치마버섯균 유래의 베타글루칸에 대한 사료첨가제로서의 대식세포 기능 활성 및 유방암 세포주에서의 항암효능 효과 Macrophage and Anticancer Activities of Feed Additives on β-Glucan from Schizophyllum commune in Breast Cancer Cells원문보기
치마버섯에서 추출한 베타글루칸을 Raw 264.7 세포에 처치한 후 MTT assay로 측정한 결과 베타글루칸 400 ${\mu}g$/mL까지에 의한 세포독성은 없었다. 대식세포의 활성능을 측정하기 위해서 Raw 264.7 세포에서 NO와 TNF-${\alpha}$의 생성을 측정하였다. 베타글루칸을 대식세포에 24시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 NO와 TNF-${\alpha}$가 유의적으로 상승하였다. 이 결과 베타글루칸이 대식세포인 Raw 264.7 세포를 활성화 시키는 것으로 사료된다. 따라서 본 실험에 사용된 베타글루칸은 면역강화용 사료첨가제로서의 의미가 충분하다고 사료된다. MDA-MB-231 유방암 세포의 성장을 저해하는지 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 400 ${\mu}g$/mL 베타글루칸을 48시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 유방암 세포의 성장이 유의적으로 억제하였다. 그리고 베타글루칸이 유방암 세포에서 성장 억제 효과를 알아보기 위해 누드마우스에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접종하였다. 베타글루칸의 용량은 대조군(0 ${\mu}g$/mouse), 저용량(200 ${\mu}g$/mouse), 고용량(400 ${\mu}g$/mouse)으로 설정하여 누드마우스에 경구투여 하였다. 이 결과 저용량군(200 ${\mu}g$/mouse)이 고용량군(400 ${\mu}g$/mouse)보다 항암효능이 더 많이 일어나는 것을 확인하였다. MDA-MB-231 유방암 세포주에서 베타글루칸이 종양 성장이 감소하였지만, 그 결과가 유의적인 차이를 보이지 않아 본 연구에서 사용한 용량에서는 베타글루칸이 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 종양 성장을 유의적으로 억제하지 않는 것으로 사료된다. 조직병리학적 검사에서 독성이 무해한 것으로 판단되어 면역강화용 사료첨가제로 사용하여도 무방할 것으로 사료된다.
치마버섯에서 추출한 베타글루칸을 Raw 264.7 세포에 처치한 후 MTT assay로 측정한 결과 베타글루칸 400 ${\mu}g$/mL까지에 의한 세포독성은 없었다. 대식세포의 활성능을 측정하기 위해서 Raw 264.7 세포에서 NO와 TNF-${\alpha}$의 생성을 측정하였다. 베타글루칸을 대식세포에 24시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 NO와 TNF-${\alpha}$가 유의적으로 상승하였다. 이 결과 베타글루칸이 대식세포인 Raw 264.7 세포를 활성화 시키는 것으로 사료된다. 따라서 본 실험에 사용된 베타글루칸은 면역강화용 사료첨가제로서의 의미가 충분하다고 사료된다. MDA-MB-231 유방암 세포의 성장을 저해하는지 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 400 ${\mu}g$/mL 베타글루칸을 48시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 유방암 세포의 성장이 유의적으로 억제하였다. 그리고 베타글루칸이 유방암 세포에서 성장 억제 효과를 알아보기 위해 누드마우스에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접종하였다. 베타글루칸의 용량은 대조군(0 ${\mu}g$/mouse), 저용량(200 ${\mu}g$/mouse), 고용량(400 ${\mu}g$/mouse)으로 설정하여 누드마우스에 경구투여 하였다. 이 결과 저용량군(200 ${\mu}g$/mouse)이 고용량군(400 ${\mu}g$/mouse)보다 항암효능이 더 많이 일어나는 것을 확인하였다. MDA-MB-231 유방암 세포주에서 베타글루칸이 종양 성장이 감소하였지만, 그 결과가 유의적인 차이를 보이지 않아 본 연구에서 사용한 용량에서는 베타글루칸이 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 종양 성장을 유의적으로 억제하지 않는 것으로 사료된다. 조직병리학적 검사에서 독성이 무해한 것으로 판단되어 면역강화용 사료첨가제로 사용하여도 무방할 것으로 사료된다.
