에 대한 항균실험을 수행하였다. 활성 분획을 다시 hexane : acetone = 12 : 1을 용매로 한 2차 column chromatography(silica gel 70-230 mesh, column 2.
- 실험에 사용한 균주는 gram 양성균인 Staphylococcus aureus ATCC 13301, Bacillus subtilis ATCC 9372 그리고 Bacillus cereus ATCC 27348를 한국미생물 보존센터(KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 균 생육배지로는 nutrient broth와 nutrient agar(Difco)를 사용하였고 항균활성 검색은 Bioscreen C (Labsystem, Helsinki, Finland)와 UV-Visible spectrophotometer(Varian, cary 100, AustuaHa)를 사용하였다.
- 1 ml를 다시 10mZ 액체배지에 접종하여 32℃ incubator에서 24시간 배양하여 균체 배양액을 만들었다. 분리한 화합물 중 가장 활성이 강한 화합물 I을 50, 25, 10 ppm이 되게 에탄올로 희석한 후 0.45 |j.m membrane Biter로 제균하고 액체 배지 9.8 m/에 각 농도별로 0.1 ml씩 첨가하였다. 이 각각의 배지에 균체 배양액 0.
- 항균물질의 분리 및 항균활성. 양하 근경의 75% 에탄올 추출물 중 에틸아세테이트층에 존재하고 있는 항균성 물질을 분리하기 위해 silica gel column chromatography를 반복적으로 실시하고, diethyl ether로 재결정을 하여 화합물 I, 0, HI을 각각 얻었다. 화합물 I, n 그리고 IH에 대한 물리 .
- 2)한 여액을 rotaiy vacuum evaporator(EYELA, Japan)로 농축하였다. 에탄올 추출물을 농축하여 물층만 남긴 후 분별깔때기를 이용하여 약 5배의 핵산을 가하여 핵산분획물을 얻고(2회 반복) 동일한방법으로 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차로 가하여 각각의 순차 용매 분획물을 얻었다. 각 분획물을 rotary vacuum evaporator로 농축시킨 후 항균효과를 실험한 결과 에틸아세테이트층에서 활성이 나타나, 이 분획물(21g)을 소량의 클로로포럼에 용해시킨 후 silica gel(70~230mesh ASTM)로 충진시킨 column(7X 17 cm)에 loading하여 hexane/ethylacetate의 비율을 순차적으로 높이면서 column chromatography를 실시하여 얻어진 분획물들에 대한 항균실험을 수행하였다.
- 사용기기. 융점 측정은 Tbmas Hoover Capollary Apparatus(Electrothermal 9200, Electrothermal Engineering Co., UK)를 사용하여 측정하였으며 온도는 보정하지 않았다. Mass 스펙트럼은 JEOL JMS-700 spectrometer(Japan)를 이용하였으며, 적외선 스펙트럼은 Broker IFS66 분광기 (FT-IR)를 사용하여 얻었다.
- 1 ml씩 첨가하였다. 이 각각의 배지에 균체 배양액 0.1 iW를 접종한 후 32℃(2에서 72시간 동안 배양하면서 12시간 간격으로 600nm에서 Bioscreen C를 이용하여 600nm에서 O.D.를 측정하여 증식억제효과를 검정하였다. 이때 시료를 녹이는데 사용한 에탄올량 만큼 대조구에 첨가하여 에탄올 자체의 항균력이 감안 되도록 하였다.
- 5 X 20 cm)를 실시하여 활성 분획을 2 분획으로 분리하여 모았다. 첫 분획을 diethyl ether로 재결정하여 화합물 1(670 mg)을 얻었고, 두번째 분획을 다시 metylene chloride: diethyl ether = 50:1을 용매로 column chromatography(silica gel 70~230 mesh, column 2X20 cm)를 실시하여 두 분획으로 나누었으며, 각각을 diethyl ether로 재결정하여 화합물 11(216 mg)와 화합물 IH(133 mg)을 얻었다.
- 각 분획물을 rotary vacuum evaporator로 농축시킨 후 항균효과를 실험한 결과 에틸아세테이트층에서 활성이 나타나, 이 분획물(21g)을 소량의 클로로포럼에 용해시킨 후 silica gel(70~230mesh ASTM)로 충진시킨 column(7X 17 cm)에 loading하여 hexane/ethylacetate의 비율을 순차적으로 높이면서 column chromatography를 실시하여 얻어진 분획물들에 대한 항균실험을 수행하였다. 활성 분획을 다시 hexane : acetone = 12 : 1을 용매로 한 2차 column chromatography(silica gel 70-230 mesh, column 2.5 X 20 cm)를 실시하여 활성 분획을 2 분획으로 분리하여 모았다. 첫 분획을 diethyl ether로 재결정하여 화합물 1(670 mg)을 얻었고, 두번째 분획을 다시 metylene chloride: diethyl ether = 50:1을 용매로 column chromatography(silica gel 70~230 mesh, column 2X20 cm)를 실시하여 두 분획으로 나누었으며, 각각을 diethyl ether로 재결정하여 화합물 11(216 mg)와 화합물 IH(133 mg)을 얻었다.
대상 데이터
- 실험재료. 본 실험에 사용한 양하(Zingiber mioga Roscoe)의 근경은 제주 애월읍 부근의 자생지에서 채취, 동정 ')하여 음건하였고, 음건된 식물체는 세절하여 분쇄한 후 실험재료로 사용하였다.
