[논문]동과자 추출물의 항산화, 항염 및 미백 효능

박규리; 이지안

doi:10.22156/cs4smb.2020.10.07.249

동과자 추출물의 항산화, 항염 및 미백 효능
Anti-oxidant, anti-inflammatory and Whitening effect of Benincasa hispida seed extract 원문보기

융합정보논문지 = Journal of Convergence for Information Technology, v.10 no.7, 2020년, pp.249 - 256

박규리 (서경대학교 일반대학원 미용예술학과) , 이지안 (서경대학교 일반대학원 미용예술학과)

초록
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본 연구는 피부 관리에 사용되는 천연화장품 원료로서 동과자 추출물의 활용 가능성을 조사하기 위해 항산화, 항염 그리고 미백 효능을 평가하였다. DPPH 자유라디컬 소거 활성은 농도 의존적으로 감소하였으며, 총폴리페놀 함량은 메탄올추출물(22.42±0.002 mgGAE/g)이 열수추출물(9.77±0.002 mgGAE/g)보다 더 높게 나타났다. MTT assay 결과 동과자 추출물에 의한 RAW264.7 세포와 B16F10 세포에서의 세포독성은 없었다. 또한 LPS 처리에 의해 활성화된 RAW264.7 세포에서 NO 생성과 TNF-α 분비 억제능을 확인하였다. B16F10 melanoma 세포에서 동과자 추출물은 α-MSH에 의한 멜라닌 합성을 유의하게 저해하는 것으로 나타났다. 게다가, westernblot 분석결과 동과자 메탄올추출물은 MITF, TRP-1 및 TRP-2 단백질의 발현 수준을 현저하게 감소시켰다. 이상의 결과로 동과자 추출물은 항산화, 항염 그리고 미백 효능을 가진 기능성 화장품 소재로써의 가치가 높을 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

To investigate the natural cosmetic ingredients of Benincasa hispida seed extract on skin care, we measured anti-oxidant and anti-inflammatory, and whitening effect. DPPH free radical scavenging activity was increased in a dose-dependent manner. The total phenolic content was higher in methanol extract (22.42±0.002 mgGAE/g) than water extract (9.77±0.002 mgGAE/g). MTT assay was demonstrated that the seed extract did not have a cytotoxic effect in RAW264.7 and B16F10 cell lines. We also examined to find out the inhibitory activity on NO production and secretion of TNF-α cytokine in LPS-induced RAW264.7 cells. In B16F10 melanoma cells, the seed extract significantly suppressed α-MSH induced melanin synthesis. Furthermore, westernblot analysis revealed that methanol extract dramatically downregulated the expression level of MITF, TRP-1 and TRP-2. Taken together, the B. hispida seed extract posses anti-oxidant, anti-inflammatory and skin whitening activities, which might provided its functional efficacy in cosmetic materials.

주제어

표/그림 (9)

그림 Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of B. hispida extract.
그림 Fig. 2. Cell viability of B. hispida extract on RAW264.7 cells.
표 Table 1. Total polyphenol contents (TPC) of B. hispida extract.
그림 Fig. 3. Cell viability of B. hispida extract on B16F10 cells.
그림 Fig. 4. NO production of B. hispida extract on RAW264.7 cells.
그림 Fig. 5. TNF-α secretion of B. hispida extract on RAW264.7 cells.
그림 Fig. 6. Mushroom tyrosinase inhibition activity of B. hispida extract.
그림 Fig. 7. Melanin production of B. hispida extract.
그림 Fig. 8. MITF, TRP-1 and TRP-2 protein expression level of B. hispida extract on melanoma cells.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 동과자 메탄올 또는 열수추출 물을 이용하여 라디컬 소거능, 항염, 미백 효능 등을 평가하여 천연자원물 기반 기능성 화장품 원료로서 활용 가능성을 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 동과자 추출물의 천연 화장품원료로 서의 가능성을 알아보기 위해 DPPH 라디컬소거능, 총폴리페놀 함량, NO 생성 저해능, TNF-α 분비 억제능, tyrosinase 저해 활성능, 멜라닌 함량 및 관련 단백질 발현수준 등을 평가하였다.

