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문제 정의
- 본 연구에서는 한방에서 쓰이고 있는 많은 종류의 재료에 대한 항종양효과의 연속적인 탐색과정 중에서 동과자 추출물 단독의 종양세포 생육억제 효과를 확인하였고, 방사선과 병용 처리시 종양세포주에 대한 병용투여효과를 확인하였다.
제안 방법
- Organic solvent 추출물로 사용된 동과자는 분말화하여 20g을 200 mL의 ethanol, butanol 및 chloroform에 넣고 각각 상온에서 24시간 동안 추출 후 감압 농축하여 사용하였고 열수 추출물은 동과자 20g을 200mL의 증류수(distilled water, DW)로 100℃와 121℃에서 각각 1시간 동안 중탕한 후 원심 분리하여 상층액을 감압 농축하였다.
- 각각의 종양세포주 5×105 cells/ mL를 100μL씩 96 well에 분주하여 24시간 예비배양 한 후, 시료를 l00μL 접종하여 48시간 동안 노출시켰다. 노출 완료 후 MTT solution(0.5 mg/mL)을 50μL씩 각각 첨가하여 형성된 formazan을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여 multiwell scanning spectrophotometer(microplate autoreader, Bio-Tek instrument, Vermont, Winooski, USA)로 570nm 에서 흡광도를 측정하였다. 항종양효과는 세포성장 저해율로 평가하였다.
- 5×104 cells/mL를 450μL씩 4 well에 분주하여 24시간 예비배양 한 후, 시료를 세포에 50μL씩 첨가하여 48시간 노출시켰다. 노출완료 후에 방사선 5Gy를 조사하여 PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척한 후, 새로운 배지 500μL로 5일간 배양하여 방사선에 대한 감작 효과를 측정하였다. 방사선 조사는 Gammamcell 3000(Tuc-son, Arizona, USA)을 사용하였으며 방사선원은 137Cs 동위원소로 3.
- 종양세포는 L1210(mouse leukemia)을 이용하였다. 마우스 당 1×106 cells를 복강 내에 주입한 후, 다음 날부터 1주 동안 5회씩 동과자 추출물을 각각 0.01 g/kg, 0.1 g/kg의 농도로 경구투여 하였다. 마우스의 생존율은 30일까지 관찰하였고, 항종양효과는 생존율을 매일 계산하여 사망할 때까지의 적분비 (inhibition rate)로 환산하여 생명 연장율(increased life span, ILS)로 나타내었다.
- 1 g/kg의 농도로 경구투여 하였다. 마우스의 생존율은 30일까지 관찰하였고, 항종양효과는 생존율을 매일 계산하여 사망할 때까지의 적분비 (inhibition rate)로 환산하여 생명 연장율(increased life span, ILS)로 나타내었다.
- 1은 동과자 열수 추출물(10CTC)의 in vivo 성장저해효과 평가의 결과를 나타낸 것이다. 본 실험에서는 마우스 몸무게 kg당 열수 추출물을 각각 0.01g 및 0.1g을 투여하였다. 대조군의 평균 생존일수(maximum survival time, MST)는 19.
- 사육조건은 위와 동일하게 유지하였다. 투여 경로는 경구로 하였으며 체중은 주 2회 측정하였다.
- 5 mg/mL)을 50μL씩 각각 첨가하여 형성된 formazan을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여 multiwell scanning spectrophotometer(microplate autoreader, Bio-Tek instrument, Vermont, Winooski, USA)로 570nm 에서 흡광도를 측정하였다. 항종양효과는 세포성장 저해율로 평가하였다.
대상 데이터
- A-549, SK-OV-3 및 Farrow 세포주는 RPMI 1640, HEp-2 세포주는 MEM, 그리고 P388 세포주는 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(FBS, heat inactivated)을 함유한 배지를 사용하였으며 SK-MES-1과 3LL 세포주는 MEM 배지에 10% FBS(HI)와 1% penicillin/streptomycin, 1% glutamine, 1% nonessential amino acid, 1% sodium pyruvate 및 1% MEM vitamin을 함유한 배지를 사용하여 37℃에서 5% CO2를 함유하는 대기 조건 하에서 배양하였다.
- Acute toxicity: 단 회 투여에 의한 독성은 6주령 ICR mice 암 · 수컷 각각 5마리씩 하였으며, 본 독성 실험에 사용한 농도 군은 0.5, 1, 2 및 4g/kg이었다. 사육조건은 위와 동일하게 유지하였다.
