본 연구에서는 국내산 상황버섯의 효소 가수분해 전처리를 통한 ${\beta}-glucan$의 최적 추출조건을 확립하고 그에 따른 활성을 알아보고자 추출 조건에 따른 생이화학적활성을 측정하였다. 효소가수분해 조건을 최적화하기 위해 실시한 반응표면분석법의 결과 0.66%(v/v)의 viscozyme 농도에서 6.08시간 반응하는 것이 최적이라 예측되었으며($R^2=0.9245$), 이에 따라 최적 추출 조건에서 추출한 시료의 ${\beta}-glucan$ 함량은 1.9594 g/100 g으로 측정되었다. 추출 수율(0.76-16.40%)은 EBE가 NEBE에 비해 약 3배 높았다. ${\beta}-glucan$ 순도(11.15-59.05%)로 가장 높았으며, ${\beta}-glucan$ 함량 또한 0.26-3.38 g/100 g으로 EB (3.38 g/100 g)가 가장 높았다. 총당 함량(0.61-1.17 mg/mL)은 NEB, EB가 NEBE, EBE보다 높았으며, EB가 가장 높았다. 구성당 분석 결과, 모든 추출물에서 glucose의 함량이 가장 높았으며, 대조구와 효소 전처리구 모두 정제하면서 그 비율이 증가하였다. 단백질 함량(0.44-11.73 mg/mL)은 NEBE, EBE가 NEB, EB보다 높았으며, EBE가 가장 높았다. FT-IR 분석 결과 $890cm^{-1}$ 부근에서 peak가 확인되었기에 ${\beta}-glycosidic$ linkage를 가지고 있는 것으로 판단하였다. MTT assay를 통해 B6F10과 SK-MEL-5 세포 독성을 측정한 결과 B6F10의 경우 대조구의 세포 생존율을 100%로 하였을 때 세포 생존율이 80% 이상으로 나타나 세포독성을 보이지 않았으나, SK-MEL-5에서는 EBE를 $100{\mu}g/mL$의 농도로 처리하였을 때 세포 생존율이 75%로 나타나 약간의 세포독성을 보였다. Wound healing assay를 통해 암세포 증식 억제활성 측정 결과, 정제한 NEB, EB가 NEBE, EBE보다 활성이 높았으며, 특히 12시간일 때 EB $30{\mu}g/mL$를 처리한 경우 B6F10과 SK-MEL-5 모두에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
본 연구에서는 국내산 상황버섯의 효소 가수분해 전처리를 통한 ${\beta}-glucan$의 최적 추출조건을 확립하고 그에 따른 활성을 알아보고자 추출 조건에 따른 생이화학적활성을 측정하였다. 효소가수분해 조건을 최적화하기 위해 실시한 반응표면분석법의 결과 0.66%(v/v)의 viscozyme 농도에서 6.08시간 반응하는 것이 최적이라 예측되었으며($R^2=0.9245$), 이에 따라 최적 추출 조건에서 추출한 시료의 ${\beta}-glucan$ 함량은 1.9594 g/100 g으로 측정되었다. 추출 수율(0.76-16.40%)은 EBE가 NEBE에 비해 약 3배 높았다. ${\beta}-glucan$ 순도(11.15-59.05%)로 가장 높았으며, ${\beta}-glucan$ 함량 또한 0.26-3.38 g/100 g으로 EB (3.38 g/100 g)가 가장 높았다. 총당 함량(0.61-1.17 mg/mL)은 NEB, EB가 NEBE, EBE보다 높았으며, EB가 가장 높았다. 구성당 분석 결과, 모든 추출물에서 glucose의 함량이 가장 높았으며, 대조구와 효소 전처리구 모두 정제하면서 그 비율이 증가하였다. 단백질 함량(0.44-11.73 mg/mL)은 NEBE, EBE가 NEB, EB보다 높았으며, EBE가 가장 높았다. FT-IR 분석 결과 $890cm^{-1}$ 부근에서 peak가 확인되었기에 ${\beta}-glycosidic$ linkage를 가지고 있는 것으로 판단하였다. MTT assay를 통해 B6F10과 SK-MEL-5 세포 독성을 측정한 결과 B6F10의 경우 대조구의 세포 생존율을 100%로 하였을 때 세포 생존율이 80% 이상으로 나타나 세포독성을 보이지 않았으나, SK-MEL-5에서는 EBE를 $100{\mu}g/mL$의 농도로 처리하였을 때 세포 생존율이 75%로 나타나 약간의 세포독성을 보였다. Wound healing assay를 통해 암세포 증식 억제활성 측정 결과, 정제한 NEB, EB가 NEBE, EBE보다 활성이 높았으며, 특히 12시간일 때 EB $30{\mu}g/mL$를 처리한 경우 B6F10과 SK-MEL-5 모두에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
This study was conducted to establish optimized ${\beta}-glucan$ extraction method through enzymatic hydrolysis from Phellinus baumii and investigate ${\beta}-glucan$ contents and physicochemical properties. The optimal condition was obtained with the enzyme concentration of 0....