[ ${\beta}$ ]Glucan is a polysaccharide expressed on the cell walls of fungi. It is known that ${\beta}$-glucan is recognized by a family of C-type lectin receptors, dectin-1, which is expressed mainly on myeloid immune cells, including macrophages, neutrophils and dendritic ce...
[ ${\beta}$ ]Glucan is a polysaccharide expressed on the cell walls of fungi. It is known that ${\beta}$-glucan is recognized by a family of C-type lectin receptors, dectin-1, which is expressed mainly on myeloid immune cells, including macrophages, neutrophils and dendritic cells. Raw 264.7 cells were treated with ${\beta}$-glucan from Schizophyllum commune. ${\beta}$-Glucan was not cytotoxic up to 400 ${\mu}g$/mL as measured by MTT assay. To measure the activity of macrophages, NO and TNF-${\alpha}$ assays were performed in Raw 264.7 cells. Treatment with ${\beta}$-glucan for 24 hr significantly increased production of NO and TNF-${\alpha}$ compared with control groups (p<0.05), indicating activation of macrophages. To measure inhibition of breast cancer cell proliferation, MTT assay was performed in MDA-MB-231 cells. Cell viability was significantly decreased in the group treated with 400 ${\mu}g$/mL of ${\beta}$-glucan for 48 hr (p<0.05) compared to the control group. However, tumor volume was decreased in the groups administered 200 ${\mu}g$ of ${\beta}$-glucan/mouse compared to the control group. These results indicate that ${\beta}$-glucan inhibits breast cancer cell growth through the induction of apoptosis.
[ ${\beta}$ ]Glucan is a polysaccharide expressed on the cell walls of fungi. It is known that ${\beta}$-glucan is recognized by a family of C-type lectin receptors, dectin-1, which is expressed mainly on myeloid immune cells, including macrophages, neutrophils and dendritic cells. Raw 264.7 cells were treated with ${\beta}$-glucan from Schizophyllum commune. ${\beta}$-Glucan was not cytotoxic up to 400 ${\mu}g$/mL as measured by MTT assay. To measure the activity of macrophages, NO and TNF-${\alpha}$ assays were performed in Raw 264.7 cells. Treatment with ${\beta}$-glucan for 24 hr significantly increased production of NO and TNF-${\alpha}$ compared with control groups (p<0.05), indicating activation of macrophages. To measure inhibition of breast cancer cell proliferation, MTT assay was performed in MDA-MB-231 cells. Cell viability was significantly decreased in the group treated with 400 ${\mu}g$/mL of ${\beta}$-glucan for 48 hr (p<0.05) compared to the control group. However, tumor volume was decreased in the groups administered 200 ${\mu}g$ of ${\beta}$-glucan/mouse compared to the control group. These results indicate that ${\beta}$-glucan inhibits breast cancer cell growth through the induction of apoptosis.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 치마버섯 유래 β-glucan의 배양부산물 비율에서 사료첨가제로서의 면역 증강 및 항암효능을 평가하고자 한다.
본 연구에서는 β-glucan에 의한 machrophage의 활성평가를 위해 NO 및 TNF-α assay를 실시하였다.
본 연구에서는 β-glucan의 MDA-MB-231 유방암 세포주의 성장 저해를 확인하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.
본 연구의 목적은 천연물질인 β-glucan을 macrophage를 이용한 nitric oxide(NO), TNF-α assay를 통한 결과를 바탕으로 사료 첨가제로서 면역증강 및 항암효능이 있는지 확인하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
β-Glucan 투여 7주 후 모든 그룹의 마우스를 diethyl ether 로 마취 후 경추탈골을 이용하여 안락사하고, 멸균된 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 부검을 실시하였다.