- In vivo antitumor activity: 마우스를 이용한 항종양효과의 측정을 위한 실험동물은 중앙실험동물로부터 BDF1 mouse(6주령, 수컷)를 공급받았으며, 사육조건은 온도 22~24℃, 습도는 60-70%, 사료는 펠렛형 사료로 자유급식, 음수는 삼투 여과한 물을 공급하였다. 종양세포는 L1210(mouse leukemia)을 이용하였다.
- 노출완료 후에 방사선 5Gy를 조사하여 PBS (phosphate buffered saline)로 2회 세척한 후, 새로운 배지 500μL로 5일간 배양하여 방사선에 대한 감작 효과를 측정하였다. 방사선 조사는 Gammamcell 3000(Tuc-son, Arizona, USA)을 사용하였으며 방사선원은 137Cs 동위원소로 3.6Gy/min을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 종양세포주는 A549(human lung carcinoma), Farrow(human melanoma carcinoma), HEp-2(human larynx carcinoma), SK-MES-1 (human lung carcinoma), SK-OV-3(human ovary carcinoma), 3LL(mouse Lewis lung carcinoma) 및 L1210(mouse leukemia)을 사용하였으며, GiBccr사(Life Technologies, INC., Rockville, Maryland, USA)의 배지를 이용하여 배양하였다.
- 본 연구에 사용한 동과자는 서울시 제기동 경동시장의 한약 건재상에서 2001년 7월경 구입하여 사용하였다.
- 물을 공급하였다. 종양세포는 L1210(mouse leukemia)을 이용하였다. 마우스 당 1×106 cells를 복강 내에 주입한 후, 다음 날부터 1주 동안 5회씩 동과자 추출물을 각각 0.
이론/모형
- Radiosensitivity: 방사선에 대한 항종양효과의 상승효과는 SRB assay를 이용하였다(15). 5×104 cells/mL를 450μL씩 4 well에 분주하여 24시간 예비배양 한 후, 시료를 세포에 50μL씩 첨가하여 48시간 노출시켰다.
- 동과자 추출물에 대한 항종양효과를 알아보기 위하여 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하였다(14). 각각의 종양세포주 5×105 cells/ mL를 100μL씩 96 well에 분주하여 24시간 예비배양 한 후, 시료를 l00μL 접종하여 48시간 동안 노출시켰다.
성능/효과
- 1g을 투여하였다. 대조군의 평균 생존일수(maximum survival time, MST)는 19.2±2.0일이었으나 동과자 열수 추출물 0.01 g/kg 투여군의 평균 생존일수는 22.5±3.1 일이었고, 0.1 g/kg 투여군의 평균생존일수는 23.2±2.8일로 나타났다. 항종양효과는 생존율을 매일 계산하여 사망할 때까지의 대조군과 처리구의 적분비(inhibition rate)로 환산하여 생명연장율(increased life span, ILS)로 나타냈을 때 대조군에 비하여 0.
- 동과자 열수 추출물의 in vitro 항암효과는 2 mg/mL의 농도에서 가장 높게 나타났으며 in vivo 싱에서의 0.1 g/kg, 0.01 g/kg의 경구 투여시 각각 21%, 17%의 생명연장율(increased life span, ILS)을 나타내었다. SK-OV-3에 대한 SRB assay를 이용한 열수 추출물(2mg/mL)의 방사선(5 Gy) 병용 투여에 있어서 86%의 저해효과를 나타내었다.
- 열수 추출물의 경우는 유기용매 추출물보다 2배 이상의 성장저해효과가 나타났으며, 온도에 따른 효과는 121℃보다는 lOUC에서 추출하는 것이 우수하게 나타났다. 따라서 유기용매에 의한 추출보다 열수에 의한 추출이 효과적임을 확인하였다. 또한 동과자의 종양세포 억제물질의 추출은 100℃ 에서 물로 추출하는 것이 본 실험에서 사용한 추출방법 중 가장 우수한 것으로 평가되었다.
