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문제 정의
- 본 연구에서는 이미 효능이 입증된 베타글루칸의 면역활성능을 더욱 향상시키기 위한 연구로 효모에 인위적인 돌연변이를 가하여 효모세포벽에 변이가 유도된 효모변이주를 선발하였으며, 선발된 효모변이주와 wild-type으로부터 추출한 베타글루칸의 면역 활성능을 조사하였다.
- 선발된 효모변이주의 세포벽 유래 베타글루칸이 면역 활성능 증강에 미치는 효과를 조사하였다. 최근까지 효모세포벽에 존재하는 베타글루칸은 면역기능을 강화시키며, 항암효과가 있다고 알려져 있으며, 특히 자연 면역세포(innate immune cells)의활성에 관여한다고 보고된 바 있다12*7).
가설 설정
- 1)O.D. indicates NO producing ability of macrophages from the mouse abdominal cavity.
제안 방법
- 그러므로 세포벽 분해효소인 zymolase가 처리된 조건에서도 흡광도가 높게 유지되는 변이주는 세포벽의 구조에 변이가 일어났을 확률이 높은 것으로 예상된다. 1차 선발된 3&종 효모변이주들의 zymolase에 대한 내성 실험을 0~800μg/mL의 zymolase 농도에서 수행하여 변이주를 최종적으로 선발하였다. 36종 효모 변이주들을 0~800pig/mL의 zymolase를 첨가한 YPD 배지에 접종하여 진탕배양기에서 6시간 배양한 후 상대적인 세포성장 정도를 흡광도로 비교 측정하였으며 최종적으로 zymolase에 대해 내성이 월등한 S.
- 5% formaldehyde/PBS 5 mL에 현탁하였다. 20분간 얼음에 방치한 후 탐식세포를 Fluorescence-Activated Cell Sorter(FACS)로 측정하였다.
- 1차 선발된 3&종 효모변이주들의 zymolase에 대한 내성 실험을 0~800μg/mL의 zymolase 농도에서 수행하여 변이주를 최종적으로 선발하였다. 36종 효모 변이주들을 0~800pig/mL의 zymolase를 첨가한 YPD 배지에 접종하여 진탕배양기에서 6시간 배양한 후 상대적인 세포성장 정도를 흡광도로 비교 측정하였으며 최종적으로 zymolase에 대해 내성이 월등한 S. cerevisiae IS2를 선발하여 한국생명공학연구원내 미생물기탁센터에 기탁(KCTC 0959BP)하였다(Fig. 1). 그리고 모균주인 S.
- S. cereviaiae KCTC 7911에 돌연변이를 유도하고 selective pressure로서 세포벽 분해효소인 zymolsae와 mechanical stress인 glass bead를 차례로 처리하여 효모변이주를 S. cerevisiae IS2를 선발하였다. S.
- Carlton 등(6)의 방법을 응용하여 사용하였다. S. cerevisiae KCTC 7911 균주를 YPD 배지에 접종하여 대수기 중기까지 배양한 후 7000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 효모를 수확하고 효모의 농도가 l~2X108 cells/mL이 되게 희석하여 멸균증류수로 3번 세척한 후 돌연변이원인 NTG(N-metyl-N, -nitro-N-nitrosoguanidine, Sigma)> 이용하여 생존률(survival rate)이 0.1%가 되도록 돌연변이시켰다. 상기의 방법으로 돌연변이 처리된 효모를 수확하여 멸균증류수로 세척한 후 600|ig/mL의 zymolase(Sigma)가 첨가된 YPD 배지에 30℃에서 6시간 배양한 후 원심분리하여 수확하였다.
- 이러한 수치로 미루어 주사된 베타글루칸에 의해 복강내 면역세포의 생성이 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 면역세포의 촉진에 더욱 효과적임을 알 수 있었다. Wildtype과 효모 변이주 유래의 베타글루칸을 복강주사 한 후 채취한 복강면역세포로부터 NO 생성능을 측정하였다. 측정결과 대조구인 wild-type 베타글루칸은 0.
- 1). 그리고 모균주인 S. cerevisiae KCTC 7911과 S. cerevisiae IS2로부터 베타글루칸을 추출하여 면역 활성능을 조사하였다 (Table 1).
- 방법을 응용하여 측정하였다. 글루칸 샘플을 7주령된 생쥐에 복강주사하고 3일 후 채취한 복강 면역세포를 이용하여 대식세포의 활성화와 탐식능을 측정하였다. 세포의 활성화는 beads의 탐식능 정도로 판단하였으며, 세포의 형태 변화를 참고하였다.