This study was conducted to establish optimized ${\beta}-glucan$ extraction method through enzymatic hydrolysis from Phellinus baumii and investigate ${\beta}-glucan$ contents and physicochemical properties. The optimal condition was obtained with the enzyme concentration of 0.66% (v/v), reaction time of 6.08 h ($R^2=0.9245$) and the ${\beta}-glucan$ contents from the Phellinus baumii extracts under the optimized condition was 1.9594 g/100 g. ${\beta}-Glucan$ yield (0.76-16.40%) of enzyme beta-glucan extract (EBE) was three fold higher than that of non-enzyme beta-glucan extract (NEBE). ${\beta}-Glucan$ purity (11.15-59.05%) of non-enzyme beta-glucan (NEB) and that of enzyme beta-glucan (EB) were higher than that of NEBE and that of EBE. ${\beta}-Glucan$ purity of EB (59.05%) and ${\beta}-glucan$ contents of EB (3.38 g/100 g) showed higher than those of others. Total sugar contents (0.61-1.17 mg/mL) showed that NEB and EB were higher than that of NEBE and EBE, EB had the highest total sugar content as 1.17 mg/mL, respectively. Protein contents (0.44-11.73 mg/mL) of NEBE and that of EBE were higher than that of NEB, that of EB. In FT-IR spectrum, the band at $890cm^{-1}$ of microcapsule was attributed to a ${\beta}-1,3-glucan$. The toxicities of ${\beta}-glucan$ from Phellinus baumii in both melanoma cell lines was determined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli um bromide assay and ${\beta}-glucan$ from Phellinus baumii has no toxicity until $30{\mu}g/mL$. The effects of ${\beta}-glucan$ from Phellinus baumii on inhibition of cancer cell proliferation were detected by using a wound healing assay. The effect of NEB and EB were higher than NEBE and EBE, especially $30{\mu}g/mL$ of EB had the highest in both melanoma cell lines.
This study was conducted to establish optimized ${\beta}-glucan$ extraction method through enzymatic hydrolysis from Phellinus baumii and investigate ${\beta}-glucan$ contents and physicochemical properties. The optimal condition was obtained with the enzyme concentration of 0.66% (v/v), reaction time of 6.08 h ($R^2=0.9245$) and the ${\beta}-glucan$ contents from the Phellinus baumii extracts under the optimized condition was 1.9594 g/100 g. ${\beta}-Glucan$ yield (0.76-16.40%) of enzyme beta-glucan extract (EBE) was three fold higher than that of non-enzyme beta-glucan extract (NEBE). ${\beta}-Glucan$ purity (11.15-59.05%) of non-enzyme beta-glucan (NEB) and that of enzyme beta-glucan (EB) were higher than that of NEBE and that of EBE. ${\beta}-Glucan$ purity of EB (59.05%) and ${\beta}-glucan$ contents of EB (3.38 g/100 g) showed higher than those of others. Total sugar contents (0.61-1.17 mg/mL) showed that NEB and EB were higher than that of NEBE and EBE, EB had the highest total sugar content as 1.17 mg/mL, respectively. Protein contents (0.44-11.73 mg/mL) of NEBE and that of EBE were higher than that of NEB, that of EB. In FT-IR spectrum, the band at $890cm^{-1}$ of microcapsule was attributed to a ${\beta}-1,3-glucan$. The toxicities of ${\beta}-glucan$ from Phellinus baumii in both melanoma cell lines was determined using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli um bromide assay and ${\beta}-glucan$ from Phellinus baumii has no toxicity until $30{\mu}g/mL$. The effects of ${\beta}-glucan$ from Phellinus baumii on inhibition of cancer cell proliferation were detected by using a wound healing assay. The effect of NEB and EB were higher than NEBE and EBE, especially $30{\mu}g/mL$ of EB had the highest in both melanoma cell lines.