- 따라서 유기용매에 의한 추출보다 열수에 의한 추출이 효과적임을 확인하였다. 또한 동과자의 종양세포 억제물질의 추출은 100℃ 에서 물로 추출하는 것이 본 실험에서 사용한 추출방법 중 가장 우수한 것으로 평가되었다. 본 연구 결과에는 나타내지 않았으나 clonogenic assay를 이용한(17) 열수 추출물(100℃)의 항종양 억제 효과 측정시 7종의 세포주에 대해 80%이상의 높은 저해 효과를 나타내었으며 농도에 따른 저해 효과 측정시 2mg/mL에서 높은 저해 효과를 나타내었다.
- 또한 동과자의 종양세포 억제물질의 추출은 100℃ 에서 물로 추출하는 것이 본 실험에서 사용한 추출방법 중 가장 우수한 것으로 평가되었다. 본 연구 결과에는 나타내지 않았으나 clonogenic assay를 이용한(17) 열수 추출물(100℃)의 항종양 억제 효과 측정시 7종의 세포주에 대해 80%이상의 높은 저해 효과를 나타내었으며 농도에 따른 저해 효과 측정시 2mg/mL에서 높은 저해 효과를 나타내었다.
- 2에 나타내었다. 열수 추출물 단일처리시 A549는 성장저해율 23%을 나타냈으며, SK-OV-3는 성장저해에 대하여 아무런 영향을 주지 못하는 것으로 나타났다. 그리고 방사선 5 Gy 단독조사시 A549와 SK- OV-3이 각각 46%와 40%이었다.
- Buthanol 및 ethanol 추출 분획의 경우에는 모든 종양세포에 대하여 성장저해효과가 나타나지 않았다. 열수 추출물의 경우는 유기용매 추출물보다 2배 이상의 성장저해효과가 나타났으며, 온도에 따른 효과는 121℃보다는 lOUC에서 추출하는 것이 우수하게 나타났다. 따라서 유기용매에 의한 추출보다 열수에 의한 추출이 효과적임을 확인하였다.
- 나타나지 않았다. 즉 본 독성 실험에 사용된 0.5, 1, 2 및 4g/kg의 모든 농도군에서 투여에 의한 폐사 및 반사동물은 전혀 없었다. 투여 후 관찰 기간 14일까지 대조군과 같은 체중변화를 보였으며 사료 및 음수량도 대조군과 유의차는 인정되지 않았다.
- 5, 1, 2 및 4g/kg의 모든 농도군에서 투여에 의한 폐사 및 반사동물은 전혀 없었다. 투여 후 관찰 기간 14일까지 대조군과 같은 체중변화를 보였으며 사료 및 음수량도 대조군과 유의차는 인정되지 않았다. 그리고 14일 이후 살아있는 모든 개체에 대한 도살부검을 실시한 결과 장기의 외관적 이상소견을 발견되지 않았고, 농도에 따른 차이도 전혀 발견할 수 없었다.
- 8일로 나타났다. 항종양효과는 생존율을 매일 계산하여 사망할 때까지의 대조군과 처리구의 적분비(inhibition rate)로 환산하여 생명연장율(increased life span, ILS)로 나타냈을 때 대조군에 비하여 0.01g/kg과 0.1 g/kg 투여군은 각각 17%와 21%의 생명연장율(increased life span, ILS)이 확인되었다. 따라서 항종양효과가 있는 것으로 판단된다.
후속연구
- 앞에서 언급했듯이 특히 동약 항암제는 대부분이 체내에서 오래 머무르며 혈중 농도를 보장하여 효과를오래 가게 하므로(1) 방사선 감작제라는 약제를 적절하게 선택하여 항암화학요법을 방사선치료와 동시에 시행하여 약제및 치료보조제의 발달을 기대할 수 있을 것이다. 또한 방사선치료기술의 발달로 그 치료효과를 높이면서 부작용을 감소시키는 방법이 될 수 있을 것이라 사료된다.
- 따라서 동과자의 열수 추출물이나 방사선의 단독 처리에 의한 항종양 효과보다는 두 가지를 병용했을 경우 종양세포 증식억제효과에 대한 상승효과가 있는 것으로 판단된다. 앞에서 언급했듯이 특히 동약 항암제는 대부분이 체내에서 오래 머무르며 혈중 농도를 보장하여 효과를오래 가게 하므로(1) 방사선 감작제라는 약제를 적절하게 선택하여 항암화학요법을 방사선치료와 동시에 시행하여 약제및 치료보조제의 발달을 기대할 수 있을 것이다. 또한 방사선치료기술의 발달로 그 치료효과를 높이면서 부작용을 감소시키는 방법이 될 수 있을 것이라 사료된다.
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