β-Glucan을 D․W 200 μL에 현탁시켜 매일 정해진 시간에 7주간 경구로 투여하였으며, 물질의 용량은 대조군(D․W), 저용량(200 μg/mouse), 고용량(400 μg/mouse) 로 설정하여 투여하였다.
Fig. 1에서는 β-glucan에 의한 면역세포 독성능이 미치지 않는 농도를 찾기 위하여 마우스 대식세포주인 Raw 264.7 세포에 β-glucan 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리 후 24시간 동안 배양한 다음 미토콘드리아의 활성을 이용한 MTT assay를 수행하여 세포 독성능을 측정하였다.
Fig. 4에서는 MDAMB-231 유방암 세포주를 seeding 후 24시간 동안 배양시킨 다음 β-glucan을 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 24, 48시간 동안 처리하였다.
MDA-MB-231 유방암세포주 2×106 cells/200 μL를 누드 마우스의 복강피하에 접종하여 종양조직을 만든 후, 종양조직을 1 mm3 크기로 절편한 후 다시 누드마우스의 복강피하에 이식하는 작업을 한 번 반복한 후 물질을 투여하였다.
Raw 264.7 macrophage cell과 MDA-MB-231 유방암 세포주를 96 well plate에 1×104 , 5×103 cells/well로 분주한 후에 24시간 동안 배양시킨 다음 각각의 세포주에 β-glucan 을 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 24, 48시간 동안 처리하였다.
Raw 264.7 세포를 96 well plate에 1× 104 cells/well로 분주 후에 24시간 동안 배양시킨 다음 Raw 264.7 세포주에 β-glucan을 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양한 후 상등액을 취하였다.
) 를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite 검량선으로부터 세포가 분비하는 nitric oxide를 계산하였다.
400 μg/mL 베타글루칸을 48시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 유방암 세포의 성장이 유의적으로 억제하였다. 그리고 베타글루칸이 유방암 세포에서 성장 억제 효과를 알아보기 위해 누드마우스에 MDA-MB-231 유방암 세포를 접종하였다. 베타글루칸의 용량은 대조군(0 μg/mouse), 저용량(200 μg/mouse), 고용량(400 μg/mouse)으로 설정하여 누드마우스에 경구투여 하였다.
대식세포의 활성능을 측정하기 위해서 Raw 264.7 세포에서 NO와 TNF-α의 생성을 측정하였다.
따라서 Fig. 2에서는 Fig. 1에서 세포독성이 일어나지 않는 β-glucan의 농도를 설정하여 β-glucan에 의한 대식세포의 활성화 단계에 따라 NO 분비의 발현이 어떻게 변화하는지 확인해 보았다.
본 연구에서 개발하고자 하는 사료첨가제는 치마버섯의 균사체를 기반으로 하는 β-glucan의 생산공정 중 완전히 분리되지 않은 β-glucan으로, 화장품용 β-glucan(GlucanREAL, (주)큐젠바이오텍, Gyeonggi, Korea)은 배양액 자체의 고점도로 인해 세포 이외에 분리되지 못한 β-glucan이 0.4% 포함되어있는 배양 부산물이 전체 배양의 20～30%에 해당하는데 현재 폐기물로 처리되고 있다.
β-Glucan 투여 7주 후 모든 그룹의 마우스를 diethyl ether 로 마취 후 경추탈골을 이용하여 안락사하고, 멸균된 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 부검을 실시하였다. 부검은 종양조직을 채취하여 무게를 측정하였으며, 그 후 개복하여 간과 비장을 채취하여 10% 중성 포르말린 용액에 1주일간 고정하였다.
사육환경 모니터링을 위하여 온·습도는 주기적으로 측정하였으며 기타 환경은 정기적으로 점검하여 일정한 표준치를 유지하였다.