- 사용균주 및 재료. 실험에 사용한 균주는 gram 양성균인 Staphylococcus aureus ATCC 13301, Bacillus subtilis ATCC 9372 그리고 Bacillus cereus ATCC 27348를 한국미생물 보존센터(KCCM)에서 분양받아 사용하였다. 균 생육배지로는 nutrient broth와 nutrient agar(Difco)를 사용하였고 항균활성 검색은 Bioscreen C (Labsystem, Helsinki, Finland)와 UV-Visible spectrophotometer(Varian, cary 100, AustuaHa)를 사용하였다.
이론/모형
- 항균력 검정. 시료의 항균력 검색은 한천배지확산법(disk agar plate diffusion method)3,4)으로 clear zone의 직경을 측정하는 것과 Bioscreen C로 optical density(O. D.)를 측정하여 증식억제효과를 검정하였다 . 한천배지확산법은 시료용액을 농도별로 0.
성능/효과
- 94에서 각각 18번, 19번 그리고 20번의 singlet인 methyl proton^l 관측되었으며, 13C-NMR spectrum에서 모두 20개의 carbon signal이 관측되었다. DEPT90, 135를 이용하여 1차 carbon이 3개, 2차 carbon이 8개, 3차 carbon이 5개 그리고 4차 carbon01 4개가 존재함을 알 수 있었고, HMQC에서 C-150196.8)와 H-15(s. 69.64)이 그리고 C-160193.1)와 H-16(s. 69.41)이 각각 상관관계를 보이므로 두개의 aldehyde group이 존재함을 알 수 있었다. 'H-'H COSY에서 proton간의 상관관계를 그리고 HMBC에서 long range coupling을 결정하였다.
- 그러나 50 ppm 처리시에는 72시간까지 완전 증식억제 효과를 나타내었다. S. aureus에서는 25ppm 이상의 농도에서 72시간까지 완전히 증식이 억제되는 것을 보였지만 10 ppm 처리에서는 48시간 이후에 혼탁도 증가가 나타났다.
- 5 |ig/disk 이상의 농도에서 세가지 세균 모두에 활성이 나타났다. 농도별로 clear zone을 비교해 볼 때 세 화합물 중에서 화합물 I이 가장 강한 활성을 보임을 알 수 있었다. 이와 같이 가장 활성이 강한 화합물 I을 Bioscreen C로 O.
- D.를 측정하여 증식억제효과를 실험한 결과(Fig. 1) B. subtilis와 B. cerg에서는 실험 최소농도인 10ppm 처리시에도 60시간까지 완전 증식억제효과를 보였지만 60시간 이후에는 10ppm과 25 ppm에서 약간의 혼탁도 증가를 보였다. 그러나 50 ppm 처리시에는 72시간까지 완전 증식억제 효과를 나타내었다.
- 분리된 세 화합물에 대한 한천배지확산법 (disk-agar plate diffusion method) 항균활성실험결과(Table 2) 화합물 I은 B. Subtilis에서 실험 최소농도인 6.25 μg/disk에서도 활성이 나타났으며, B. cereus와 S. aureus에서는 12.5 |ig/disk 이상에서 모두 활성이 나타났다. 화합물 II는 B.
- 화학적인 특성은 Table 1과 같다. 세 화합물 모두 무색의 침상결정이였으며, phosphomolybdic acid 및 anisaldehyde에 양성반응을 보였고 세 화합물 모두 분자량이 318로 동일했다.
- 그리고 화합물 m은 3491 cmT'에서 O-H 흡수띠가 1712cmT과 1676cnT'에서 두개의 carbonyl group 흡수띠와 1639cmT에서 C = C의 흡수띠가 관찰되었다. 이상의 분광학적 자료와 문헌조사결과5,6)를 비교할 때 화합물 I, 0, III은 각각(E)-8 p( 17)-epoxylabd-12-ene-15, 16-dial, galanolactone 그리고 galanal A임이 확인되었다(Fig. 2).
- 38의 proton peak에 의해 lactone group이 있음을 알 수 있었다. 화합물 III은 특징적으로 화합물 I의 'H-NMR spectrum에서 2개의 doublet 52.30(J = 3.5 Hz), 52.43(J = 3.5 Hz)이 나오지 않는 것으로 보아 epoxy group이 없어졌음을 알 수 있었다.
- 'H-'H COSY에서 proton간의 상관관계를 그리고 HMBC에서 long range coupling을 결정하였다. 화합물 II는 화합물 Ⅰ과 비교해 특징적으로 두개의 aldehyde group이 없어졌으며, aC-NMR spectrum에서 &71.7의 4차 carbonyl group과 'H-NMR spectrum에서 2H분의 54.38의 proton peak에 의해 lactone group이 있음을 알 수 있었다. 화합물 III은 특징적으로 화합물 I의 'H-NMR spectrum에서 2개의 doublet 52.
- 화합물 I의 적외선 스펙트럼에서 1736 cnr'과 1684 ck에서 두개의 carbonyl group 흡수띠와 1630cnr'에서 C = C의 흡수띠가 관찰되었으며, 화합물 II에서는 1758cmT에서 lactone carbonyl group 흡수띠와 1676cm1에서 C = C의 흡수띠가 관찰되었다. 그리고 화합물 m은 3491 cmT'에서 O-H 흡수띠가 1712cmT과 1676cnT'에서 두개의 carbonyl group 흡수띠와 1639cmT에서 C = C의 흡수띠가 관찰되었다.
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