제안 방법

세포를 차가운 PBS로 두 번 washing한 후 RIPA buffer(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 첨가하여 얼음에서 방치하였다. 30분 후 13,000 rpm과 4℃ 조건에서 15분간 원심 분리해 그 상등액을 대상으로 Bradford assay를 수행하여 단백질을 정량하였다. 10% SDS-PAGE에 전기영동이 끝난 gel을 PVDF membrane으로 transfer하고 5% BSA가 함유된 TBST(tris buffered saline containing 0.
B16F10 세포에 동과자 추출물 처리에 따른 미백효 능을 조사하기 위해 Hosoi의 방법을 변형하여 분비된 멜라닌 함량을 측정하였다[14]. B16F10 세포(2x10⁴ cells/well/6 well)에 농도별로 제조한 추출물 또는 양성대조물질 kojic acid(0.
TRP-1, TRP-2, MITF 1차 항체를 상온에서 2시간 정도 처리한 후 TBST로 10분간 3회 세척하였다. HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG를 희석하여 상온에서 1시간 반응 시키고 세척한 다음 Chemiluminescence detection kit (EZ-Western Lumi Pico, DoGen, Seoul, Korea)로 단백질을 검출하였다[15].
RAW264.7 세포를 염증유도물질 LPS로 자극한 후동과자 추출물에 의한 NO의 생성변화를 알아보고자 Griess reagent 방법을 변형하여 측정하였다[12]. 세포를 계수하여 24 well plate의 한 well당 1x10⁵ cells로 넣고 16시간을 배양한 후, LPS (100 ng/mL) 와 농도별로 제조한 추출물을 24시간 처리하였다.
1% Tween20)에 넣어 상온에서 1시간 blocking하였다. TRP-1, TRP-2, MITF 1차 항체를 상온에서 2시간 정도 처리한 후 TBST로 10분간 3회 세척하였다. HRP(horse radish peroxidase)가 결합된 anti-rabbit IgG를 희석하여 상온에서 1시간 반응 시키고 세척한 다음 Chemiluminescence detection kit (EZ-Western Lumi Pico, DoGen, Seoul, Korea)로 단백질을 검출하였다[15].
Tyrosinase 저해활성은 Lee의 방법을 변형하여 측정하 였다[13]. 0.
7 (mouse macrophage cell line)은 한국 세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용 하였다. 각 세포는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 DMEM (Welgene, Korea)배지에서 37^o C, 5%CO₂ 조건하의 배양기에서 배양하였다.
건조중량 150 g에 각각 80% 메탄올(BM) 또는 정제수(BW)를 2L씩 첨가하고 50℃에서 15시간 추출·여과하였다.
총폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 변형해 측정하 였다[11]. 농도별로 제조한 추출물과 Folin-Denis reagent를 같은 양으로 배합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후, 10% Sodium carbonate(Na 2 CO 3 )를 첨가 하였다. 1시간 동안 암조건 하에서 방치 한 후, 상등액을 96 well plate에 옮긴 후 760 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
동과자 메탄올과 열수추출물의 NO 생성저해능을 조사하기 위해 LPS로 활성된 RAW264.7 세포에 각추출물을 농도별로 처리한 후 생성된 NO 양을 griess 시약분석법을 사용하여 측정한 결과 Fig. 4와 같다. 세포에 LPS (100 ng/mL) 처리 후 NO 생성량은 세포만 배양한 대조군에 비해 약 2.
동과자 메탄올과 열수추출물의 항산화 활성을 조사 하기 위해 DPPH 라디컬 소거능과 총폴리페놀 함량을 측정하였다. 그 결과 두 추출물의 처리 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였으며, 특히 메탄올추출물의 항산화 활성이 열수추출물보다 높게 나타났다.
동과자 추출물의 라디컬 소거능은 Blios의 방법을 변형하여 측정하였다[10]. 농도별로 제조한 추출물 100 ㎕와 200 μM DPPH 용액 100 ㎕를 배합해 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm파장에서 흡광도를 측정하였다.
louis, MO, USA) 40 ㎕, 1500 unit으로 제조한 mushroom tyrosinase 20 ㎕를 넣고 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 종료 후 tyrosinase에 의해 DOPA (3,4-dihyroxyphenylalanie)로부터 형성되는 DOPA chrome의 양을 490 nm 파장에서 측정하였다.
세포를 계수하여 24 well plate의 한 well당 1x105 cells로 넣고 16시간을 배양한 후, LPS (100 ng/mL) 와 농도별로 제조한 추출물을 24시간 처리한 후, 세포 배양액 내 TNF-α 분비량을 Mouse TNF ELISA Set II kit (BD OptEIA TM , USA)를 이용하여 측정하였다.
81%로 나타났다. 이러한 결과는 RAW264.7 세포를 대상으로 추출물의 항염 효능 평가할 때, 세포 생존 율이 80%이상으로 세포사멸에 의한 영향 없이 염증 억제 활성을 측정할 수 있는 조건이므로[18], 추후 항염 효능은 동일한 농도 조건에서 수행하였다.
동과자 추출물 처리 농도에 따른 세포독성은 MTT assay를 통해 평가하였다. 쥐의 대식세포 RAW264.7을 계수하여 96 well plate의 한 well당 3x10⁴ cell로 넣고 16시간을 배양한 후, LPS (100 ng/mL) 또는 농도별로 제조한 추출물을 24시간 처리하였다. 배양액에 최종 농도 0.
쥐의 대식세포에 염증유도 물질 LPS로 염증반 응을 유도한 후 동과자 추출물의 항염 활성을 각각 NO 생성 저해능과 TNF-α 분비 억제능으로 확인하였다.
총폴리페놀 함량은 Folin-Denis법을 변형해 측정하 였다[11]. 농도별로 제조한 추출물과 Folin-Denis reagent를 같은 양으로 배합하여 실온에서 5분간 반응시킨 후, 10% Sodium carbonate(Na 2 CO 3 )를 첨가 하였다.