실험에 사용한 누드마우스의 MDA-MB-231 유방암세포주 종양 사이즈가 군별로 일정하게 나오도록 군분류 한 후 β-glucan을 7주 동안 투여하고 투여기간 동안 종양사이즈와 누드마우스의 일반적인 상태 및 체중을 측정하였다.
이 결과를 바탕으로 in vivo 실험에서 β-glucan이 MDA-MB-231 유방암 세포성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 6주된 누드마우스에 MDA-MB231 유방암 세포주를 이식한 후 주 2회 종양사이즈를 측정한 것을 Fig. 5에 나타내었다.
7, MDA-MB-231 세포주를 사용하였다. 이들 세포주의 세포배양액은 DMEM, RPMI 1640(Hyclone Laboratoris Inc., Logan, UT, USA)에 10% fetal bovine serum, 1% streptomycin/penicillin(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)를 첨가하여 사용하였다. 이들 세포주는 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
입수된 동물은 케이지에 5마리씩 분류한 후 온도 23±5℃ 상대습도 40±10%, 조명시간 12시간(08:00 점등, 20:00 소 등)으로 제어된 환경 조건에서 사육되었다.
적출한 장기는 10% 중성 포르말린 용액에 1주일 동안 충분히 고정시킨 후 고정된 조직을 85, 95, 100% ethanol, xylene을 단계별로 사용하여 탈수와 투명화 과정을 거쳤고 포매하여 5 μm의 절편을 만들어 hematoxylin 및 eosin 염색 후 β-glucan에 대한 간 및 신장조직에서의 독성을 알아보기 위하여 광학현미경으로 관찰하였다.
실험에 사용한 누드마우스의 MDA-MB-231 유방암세포주 종양 사이즈가 군별로 일정하게 나오도록 군분류 한 후 β-glucan을 7주 동안 투여하고 투여기간 동안 종양사이즈와 누드마우스의 일반적인 상태 및 체중을 측정하였다. 종양 사이즈 측정은 주 2회(월, 목), 7주 동안 vernier calipers (Mitutoyo, Kanagawa, Japan)로 측정하였으며, 계산에 사용된 공식은 [(length＋width)0.5]3이었다.
대상 데이터
6주령의 nude mice(nu/nu) 수컷은 ㈜오리엔트(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 동물은 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다.
모든 동물은 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스 15마리를 3개의 실험 군으로 분류하여 실험하였으며, 실험군은 그룹 당 5마리씩 설정하였다. β-Glucan을 D․W 200 μL에 현탁시켜 매일 정해진 시간에 7주간 경구로 투여하였으며, 물질의 용량은 대조군(D․W), 저용량(200 μg/mouse), 고용량(400 μg/mouse) 로 설정하여 투여하였다.
사육환경 모니터링을 위하여 온·습도는 주기적으로 측정하였으며 기타 환경은 정기적으로 점검하여 일정한 표준치를 유지하였다. 마우스는 폴리카보네이트제 cage에서 cage당 5두씩 사육하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, tag 표시법에 의해서 사육 상자를 구분하였다.
6주령의 nude mice(nu/nu) 수컷은 ㈜오리엔트(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 모든 동물은 1주일간의 순화 기간을 거친 후 실험에 사용하였다. 마우스 15마리를 3개의 실험 군으로 분류하여 실험하였으며, 실험군은 그룹 당 5마리씩 설정하였다.
본 연구는 ㈜큐젠바이오에서 가지고 있는 치마버섯유래 β-glucan 추출 특허를 이용하여 제공한 0.4% β-glucan을 사용하였다.
본 연구에서는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받은 Raw 264.7, MDA-MB-231 세포주를 사용하였다. 이들 세포주의 세포배양액은 DMEM, RPMI 1640(Hyclone Laboratoris Inc.
데이터처리
모든 실험결과는 평균치와 표준오차(mean±SE)를 사용하여 나타내고 각 군간 비교는 one-way ANOVA에 이은 t-test 분석을 실시하였다.