- 상온에서 10분간 방치한 후 microplate reader로 550nm에서 흡광도를 읽어 NO 생성능을 측정하였다. 대식세포의 활성이 복강주사된 베타글루칸 불용성 입자에 의해 비특이적으로 활성화될 수 있으나, 본 실험에서는 불용성 베타글루칸을 DMSO를 이용하여 현탁 상태로 녹였으며, 비록 입자가 남아있어도 대조구와 실험구에서 동일한 조건의 처리를 거쳐 실험하였으므로 측정된 수치의 변화는 베타글루칸 성분에 의한 차이로 해석하였다.
- 추출한 베 타글루칸을 생 쥐에 주사하여 복강면역세포로부터 측정되는 NO와 대식세포의 변화를 분석하여 효모변이주 세포벽 유래 베타글루칸이 자연 면역세포의 면역활성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 베타글루칸 5 mg/mL를 생쥐에 0.2mL 복강 주사 후 3일 후에 복강에서 체취한 세포수를 haemocytomer로 즉정한 후 10mL에 포함된 세포의 농도로 나타내었다(Table 2).
- 모균주를 돌연변이원인 NTG로 처리한 후 원하는 효모돌연변이주의 줄현을 높일 수 있는 인자(selective pressure)로 세포벽 분해효소인 zymolase와 glass bead에 의한 mechanical stress를 차례대로 가하여 효모변이주를 선발하였다. 그리고 selective pressure 처리과정을 여러번 반복하여 최종적으로 선발된 효모변이주가 세포벽에 변화가 일어난 변이주일 가능성을 최대화하여 효모변이주라 예상되는 36개의 효모 colony를 1차적으로 얻을 수 있었다.
- KCTC 7911 을 사용하였다. 모든 균주는 YPD(2% glucose, 2% peptone, 1% yeast extract) agar 배지에 도말하여 2~3일 항온 incubatoH 보관하여 배양한 후 4℃ 냉장고에 보관하면서 1개월마다 계대배양하여 사용하거나 YPD 배지에서 대수기 중기까지 액체배양한 후 40% glycerol 에 현탁하여 -7(FC deep freezer에 냉동보관하여 사용하였다.
- 복강 면역세포를 이용한 대식세포 탐식능은 Abel(1) 등이 사용한 방법을 응용하여 측정하였다. 글루칸 샘플을 7주령된 생쥐에 복강주사하고 3일 후 채취한 복강 면역세포를 이용하여 대식세포의 활성화와 탐식능을 측정하였다.
- 액상부분을 취하여 효모를 재수확하고, 다시 600㎍/mL의 zymolase가 첨가된 YPD 배지에 30℃에서 3시간 배양한 후 수확하였다. 상기의 과정을 2회 더 반복한 후 수확한 효모를 YPD agar 배지에 도말하고 30℃ incubator에 보관하여 자라는 군체 (colony)들을 zymolase에 대해 내성을 보이는 변이주로 선발하였다.
- 1%가 되도록 돌연변이시켰다. 상기의 방법으로 돌연변이 처리된 효모를 수확하여 멸균증류수로 세척한 후 600|ig/mL의 zymolase(Sigma)가 첨가된 YPD 배지에 30℃에서 6시간 배양한 후 원심분리하여 수확하였다. 수확한 효모를 멸균증류수로 세척한 후 잉ass bead를 동량 첨가하고 강력하게 30초 동안 진탕(Vortex GENIE 2, Scientific Industries, Inc.
- 75 pm)에 의한 형광강도를 Flow cytometer를 이용하여 측정하여 전체 대식세포 중 형광강도가 강한 집단의 비를 %로 나타내었다. 세포 형태의 변화는 FSC 및 SSC를 측정하였다. 채취한 복강세포를 1X106 cells/mL로 희석한 후 15 mL 튜브에 희석하고 비드(2.
- 글루칸 샘플을 7주령된 생쥐에 복강주사하고 3일 후 채취한 복강 면역세포를 이용하여 대식세포의 활성화와 탐식능을 측정하였다. 세포의 활성화는 beads의 탐식능 정도로 판단하였으며, 세포의 형태 변화를 참고하였다. 탐식 능은 탐식한 형광표시 latex beads(polyscience.
- 상기의 방법으로 돌연변이 처리된 효모를 수확하여 멸균증류수로 세척한 후 600|ig/mL의 zymolase(Sigma)가 첨가된 YPD 배지에 30℃에서 6시간 배양한 후 원심분리하여 수확하였다. 수확한 효모를 멸균증류수로 세척한 후 잉ass bead를 동량 첨가하고 강력하게 30초 동안 진탕(Vortex GENIE 2, Scientific Industries, Inc., USA)하였다. 액상부분을 취하여 효모를 재수확하고, 다시 600㎍/mL의 zymolase가 첨가된 YPD 배지에 30℃에서 3시간 배양한 후 수확하였다.
