내삼투압성 효모인 Candida magnoliae의 발효조건이 erythritol의 생산에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 탄소원으로는 포도당보다 sucrose가 우수하였으며, sucrose 400 g/L를 주입하였을 때 109 g/L의 erythritol이 생산되었다. 질소원으로 yeast extract을 사용했을 때, 질소원의 농도가 낮을수록 높은 erythritol 수율을 획득할 수 있었으며, 15 g/L의 yeast extract와 함께 무기질소원인 ammonium phosphate를 3 g/L의 농도로 첨가하므로써, 수율 0.37 g/g, $0.78\;g/L{\cdot}hr$의 생산성으로 149 g/L의 erytnritol을 얻을 수 있었다. KCl을 이용한 높은 삼투압 조건에서의 플라스크 배양 결과, 40 g/L의 농도로 첨가한 경우가 erythritol 생산에 가장 유리하였으며, 이와 같은 실험결과를 발효기 배양에서 검증한 결과, KCl을 40 g/L로 첨가하여 167 g/L의 erythritol을 0.42 g erythritol/g sucrose의 수율로 생산할 수 있었다.
내삼투압성 효모인 Candida magnoliae의 발효조건이 erythritol의 생산에 미치는 영향에 대해 조사하였다. 탄소원으로는 포도당보다 sucrose가 우수하였으며, sucrose 400 g/L를 주입하였을 때 109 g/L의 erythritol이 생산되었다. 질소원으로 yeast extract을 사용했을 때, 질소원의 농도가 낮을수록 높은 erythritol 수율을 획득할 수 있었으며, 15 g/L의 yeast extract와 함께 무기질소원인 ammonium phosphate를 3 g/L의 농도로 첨가하므로써, 수율 0.37 g/g, $0.78\;g/L{\cdot}hr$의 생산성으로 149 g/L의 erytnritol을 얻을 수 있었다. KCl을 이용한 높은 삼투압 조건에서의 플라스크 배양 결과, 40 g/L의 농도로 첨가한 경우가 erythritol 생산에 가장 유리하였으며, 이와 같은 실험결과를 발효기 배양에서 검증한 결과, KCl을 40 g/L로 첨가하여 167 g/L의 erythritol을 0.42 g erythritol/g sucrose의 수율로 생산할 수 있었다.
This study was carried out to examine the effects of fermentation conditions on the production of erythritol by osmophilic yeast Candida magnoliae. It was found that sucrose was superior to glucose as carbon source and 109 g/L erythritol was produced from 400 g/L sucrose. When yeast extract was used...
This study was carried out to examine the effects of fermentation conditions on the production of erythritol by osmophilic yeast Candida magnoliae. It was found that sucrose was superior to glucose as carbon source and 109 g/L erythritol was produced from 400 g/L sucrose. When yeast extract was used as nitrogen source, maximum values of yield and productivity for erythritol were obtained at 15 and 20 g/L of yeast extract, respectively. A mixture of 15 g/L yeast extract and 3 g/L ammonium phosphate allowed more efficient utilization of sucrose and hence resulted in 149 g/L of erythritol, 0.37 g erythritol/g sucrose of erythritol yield and $0.78\;g/L{\cdot}hr$ of erythritol productivity. A batch fermentation supplemented with 40 g/L KCl resulted in an erythritol concentration of 167 g/L and an erythritol yield of 0.42 g erythritol/g sucrose.
This study was carried out to examine the effects of fermentation conditions on the production of erythritol by osmophilic yeast Candida magnoliae. It was found that sucrose was superior to glucose as carbon source and 109 g/L erythritol was produced from 400 g/L sucrose. When yeast extract was used as nitrogen source, maximum values of yield and productivity for erythritol were obtained at 15 and 20 g/L of yeast extract, respectively. A mixture of 15 g/L yeast extract and 3 g/L ammonium phosphate allowed more efficient utilization of sucrose and hence resulted in 149 g/L of erythritol, 0.37 g erythritol/g sucrose of erythritol yield and $0.78\;g/L{\cdot}hr$ of erythritol productivity. A batch fermentation supplemented with 40 g/L KCl resulted in an erythritol concentration of 167 g/L and an erythritol yield of 0.42 g erythritol/g sucrose.