대상 데이터

B16F10 (mouse melanoma cell line)과 RAW264.7 (mouse macrophage cell line)은 한국 세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용 하였다. 각 세포는 10% fetal bovine serum과 1% penicillin/streptomycin(100 U/mL)을 첨가한 DMEM (Welgene, Korea)배지에서 37^o C, 5%CO₂ 조건하의 배양기에서 배양하였다.
건조된 동과자는 2019년 10월에 구록원 (http://www.sasum9.com)에서 총 300 g을 구입하여본 실험에 사용하였다. 건조중량 150 g에 각각 80% 메탄올(BM) 또는 정제수(BW)를 2L씩 첨가하고 50℃에서 15시간 추출·여과하였다.
농도별로 제조한 추출물 100 ㎕와 200 μM DPPH 용액 100 ㎕를 배합해 37℃ 에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물질로 vitamin C (30 ㎍/mL) 를 사용하였다

데이터처리

본 연구에서의 모든 결과는 평균±표준편차로 표기 하였다.
평균값 간의 유의성은 student's t-test를 사용 하여 p-value값을 계산해 통계적으로 유의성 검증을 실시하였다.

이론/모형

동과자 추출물 처리 농도에 따른 세포독성은 MTT assay를 통해 평가하였다. 쥐의 대식세포 RAW264.
멜라닌 생합성 각 단계에 관여하는 microphthalmiaassociated transcription factor (MITF)와 tyrosinase related protein 1 (TRP-1) 및 tyrosinase related protein 2 (TRP-2)의 단백질 발현 변화양상을 western blot 방법으로 분석하였다. 세포를 차가운 PBS로 두 번 washing한 후 RIPA buffer(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 첨가하여 얼음에서 방치하였다.