이론/모형
따라서 본 실험에 사용된 베타글루칸은 면역강화용 사료첨가제로서의 의미가 충분하다고 사료된다. MDA-MB-231 유방암 세포의 성장을 저해하는지 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다. 400 μg/mL 베타글루칸을 48시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 유방암 세포의 성장이 유의적으로 억제하였다.
NO assay는 CAYMAN(Denver, CO, USA)의 NO kit를 사용하였다. Raw 264.
마우스는 폴리카보네이트제 cage에서 cage당 5두씩 사육하였다. 동물의 개체식별은 문신법을 사용하였으며, tag 표시법에 의해서 사육 상자를 구분하였다. 사육 상자는 시험기간, 시험명, 시험책임자명을 기재한 label을 첨부하였다.
성능/효과
β-Glucan 처치군의 간조직을 육안적으로 관찰한 결과 간소엽의 중심정맥을 중심으로 간세포가 방사형으로 뻗어 있고, 간실질의 세포 경계가 명확하게 나타나며, 간 세포의 핵이 크고 뚜렷하게 나타나는 정상적인 간조직의 구조를 유지하고 있었다.
400 μg/mL 베타글루칸을 48시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 유방암 세포의 성장이 유의적으로 억제하였다.
MDA-MB-231 유방암 세포 주에서 대조군에 비하여 β-glucan 처치군에서 종양 성장 억제가 감소하였지만, 그 결과가 유의적인 차이를 보이지 않아 본 연구에서 사용한 용량에서는 β-glucan이 MDA-MB231 유방암 세포주에서 종양 성장을 유의적으로 억제하지 않는 것으로 사료된다.
이 결과 저용량군(200 μg/mouse)이 고용량군 (400 μg/mouse)보다 항암효능이 더 많이 일어나는 것을 확인하였다. MDA-MB-231 유방암 세포주에서 베타글루칸이 종양 성장이 감소하였지만, 그 결과가 유의적인 차이를 보이지 않아 본 연구에서 사용한 용량에서는 베타글루칸이 MDA-MB-231 유방암 세포주에서 종양 성장을 유의적으로 억제하지 않는 것으로 사료된다. 조직병리학적 검사에서 독성이 무해한 것으로 판단되어 면역강화용 사료첨가제로 사용하여도 무방할 것으로 사료된다.
대조군과 β-glucan 처치군의 신장조직을 육안적으로 관찰한 결과 대조군의 사구체와 같이 βglucan 처치군의 사구체에서도 정상적인 사구체의 구조를 유지하고 있었다.
대조군과 비교하였을 때 24시간에서는 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 48시간 동안 처리한 군에서는 400 μg/mL에서 대조군에 비하여 inhibition rate가 약 40% 정도 증가하였으나, 부유하는 세포나 세포의 형태가 변형된 세포는 보이지 않았다.
7 세포를 활성화시키는 것으로 사료된다. 따라서 본 실험에 사용된 베타글루칸은 면역강화용 사료첨가제로서의 의미가 충분하다고 사료된다. MDA-MB-231 유방암 세포의 성장을 저해하는지 확인하기 위하여 MTT assay를 시행하였다.
따라서 본 연구에서 사용한 β-glucan은 면역강화용 사료첨가제로서의 의미가 충분하다고 사료된다.
베타글루칸을 대식세포에 24시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 NO와 TNF-α가 유의적으로 상승하였다.
본 연구에서 사용한 용량에서는 저용량군(200 μg/ mouse)이 고용량군(400 μg/mouse)보다 항암효능이 더 많이 일어나는 것을 확인하였다.
본 연구에서는 NO의 분비는 농도의존적으로 증가하였으며, 100 μg/mL인 농도부터 유의적인 차이를 나타내었다.