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문제 정의
본 연구에서는 상황버섯 β-glucan의 추출 효율을 높이기 위한 전처리 공정으로 효소 가수분해를 이용하였으며, 반응표면 분석법을 통해 효소 가수분해 조건을 최적화하였다.
제안 방법
β-Glucan의 작용기를 확인하기 위해서 FT-Infrared spectrophotometer (FT-IR, Frontier, PerkinElmer, MA, USA)을 이용하여 spectrum을 분석하였다.
10% fetal bovine serum, 14% antibiotic (100 unit/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin)를 첨가한 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium 과 Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI-1640)를 이용하여 5% CO2및 37℃의 조건에서 배양하였다.
Sugar-Pak Icolumn (10 μm, Ø6.5×300 mm, Waters Corporation, Milford, CT, USA)을 사용하여 0.01 M Ca-EDTA buffer를 이동상으로 하여 0.5 mL/min으로 RI detector로 분석하였다.
시료를 3,10, 30 μg/mL의 농도로 처리하여 37 ℃의 CO2 incubator에서 배양하면서 0, 6, 12시간 간격으로 healing 정도를 현미경(ECLIPSE TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다. Wound healing 비율은 wound의 거리를 측정하여 억제활성의 정도를 대조구와 비교하였다.
시료의 조추출물(1 mg/mL) 10 μL에 BCA solution (Cooper II sulfate : bicinchoninic acid =1:50) 90 μL를 가해 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 표준물질 bovine serum albumin 검량선의 회귀식을 이용하여 mg/mL로 환산하여 나타내었다.
시료 1g에 5% phenol 1 mL와 95% sulfuric acid 5 mL를 가하여 30분간 상온에서 반응시킨 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 표준물질 glucose 검량선의 회귀식을 이용하여 mg/mL로 환산하여 나타내었다.
구성당 분석은 Prominence Modular HPLC system (Shimadzu Co.)를 이용하여 측정하였다. 구성당 분석을 위하여 시료 10 mg을 6 N hydrochloric acid로 가수분해한 후 증발건조하였다.
여과액에 1L의 에탄올을 가하여 24시간 방치한 후 1/4로 농축하고 원심분리하여 정제하였다(enzyme beta-glucan, EB). 대조구로 상황버섯 분말과 추출 용매인 증류수의 비를 1:20으로하여 24시간 동안 90 ℃에서 환류 추출하고(non-enzyme betaglucan extract, NEBE), 이를 약 3배량의 에탄올로 24시간 동안 정제하였다(non-enzyme beta-glucan, NEB). 각 시료는 동결건조하여 실험에 사용하였다.
반응표면분석에 의한 효소 전처리 조건 최적화 상황버섯 β-glucan 추출조건의 최적화를 위해 반응표면분석을 실시하였으며, 그에 따라 종속변수인 β-glucan 함량을 측정한 결과는 Table 2와 같다.
상황버섯 β-glucan 추출 조건의 최적화를 위하여 viscozyme의 첨가량(X1, % (v/v))과 반응 시간(X2, h)을 독립 변수(independent variable)로 하여 실시하였다.
시료는 1, 3, 10, 30, 100μg/mL의 농도로 처리하였다.
시료를 3,10, 30 μg/mL의 농도로 처리하여 37 ℃의 CO2 incubator에서 배양하면서 0, 6, 12시간 간격으로 healing 정도를 현미경(ECLIPSE TE2000-U, Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
40 ℃ water bath에서 1시간 동안 반응시킨 후 반응액에 glucose oxidase/peroxidase mixture (GOPOD) 3 mL를 가해 40 ℃에서 20분간 반응시켰다. 이후 UV-visible Spectrometer (UV 1601, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 이용해 510 nm에서 흡광도를 측정하여 total glucan 함량을 측정하였다. 또한 20 mg의 시료에 2M potassium hydroxide 2 mL를 가하여 20분 동안 ice-water bath에서 반응시켰다.
이후 추출물의 βglucan 함량 및 암세포 증식 억제 활성을 기존의 단순한 열수추출 방법과 비교하여 조사하였다.