- 특히, 대식세포가 분비하는 NO의 직접적인 기능은 항 미생물 활성으로 미생물을 사멸시키는 역할을 하며 박테리아, 곰팡이, 기생충, 병원성 원생 동물 등에 대해 아주 강력하게 작용한다. 추출한 베 타글루칸을 생 쥐에 주사하여 복강면역세포로부터 측정되는 NO와 대식세포의 변화를 분석하여 효모변이주 세포벽 유래 베타글루칸이 자연 면역세포의 면역활성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 베타글루칸 5 mg/mL를 생쥐에 0.
- 추출한 베타글루칸 분말을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 충분히 녹인 후 이를 PBS(2.56 g/L NaH2PO4 - H2O, 22.5 g/L Na2HPO4, . 7H2O, 87.9 g/L NaCl, pH 7.2)에 5 mg/mL의 농도로 희석한 후 7주령의 생쥐(balb/c)에 0.2mL씩 복강주사 하였다.
- 세포의 활성화는 beads의 탐식능 정도로 판단하였으며, 세포의 형태 변화를 참고하였다. 탐식 능은 탐식한 형광표시 latex beads(polyscience.co. 0.75 pm)에 의한 형광강도를 Flow cytometer를 이용하여 측정하여 전체 대식세포 중 형광강도가 강한 집단의 비를 %로 나타내었다. 세포 형태의 변화는 FSC 및 SSC를 측정하였다.
- 효모변이주들을 Opg/mL에서 800|_tg/mL의 zymolase를 첨가한 YPD 배지에 접종하여 진탕배양기에서 6시간 배양한 후 상대적인 세포성장 정도를 비교 측정하여 내성정도를 측정하였다.
- cerevisiae IS2는 세포벽 분해효소인 zymolase의 농도별 내성실험 결과 wild-type에 비해 훨씬 강한 내성을 보여 세포벽에 변화가 일어난 균주로 예상된다. 효모변이주와 wild-type으로부터 베타글루칸을 추출하여 면역 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 생쥐의 복강에 주사하고 생성되는 면역세포의 수, NO 생성능, 및 면역세포의 대다수를 차지하는 대식세포의 탐식능을 측정하였다. 베타글루칸을 쥐의 복강에 주사하였을 때 베타글루칸의 종류에 상관없이 면역세포의 수, NO 생성능 및 대식세포의 활성도가 증가하는 결과를 얻을 수 있었다.
- 효모변이주의 zymolase에 대한 내성실험을 농도별로 수행하였다. 효모변이주들을 Opg/mL에서 800|_tg/mL의 zymolase를 첨가한 YPD 배지에 접종하여 진탕배양기에서 6시간 배양한 후 상대적인 세포성장 정도를 비교 측정하여 내성정도를 측정하였다.
- 효모세포벽으로부터 베타글루칸의 추출은 Kelly 등a, 의 방법을 변형하여 사용하였다.
대상 데이터
- 대조구로는 모균주인 S. cerevisiae KCTC 7911를 사용하였으며, 3회 반복실험 후 zymolase가 첨가되지 않은 조건에서 배양한 세포성장 농도와 zymolase가 0-800 eg/mL 첨가된 조건에서 배양한 세포성장 농도의 비를 %로 환산하였다.
- 효모변이 주 개발을 위한 모균주로는 Saccharomyces cerevisiae KCTC 7911 을 사용하였다. 모든 균주는 YPD(2% glucose, 2% peptone, 1% yeast extract) agar 배지에 도말하여 2~3일 항온 incubatoH 보관하여 배양한 후 4℃ 냉장고에 보관하면서 1개월마다 계대배양하여 사용하거나 YPD 배지에서 대수기 중기까지 액체배양한 후 40% glycerol 에 현탁하여 -7(FC deep freezer에 냉동보관하여 사용하였다.
이론/모형
- 효모에 돌연변이를 유발하여 목적하는 변이주를 선발하기 위해 Carlton 등(6)의 방법을 응용하여 사용하였다. S.
성능/효과
- 2)Phagocytosis was measured with Fluorescence-Activated Cell Sorter (FACS) and expressed as % ratio of macrophages which emitted intensive fluorescence to total macrophages.
- Wild-type과 효모변이주로 부터 추출한 베타글루칸을 복강 주사했을 때 복강내 면역세포수가 음성 대조구인 PBS, LPS, DMSO에 비해 2배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 효모변이주로 부터 추출한 베타글루칸을 복강 주사했을 때 wild-type 베타글루칸에 비해 면역세포의 수치가 약 1.
- 그리고 selective pressure 처리과정을 여러번 반복하여 최종적으로 선발된 효모변이주가 세포벽에 변화가 일어난 변이주일 가능성을 최대화하여 효모변이주라 예상되는 36개의 효모 colony를 1차적으로 얻을 수 있었다. 효모세포벽은 P-l, 3-D-glucan이 주쇄에 P-1.