베타글루칸을 대식세포에 24시간 처리한 결과 대조군과 비교 시 NO와 TNF-α가 유의적으로 상승하였다. 이 결과 베타글루칸이 대식세포인 Raw 264.7 세포를 활성화시키는 것으로 사료된다. 따라서 본 실험에 사용된 베타글루칸은 면역강화용 사료첨가제로서의 의미가 충분하다고 사료된다.
이 결과 저용량군(200 μg/mouse)이 고용량군 (400 μg/mouse)보다 항암효능이 더 많이 일어나는 것을 확인하였다.
종양의 부피는 대조군과 대조하여 저용량(200 μg/mouse)의 β-glucan 투여군에서 약 34% 의 종양을 억제하였지만, 고용량(400 μg/mouse)의 β-glucan 투여군에서는 대조군과 비교 시 유의적인 차이를 보이지 않았다.
치마버섯에서 추출한 베타글루칸을 Raw 264.7 세포에 처치한 후 MTT assay로 측정한 결과 베타글루칸 400 μg/mL 까지에 의한 세포독성은 없었다.
후속연구
4% 포함되어있는 배양 부산물이 전체 배양의 20～30%에 해당하는데 현재 폐기물로 처리되고 있다. 본 배양 부산물을 이용하여 면역강화용 사료첨가제로 개발할 경우, 그 효과는 매우 클 것으로 판단되며, 또한 유기 폐기물의 처리 관점에서도 폐기되는 고영양의 배양부산물의 재활용으로 환경오염원을 감소시킬 수 있으며, 추가적인 부가가치를 창출하게 될 것이라고 사료된다. 따라서 본 연구에서는 치마버섯 유래 β-glucan의 배양부산물 비율에서 사료첨가제로서의 면역 증강 및 항암효능을 평가하고자 한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
β-Glucan은 체내에서 어떤 효과를 보이는가?
β-Glucan을 생성하는 대표적인 버섯과 그 다당체 성분은 운지버섯(Coriolus versicolor)의 PSK(polysaccharide K: krestin)와 PSP(polysaccharide peptide)(18), 영지버섯 (Ganoderma lucidum)의 β-glucan(19), 표고버섯(Lentinus edoes)의 lentinan(20,21), 잎새버섯(Grifola frondosa)의 grifolan(22), 아가리쿠스버섯(Agaricus blazei)의 β-1,3-1,6- glucan(23), 치마버섯(Schizophyllum commune)의 schizophllan 등에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 면역력을 증강시키는 동시에 내성이 없는 천연 면역조절제와 항암 및 항산화에 대한 생리활성 등에 대해 보고되어 있다(24-26). 또한 고부가가치의 생물 소재로 화장품의 첨가제, 건강보조식품, 식품첨가제, 콘크리트 혼화제, 사료 첨가제 등 다양하게 이용되고 있다.
Glucan이란 무엇인가?
Glucan은 cellulose, amylose, glycogen, laminarians, starch와 같은 중합체를 비롯한 다양한 자연 발생 homopolysaccharides 또는 polyglucoses를 총칭한다(15,16). Glucan은 glucose가 α 또는 β유형으로 1-3, 1-4 또는 1-6 glucosidic 결합으로 연결되어 있으며, 분지된 사슬이나 분지되지 않은 사슬의 형태로 존재한다.
버섯자실체 및 균사체에서 면역증강작용과 관련된 생리활성물질은 어떤 구조를 가지고 있는가?
그뿐만 아니라 약리 기능으로서도 항암효과가 있었음이 보고되었다(8- 10). 최근 여러 종류의 버섯자실체 및 균사체 추출물 중에서 특별히 면역증강작용에 의해 탁월한 항암효능과 당뇨병 개선효과를 보이는 생리활성물질은 β-D-glucan 구조를 갖는 수용성 단백다당체로 구성되어 있음이 밝혀졌다(11-14). 일본의 경우 기능성식품으로 표고버섯 균사체 추출물이 이미 일반화되어 있으며, 의약품의 경우 면역증강효과에 의한 암치료(보조)제로 사용되고 있다.
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