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문제 정의
또한 배양액에 첨가된 염의 종류는 호삼투압성 효모의 염에 대한 내성정도를 결정한다는 보고도 있다(10). 본 연구에서는 KCl 을 이용한 고삼투압 배지에서의 발효 특성을 조사하여 erythritol의 생산수율을 높이기 위한 연구를 수행하였다.
본 연구에서는 벌집에서 선별된 Candida 균주⑺를 이용한 erythritol의 발효생산에서 erythritol의 생산수율을 향상시킬 목적으로 배지성분인 탄소원과 질소원, 배지의 pH 및 삼투압이 erythritol의 생산에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
KCl 첨가 농도가 erythritol의 생성에 미치는 영향과 KCl의 최적 농도를 알아보기 위해 배지에 100 g/L의 sucrose와 KCl을 10~40g/L가 되도록 각각 첨가한 후에, 진탕배양기를 이용한 회분식 배양실험을 하였다. KCl 을 10, 20, 30, 40g/L 첨가한 배지에서 erythritol의 수율은 각각 0.
KCl 첨가에 따른 발효기 배양 특성을 알아보기 위해 기질로 sucroseS 400 g/L로 사용하고 플라스크 배양에서 가장 높은 수율을 보인 KCl 40 g/L 첨가구와 KCl 20 g/L 첨가구로 나누어 26℃, 700rpm으로 발효기 배양을 수행하였다.
따라서, 아미노산의 공급을 제한하면 NADPH의 증가에 의해 erythritol 생산도 증가할 것으로 판단되어 배지로부터 casamino acid를 제외하고 yeast extract만을 질소원으로 하였다. Sucrose 400 g/L를 기준으로 하여 yeast extract를 각각 15, 20, 25 또는 30 g/L의 농도로 첨가한 배지로 발효실험을 하였다. 실험결과, 생산된 erythritol의 농도는 yeast extract 20 g/L에서 제일 높았고, 25와 30 g/L 농도에서는 감소되었다.
균체 농도는 채취한 배양액을 적당한 배율로 희석하여spectrophotometer(U V-2201, Shimadzu, Japan)를 사용하여 600nm에서 흡광도(Abs600)를 측정하였다. 흡광도와 건조균체량에 대한 상관관계는 다음과 같다.
이동상으로써 3차 증류수와 acetonitrile을 15 : 85로 혼합하여 2 mL/min 의 유속으로 흘려주었으며, RI 검출기를 이용하여 실온에서 분석하였다. 포도당은 필요에 따라 glucose kit(영동제약)을 사용하여 분석하였다.
채취한 균체배양액을 10,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 얻은 상징액을 각 당의 농도가 40~50g/L정도 되게 희석한 후 Carbohydrate Analysis column (Waters, USA)이 장착된 HPLC(Knauer, Germany)를 이용하여 정량하였다. 이동상으로써 3차 증류수와 acetonitrile을 15 : 85로 혼합하여 2 mL/min 의 유속으로 흘려주었으며, RI 검출기를 이용하여 실온에서 분석하였다.
이동상으로써 3차 증류수와 acetonitrile을 15 : 85로 혼합하여 2 mL/min 의 유속으로 흘려주었으며, RI 검출기를 이용하여 실온에서 분석하였다. 포도당은 필요에 따라 glucose kit(영동제약)을 사용하여 분석하였다. Erythritol 수율(g/g)은 소모된 기질에 대하여 생성된 erythrkol의 양의 비율로 정의하였다.
대상 데이터
발효조 배양을 위한 전배양은 10 g/L yeast extract, 20g/L bactopepton의 YP 배지에 100g/L포도당을 첨가된 배지에 균주를 백금이로 접종하여 26℃에서 12시간 동안 실시하였다. 발효조 배양에 사용된 배지는 탄소원으로써, 포도당 또는 sucrose 400 g/L, 질소원으로 yeast extract 15-30g/L을 사용하였다. 경우에 따라서, YP 배지에 polypeptone 또는 casamino acid 20g/L를 질소원으로 첨가하였다.
경우에 따라서, YP 배지에 polypeptone 또는 casamino acid 20g/L를 질소원으로 첨가하였다. 발효조를 배양을 위하여 실험실 규모의 발효조(한국발효기, 인천)를 이용하여 1리터의 조업부피로 배양하였다. 배양온도는 26℃, 발효기의 교반속도는 700 rpm, 공기는 1 vvm 으로 주입하였고, 배양기간 동안 pH는 6.