본 연구에서는 상황버섯 β-glucan의 추출 효율을 높이기 위한 전처리 공정으로 효소 가수분해를 이용하였으며, 반응표면 분석법을 통해 효소 가수분해 조건을 최적화하였다. 최적화된 조건으로 효소 가수분해한 추출물을 열수 추출한 후 에탄올로 정제해 효율적인 추출 공정을 확립하였다. 이후 추출물의 βglucan 함량 및 암세포 증식 억제 활성을 기존의 단순한 열수추출 방법과 비교하여 조사하였다.
최적화하려는 β-glucan 함량을 종속 변수(dependent variable, Yi)로 하였고, 독립변수와 종속변수간의 관계를 조사하였다.
추출 수율은 각 공정을 거쳐 추출한 상황버섯 추출물을 여과, 농축, 동결건조한 후 무게를 측정하여 계산하였다. 수율은 건조된 추출 물질이 상황버섯의 무게 중에서 차지하는 비율(%)로 나타내었다.
대상 데이터
본 실험에 사용한 상황버섯(Phellinus baumii)은 경상북도 안동시 임하면 류충현 약용버섯에서 2016년 6월에 공여받은 2년산 상황버섯을 사용하였다. 2년산 상황버섯을 절단한 후 분쇄하여 25 mesh 이상의 상황버섯 분말을 제조하였다.
본 실험에 사용한 상황버섯(Phellinus baumii)은 경상북도 안동시 임하면 류충현 약용버섯에서 2016년 6월에 공여받은 2년산 상황버섯을 사용하였다. 2년산 상황버섯을 절단한 후 분쇄하여 25 mesh 이상의 상황버섯 분말을 제조하였다.
암세포주 B16F10 murine melanoma cell과 SK-MEL-5 human melanoma cell은 한국세포주은행에서 분양받았다. 10% fetal bovine serum, 14% antibiotic (100 unit/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin)를 첨가한 Dulbeco’s Modified Eagle’s Medium 과 Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI-1640)를 이용하여 5% CO2및 37℃의 조건에서 배양하였다.
데이터처리
)를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 대조 구와 비교하여 나타내었다.
, Cary, NC, USA)을 이용하여 반응표면회귀 분석으로 통계 처리하였다. 또한, SAS program을 통하여 예측된 최적 추출 조건을 바탕으로 실증 시험하여 예측된 최적값에 대한 백분율(%)로 나타내었다.
모든 실험은 3회 반복하여 결과값을 평균과 표준편차로 나타내었고(mean ± SD), Statistical analysis system (SAS, version 9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)에 의하여 유의차를 검정하였다(Duncan’s multiple range test, p <0.05).
상황버섯의 viscozyme을 이용한 추출 조건에 따른 β-glucan의 특성은 statistical analysis system (SAS, version9.4, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 반응표면회귀 분석으로 통계 처리하였다.
이론/모형
단백질 함량은 bicinchoninic acid (BCA) assay를 이용하여 측정하였다(Smith 등, 1985). 시료의 조추출물(1 mg/mL) 10 μL에 BCA solution (Cooper II sulfate : bicinchoninic acid =1:50) 90 μL를 가해 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
, h)을 독립 변수(independent variable)로 하여 실시하였다. 반응표면분석법 중 중심합성계획법(central composite design)을 이용하였으며, 실험 범위에 따라 부호화된 독립변수와 부호화되지 않은 독립변수는 Table 1과 같다. 추출 조건과 순서는 임의의 10구간으로 정하여 진행하였다.
세포 독성을 알아보기 위해 B16F10 murine melanoma cell과 SK-MEL-5 human melanoma cell을 이용하여3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoli um bromide (MTT) assay를 실시하였다(Mossmann 1983). B16F10 murine melanoma cell과 SK-MEL-5 human melanoma cell을 96 well plate에 5.
1)NEBE, non-enzyme beta-glucan extract; NEB, non-enzyme beta-glucan; EBE, enzyme beta-glucan extract; EB, enzyme beta-glucan 2)abcMeans followed by the same letters within the row are not significantly different (p <0.05).
B16F10과 SK-MEL-5 모두에서 12시간 경과시 EB 30 μg/mL를 처리한 경우 가장 높은 활성을 나타내었으며, 특히 양성 대조구(resveratrol 10 μg/mL)에 비하여 높은 활성을 나타내었다.
SK-MEL-5 cell에 wound를 형성한 후 3 μg/mL의 EBE를 처리한 경우를 제외한 모든 경우에서 음성 대조구에 비해 암세포 증식 억제 활성이 높게 나타났다.