성능/효과

그결과 메탄올추출물은 NO 생성과 TNF-α 분비를 현저 하게 감소시켰다. B16F10 melanoma 세포에서 동과자 메탄올추출물은 tyrosinase 저해활성과 멜라닌 생성및 멜라닌 생성에 관련된 MITF, TRP-1, TRP-2 유전 자의 단백질 발현 수준을 감소시켰다.
동과자 메탄올과 열수추출물의 항산화 활성을 조사 하기 위해 DPPH 라디컬 소거능과 총폴리페놀 함량을 측정하였다. 그 결과 두 추출물의 처리 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였으며, 특히 메탄올추출물의 항산화 활성이 열수추출물보다 높게 나타났다. 또한 메탄올추출물의 총폴리페놀 함량(22.
7과 같다. 동과자 메탄올과 열수추출물의 멜라닌 생합성 저해능은 각 추출물 처리 농도 증가에 따라 높게 나타났다.
6과 같다. 동과자 메탄올추 출물과 열수추출물의 저해활성능은 최고농도 1 mg/mL에서 각각 36.24%와 17.44%로 나타났다. 이러한 결과는 김원희[21]의 연구에서 비극성 용매 methylene chloride로 추출한 동과자의 경우 50% 이상의 tyrosinase 활성 억제를 확인한 반면 n-BuOH 또는 H ₂ O의 경우 저해활성이 낮아, 선택된 추출 용매에 의해 tyrosinase 활성이 영향을 받는다는 것을 시사 한다.
동과자 열수추출 물에 비해 메탄올추출물의 TNF-α 분비 억제는 농도 의존적으로 현저하게 증가하였다.
따라서 동과자 메탄올추출물은 α-MSH 자극에 의한 세포내 tyrosinase 활성억제와 함께 멜라닌 생합성에 관련된 MITF, TRP-1, TRP-2 유전자의 발현 감소를 통해 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 확인된다.
또한 메탄올추출물의 총폴리페놀 함량(22.42±0.002 mgGAE/g) 은 열수추출물(9.77±0.002 mgGAE/g) 보다 2.3배 더높았다.
메탄올추출물 내 총폴리페놀 함량은 22.42±0.002 mgGAE/g, 열수추출물은 9.77±0.002 mgGAE/g으로 메탄올추출물이 2.3배 높았다.
Abdullah[16] 등은 열수추 출법을 이용한 동과의 부위별 DPPH 라디컬 소거능이 각각 씨앗, 과육, 껍질 순으로 높은 활성을 나타낸다고 보고하였다. 본 연구에서는 동과자 열수추출물과 메탄올 추출물의 DPPH라디컬 소거능을 비교하였으며 그 결과 메탄올 추출물의 항산화 활성이 더 우수함을 확인하였 다. 따라서 최적 추출법에 따른 유효성분의 효능 극대화를 위해 동일 소재에 대한 다양한 추출법 적용에 관한 연구가 필요하다고 사료된다.
2와 같다. 세포만 배양한 경우를 100%로 기준할 때 LPS만 처리한후 99.65%로 나타났으며, 각 추출물 처리농도(0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mL)에 따른 메탄올추출물의 세포생존율은 97.64%, 97.32%, 95.59%, 93.33%, 열수추출물은 97.8%, 97.19%, 89.58%, 87.93%, 85.81%로 나타났다. 이러한 결과는 RAW264.
3과 같다. 세포만 배양한 대조군을 100%로 기준하였을 때 메탄올 또는 열수추출물에 의한 세포생존율은 대조군과 유의한 수준으로 나타나 각추출물에 의한 세포독성이 없음을 확인하였다.
4와 같다. 세포에 LPS (100 ng/mL) 처리 후 NO 생성량은 세포만 배양한 대조군에 비해 약 2.5배 이상 증가된 것으로 나타났다. 메탄올추출물의 처리 농도에 따른 NO 양은 각각 19.
1과 같다. 양성 대조물질 vitamin C (30 ㎍/mL)의 라디컬 소거능이 95.59%일 때, 메탄올 추출물이 6.17%, 13.72%, 23.80%, 37.65%, 53.77% 열수추출물이 0.05%, 0.1%, 0.37%, 1.76%, 9.19%로 추출물 처리 농도 의존적으로 라디컬 소거능이 증가하였다. Abdullah[16] 등은 열수추 출법을 이용한 동과의 부위별 DPPH 라디컬 소거능이 각각 씨앗, 과육, 껍질 순으로 높은 활성을 나타낸다고 보고하였다.
염증유도물질 LPS (100 ng/mL)에 의해 활성된 대식세포의 TNF-α 분비는 세포만 배양한 대조군에 비해 약 3.3배 증가하였다.

후속연구

3 mgGAE/g 으로 총폴리페놀 함량을 보고하여 본 연구에서 사용된 메탄올추출물의 총폴리페놀 함량이 매우 높다는 것을 확인하였다. DPPH라디컬 소거능과 총폴리페놀 함량 결과를 통해 동과자 메탄올추출물의 천연유래 항산화 물질로서의 활용가능성이 기대된다.
본 연구에서는 동과자 열수추출물과 메탄올 추출물의 DPPH라디컬 소거능을 비교하였으며 그 결과 메탄올 추출물의 항산화 활성이 더 우수함을 확인하였 다. 따라서 최적 추출법에 따른 유효성분의 효능 극대화를 위해 동일 소재에 대한 다양한 추출법 적용에 관한 연구가 필요하다고 사료된다.
이러한 결과는 김원희[21]의 연구에서 비극성 용매 methylene chloride로 추출한 동과자의 경우 50% 이상의 tyrosinase 활성 억제를 확인한 반면 n-BuOH 또는 H ₂ O의 경우 저해활성이 낮아, 선택된 추출 용매에 의해 tyrosinase 활성이 영향을 받는다는 것을 시사 한다. 따라서 추후 다양한 용매의 특성에 따른 각 추출 물의 효능 평가가 이루어져야 한다고 판단된다.
이러한 결과를 종합하여 볼 때, 동과자 추출물은 세포 안전성이 확보된 천연자원물질 기반의 항산화, 항염및 미백 후보물질로 다양한 분야에 응용 가능성이 높을 것으로 사료된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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