본 연구에 사용한 균주는 경기도 일대의 벌집에서 선별하였으며(7) Candida magnoliae로 동정되었다.
7로 유지하였다. 소포제로 Antifoam 289(Sigma, USA)를 사용하였다.
성능/효과
5B)을 보면 KCI 20 g/L 첨가구와는 달리 erythritole 발표 초기부터 생성되었다. Erythritol 생성 량은 167 g/L로 증가되었고 수율은 0.42 g erythritol/g substrate로 향상되었다. Erythritol의 농도는 기질인 sucrose가 거의 소모된 다음인 150시간 이후에 최고치를 나타내었다.
Yeast extract을 질소원으로 첨가하였을 경우에 erythritol의 수율과 생산성이 높았기 때문에 탄소원으로 sucrose를, 질소원으로 yeast extract를 질소원으로 사용하였다. Sucrose 400 g/L와 yeast extract 20 g/L를 첨가하여 발효조 배양을 실시한 결과, 약 114 g/L의 erythritol을 얻을 수 있었다(Fig. 1).
Sucrose 400 g/L를 기준으로 하여 yeast extract를 각각 15, 20, 25 또는 30 g/L의 농도로 첨가한 배지로 발효실험을 하였다. 실험결과, 생산된 erythritol의 농도는 yeast extract 20 g/L에서 제일 높았고, 25와 30 g/L 농도에서는 감소되었다. Yeast extract 15 g/L일 때 erythritol 수율은 소모한 sucrose에 대하여 (140 g erythritol/g sucrose로 가장 높았다.
40g erythritol/g sucrose) 생성된 eiythitol의 양이 적었는데, 이는 질소원의 부족으로 세포성장이 억제되었기 때문인 것으로 추정되었다. 이를 보완하기 위해,casaminio acid, malt extract 및 polypeptone 등을 이용한 예비실험에서 가장 우수한 결과를 보인 무기질소원인 ammonium phosphate를 3 g/L의 농도로 첨가하여 배양한 결과 0.37 g erythritol/g sucrose의 수율로 149 g/L의 erythritol을 생산할 수 있었다(Fig. 3). 이 때의 수율은 yeast extract만을 주입했을 때보다 낮았으나 sucrose 이용이 증가됨에 따라 생산된 erythritol의 양이 늘어 생산성은 오히려 0.
4). 즉, 배지의 삼투압이 증가할수록 더 많은 erythritol이 생성되었으며, KCl 의 농도가 40 g/L일 때 erytMtol의 생산에 가장 유리하였다.
질소원으로 yeast extract만을 사용했을 때와 yeast extract와 casamino acid를 함께 사용했을때, 각각의 경우에서 모두 탄소원으로 포도당을 사용한 경우보다 sucrose를 사용한 경우에 erythritol의 농도, 수율 및 생산성이 증가하였으며, 또한 기질도 더 많이 소모하였다. 즉, 포도당을 기질로 사용할 경우, 당의 소모속도가 느리고 또한 잔당의 양이 많아 경제성을 고려한다면 포도당보다 sucrose 400g/L과 yeast extract를 이용하는 것이 유리한 것으로 판단된다. Yeast extract을 질소원으로 첨가하였을 경우에 erythritol의 수율과 생산성이 높았기 때문에 탄소원으로 sucrose를, 질소원으로 yeast extract를 질소원으로 사용하였다.
Table 1과 같다. 질소원으로 yeast extract만을 사용했을 때와 yeast extract와 casamino acid를 함께 사용했을때, 각각의 경우에서 모두 탄소원으로 포도당을 사용한 경우보다 sucrose를 사용한 경우에 erythritol의 농도, 수율 및 생산성이 증가하였으며, 또한 기질도 더 많이 소모하였다. 즉, 포도당을 기질로 사용할 경우, 당의 소모속도가 느리고 또한 잔당의 양이 많아 경제성을 고려한다면 포도당보다 sucrose 400g/L과 yeast extract를 이용하는 것이 유리한 것으로 판단된다.
5A)을 보면 50시간까지 erythritole 생성되지 않고 단지 기질의 분해만을 보였고 100시간쯤에 이르러서 eiythritol이 급격히 생성되었다. 최종 erythritol의 생성량은 136 g/L였으며, 수율과 생산성은 각각 0.34 g erythritol/g substrate, 0.86 g/L . hr으로 나타났다.
참고문헌 (13)
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