각 실험 구간에서 최대 반응값을 가지기 위한 조건으로 viscozyme 농도는 되었으며(R2=0.9245), 이 조건에서의 β-glucan 함량은 1.9708 g/100 g으로 예측되었다(Table 3).
SK-MEL-5 cell에 wound를 형성한 후 3 μg/mL의 EBE를 처리한 경우를 제외한 모든 경우에서 음성 대조구에 비해 암세포 증식 억제 활성이 높게 나타났다. 대조구와 효소 전처리구 모두 정제 과정을 거친 NEB, EB가 NEBE, EBE보다 높은 활성을 나타내었다. B16F10과 SK-MEL-5 모두에서 12시간 경과시 EB 30 μg/mL를 처리한 경우 가장 높은 활성을 나타내었으며, 특히 양성 대조구(resveratrol 10 μg/mL)에 비하여 높은 활성을 나타내었다.
모든 시료에서 2900 cm−1 부근의 C-H stretching 진동과 1630 cm−1의 C-O stretching 진동, 1000-1100 cm−1에서는 C-H와 C-O bending 진동이 나타났다.
수율은 효소 전처리한 EBE (16.40%)가 NEBE (5.20%)보다 약3배 높았으며, NEB가 0.76%, EB가 5.72%로 효소 전처리구와 대조구 모두 정제 과정을 거치며 수율은 크게 낮아졌다(p <0.05).
순도와 수율을 함께 고려한 상황버섯 100 g당 β-glucan의 함량(g)은 NEBE가 0.99±0.03 g/100 g, EBE가 1.83±0.01 g/100 g으로 EBE가 NEBE에 비해 약 1.8배 높았다.
이에 따라 최적 추출 조건에서 추출한 시료의 β-glucan 함량은 1.9594 g/100g으로 측정되었으며, 이는 예측된 β-glucan 함량(1.9708 g/100 g) 과 99.42% 유사하였다.
처리조건에 따른 상황버섯 추출물의 총당과 단백질 함량은 Table 5와 같다. 총당 함량은 대조구와 효소 전처리구 모두 정제한 것이 높았다. NEB (0.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
상황버섯의 약리 기능을 하는 β-glucan의 특징은 무엇인가?
이와 같은 상황버섯의 약리 기능 중 항암 활성, 면역 증강 및 항염증 작용은 β(1→3) 주결합에 β(1→6) 결합의 곁가지를 갖는 β-glucan에 의한 것이다(Shiao 등, 1994). β-Glucan은 비특이적 면역반응으로 인간의 정상 세포의 면역 기능을 활성화 시켜 암세포의 증식과 재발을억제하고 혈당강하 및 혈중 콜레스테롤 감소 효과가 우수하며,지질대사를 개선하여 체지방의 축적을 억제함으로써 항 비만효과를 가지고 있는 것으로 보고되고 있다(Cho 등, 2013).약용버섯류의 활용에 있어 가장 기본적인 처리공정은 재료로부터 우수한 기능성과 생리활성을 가진 유효 성분을 분리하는추출공정이다(Kim 등, 2007).
상황버섯이란 무엇인가?
상황버섯은 뽕나무 줄기 등에 자생하는 진흙버섯속의 백색 부후균으로, 갓 표면을 제외한 모든 부분에서 황색을 띠어 상황이라 불린다(Shin 등, 2008). 상황버섯은 전 세계적으로 약 220여종이 존재하는 것으로 알려져 있으며, 국내에서는 Phellinusbaumii, Phellinus linteus가 주로 재배 및 유통되고 있다(Bae등, 2003).
약용버섯의 전처리 기술들이 상업적 사용이 제한되는 이유는?
그러나 기존의 열수 추출 방법의경우 추출 시간이 길고 추출 효율이 낮은 단점이 있어 이를 기본으로 하며 유효 성분을 효과적으로 분리해낼 수 있는 적절한전처리 기술이 필요하다(Kim 등, 2007). 약용버섯의 기능성 증대를 위해 원적외선 처리(Kim 등, 2007), 초음파 처리(Kim 등,2012), 가열 전처리(Park과 Kim 2008) 등에 대한 연구는 진행되어 왔으나, 이러한 전처리 기술들은 적합한 장비가 요구되고,저수율과 불안정성 때문에 상업적 사용이 제한된다(Chung과Youn 2005). 이에 비하여, 효소 처리는 간편하며, 추출 수율이높은데도 불구하고(Lee 등, 2014) 비교적 연구가 부족한 실정이다.
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