- 09%을 보여 NO 생성능과 마찬가지로 변이주의 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸에 비해 약 12% 높은 활성도를 보였다. 그리고 대식세포 탐식능은 변이주의 경우 50.45%로 측정되어 wild-type의 35.3%에 비해 약 70% 높은 수치를 기록하여 대식세포의 활성도에 비례하여 탐식능도 증가함을 확인할 수 있었다(Table 4). 이러한 결과들로 미루어 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 훨씬 우수한 면역활성 촉진능력을 가지고 있음을 증명할 수 있었다.
- 대식세포의 활성도는 wild-type 베타글루칸과 변이주 베타글루칸을 주사한 경우 각각 62.61 %와 74.09%을 보여 NO 생성능과 마찬가지로 변이주의 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸에 비해 약 12% 높은 활성도를 보였다. 그리고 대식세포 탐식능은 변이주의 경우 50.
- 효모변이주와 wild-type으로부터 베타글루칸을 추출하여 면역 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 생쥐의 복강에 주사하고 생성되는 면역세포의 수, NO 생성능, 및 면역세포의 대다수를 차지하는 대식세포의 탐식능을 측정하였다. 베타글루칸을 쥐의 복강에 주사하였을 때 베타글루칸의 종류에 상관없이 면역세포의 수, NO 생성능 및 대식세포의 활성도가 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 특히 변이주 베타글루칸을 주사하였을 경우 wild-type 베타글루칸에 비해 면역세포의 수는 1.
- 43배 높은 수치를 얻을 수 있었다. 이러한 결과들로 미루어 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 우수한 면역활성 촉진능력을 가지고 있음을 증명할 수 있었으며, 고부가가치 기능성 면역물질로서의 응용 가능성을 확인할 수 있었다.
- 3%에 비해 약 70% 높은 수치를 기록하여 대식세포의 활성도에 비례하여 탐식능도 증가함을 확인할 수 있었다(Table 4). 이러한 결과들로 미루어 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 훨씬 우수한 면역활성 촉진능력을 가지고 있음을 증명할 수 있었다.
- 4배 더 증가하였다. 이러한 수치로 미루어 주사된 베타글루칸에 의해 복강내 면역세포의 생성이 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 면역세포의 촉진에 더욱 효과적임을 알 수 있었다. Wildtype과 효모 변이주 유래의 베타글루칸을 복강주사 한 후 채취한 복강면역세포로부터 NO 생성능을 측정하였다.
- 12배 정도 NO 생산능 증가를 보였다. 이로 미루어 wild-type 베타글루칸에 비해 변이주의 베타글루칸이 복강세포의 생리적 활성의 유도에 더욱 뛰어난 효능을 발휘하는 것으로 밝혀졌다(Table 3).
- Wildtype과 효모 변이주 유래의 베타글루칸을 복강주사 한 후 채취한 복강면역세포로부터 NO 생성능을 측정하였다. 측정결과 대조구인 wild-type 베타글루칸은 0.052의 O.D 값을 나타냈으며, 변이주의 베타글루칸은 각각 0.058을 보여 wild-type 베타글루칸에 비해 1.12배 정도 NO 생산능 증가를 보였다. 이로 미루어 wild-type 베타글루칸에 비해 변이주의 베타글루칸이 복강세포의 생리적 활성의 유도에 더욱 뛰어난 효능을 발휘하는 것으로 밝혀졌다(Table 3).
- 베타글루칸을 쥐의 복강에 주사하였을 때 베타글루칸의 종류에 상관없이 면역세포의 수, NO 생성능 및 대식세포의 활성도가 증가하는 결과를 얻을 수 있었다. 특히 변이주 베타글루칸을 주사하였을 경우 wild-type 베타글루칸에 비해 면역세포의 수는 1.40배, NO 생성능은 1.12배, 대식세포의 활성도와 탐식능은 각각 1.18배와 1.43배 높은 수치를 얻을 수 있었다. 이러한 결과들로 미루어 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 우수한 면역활성 촉진능력을 가지고 있음을 증명할 수 있었으며, 고부가가치 기능성 면역물질로서의 응용 가능성을 확인할 수 있었다.
- 있었다. 특히 효모변이주로 부터 추출한 베타글루칸을 복강 주사했을 때 wild-type 베타글루칸에 비해 면역세포의 수치가 약 1.4배 더 증가하였다. 이러한 수치로 미루어 주사된 베타글루칸에 의해 복강내 면역세포의 생성이 촉진되는 것을 확인할 수 있었으며, 변이주 베타글루칸이 wild-type 베타글루칸보다 면역세포의 촉진에 더욱 효과적임을 알 수 있었다.
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