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문제 정의
- C. magnoliae JH를 이용하여 높은 수율의 erythritol을 생산하기 위한 삼투압 내성의 변이균주 개발과 탄소원 및 질소원의 최적 농도결정에 대한 연구를 수행하였다. 꿀 벌집에서부터 분리한 야생균주인 C.
- 이는 질소원의 고갈에 의한 세포의 성장이 제한될 경우에 당알콜의 생성이 촉진된다고 보고되어 있기 때문이다(24). 따라서 C/N ratio가 erythritol 생성에 매우 중요하므로 yeast extract 농도가 erythritol 생산에 미치는 영향을 검토하였다. 즉 glucose가 250 g/L로 첨가된 발효배지 1.
- 즉 삼투압 내성의 정도는당알콜의 생성 능력과 비례하므로 삼투압 내성이 우수한 변이 균주의 선별을 통하여 당알콜 생산에 이용하려는 시도가 많이 보고되어 있다{18, 19). 따라서 높은 수율로 erythritol을 생산하는 균주의 개발을 위하여 높은 농도의 당 또는 염에서 생육이 우수한 변이균주의 선별에 대한 실험을 수행하였다.
- 따라서 본 연구에서는 높은 수율로 erythmitol을 생산하기 위하여 꿀 벌집에서 분리한 Candida magnoliae JH를 이용한 삼투압 내성 변이균주의 개발과 탄소원 및 질소원의 최적 농도 결정에 대한 연구를 수행하였다.
- pathway# 통하여 직접 erythritols. 전환되므로 변이균주 M26을 이용한 여러 종류의 탄소원들에 대한 erythritol 발효를 수행하여 세포성장과 erythritol의 수율 및 생산성이 가장25 우수한 탄소원을 선별하고자 하였다.
제안 방법
- C. magnoliae JH의 spores에 EMS를 처리하여 변이를 유도한 후에 선별배지에 접종하여 colony 생장이 우수한 균주를 1차로 선별하였다. 여러 번의 변이유도 실험결과에서 700 g/L 의 glucose 배지에서 생육이 가능한 당 내성 변이균주는 얻지 못하였다.
- Glycerol, erytMtol의 정량은 NH2 column (Shisheido, Japan) 을 이용하여 HPLC (Waters, USA) 에서 RI Detector로 측정하였다. 이때 용매는 물과 acetonitrile을 15 : 85로 혼합하여 사용하였으며, 유속은 1.
- 23 g/L-h이었다. 균주의 수율 향상을 위하여 야생균주의 포자에 EMS를 처리한 후 2차에 걸친 선별과정을 통해 높은 농도의 염에서 세포성장이 우수하면서 동시에 erythrit이의 수율과 생산성이 가장 우수한 삼투압 내성 변이균주 M26을 최종적으로 선발하였다. 선발한 변이 균주 M26을 이용한 baffled flask 배양에서 100 g/L의 glucose 인 경우에 erythritol 의 수율과 생산성이 각각 25。%와 0.
- 이는 선별배지의 glucose 농도가 너무 높게 설정되었거나 EMS에 의한 변이유도에서 당에 대한 내성이 우수한 변이균주가 유도되지 않았기 때문으로 추정된다. 그러나 2.5 M의 KC1 배지에서는 100개 이상의 colony를 얻을 수 있었으며, 이중에서 colony 성장이 우수한 32개를 선별하여 100 g/L의 glucose 발효배지에서 erythritol 생성능력을 비교하는 실험을 수행하였다. 즉 120시간 발효에서 erythrit이의 생성능력이 우수한 4개의 변이균주와 야생균주에 대한 실험 결과를 Table 2에 나타내었다.
- 삼투압 내성이 우수한 것으로 입증된 변이 균주 M26은 이러한 점에서 높은 수율의 erythritol 생산에 유리한 균주이며, 높은 당 농도의 배지에서 발효가 가능하였다. 따라서 변이균주 M26을 이용하여 100~300 g/L 범위의 glucose가 포함된 발효배지 1.0 L를 2.5 L jar fermenter (KFC, Korea)에 넣고 흥lucose가 모두 소모되는 시간까지 실험을 수행하였다.
- 배지 내 당들의 농도는 당알콜 분석과 같은 조건으로 HPLC를 사용하였다. 또한 HPLC로 정확한 glucose의 정량이 불가농한 경우 Glucose Analyzer (YSI, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포 농도는 spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu, Japan)를 사용하여 620 nm 에서 optical density (O.
- 먼저 삼투압 내성이 높은 변이균주의 선별을 위하여 C. magnoliae JH의 당 및 염 내성에 대한 실험결과 (Table 1)에서 glucose는 700 g/L의 농도에서 생육이 불가능하였으며, KC1 은 2.5 M에서 미약한 생육이 관찰되어 각각의 농도를 당내성과 염 내성의 변이균주를 선별하기 위한 농도로 결정하였다. 또한 사용한 C.
- 발효배지에서 야생균주인 C. magnoliae JH와 선별한 염 내성 변이균주 M26의 발효특성을 알아보았다. 우선 glucose의 농도가 100 g/L인 발효배지에서 실험을 수행하였다.
- 진탕배양기에 의한 erythritol 발효는 발효배지 200 mL를 500 mL baffled flask에 넣고 28 ℃ 에서 200 rpm으로 진탕배양하였다. 발효조를 이용한 erythritol 발효는 발효배지 1.0 L를 2.5 L jar fermenter (KFC, Korea) 에 넣고 멸균한후에 28℃에서 0.5 vvm의 통기와 700 rpm으로 교반하면서실험을 수행하였다. 모든 발효배지의 초기 pH는 5 N K0H를이용하여 7.
- 또한 HPLC로 정확한 glucose의 정량이 불가농한 경우 Glucose Analyzer (YSI, USA)를 사용하여 분석하였다. 세포 농도는 spectrophotometer (UV-1201, Shimadzu, Japan)를 사용하여 620 nm 에서 optical density (O.D)를 측정하였다. 건조균체량은 흡광도와 건조균체량 (dry cell weight)의 표준곡선에 의하여 건조 균체량 (DCW : g/L) 으로 환산하였다.
- 7 g/L YNB (w/o amino acid)와 20 g/L agar에 glucose를각각 400 - 700 잉L의 농도범위로 첨가한 배지를 사용하였다. 실험 방법은 야생균주를 각각의 agar plate에 peaking한 후에 colony의 형성 여부를 확인하여 선택배지의 염과 당의 농도를 결정하였다. 야생균주의 변이유도를 위하여 먼저 spore를 Han 등(25)의 방법에 의하여 C.
- 5 mg/mL lyticase (100, 000 unit) 현탁액에서 4시간 동안 반응시켜 vegetable cell-g- 제거하고 spore 만을 선별하였다. 여기에 0.8% ethylmethane sulfonate (EMS)를 30분간 처리하여 변이를 유도하고 5% sodium thiosulfate를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 이 spore 현탁액을적정 배수로 희석한 후에 당 내성 변이균주 선별의 경우는 0.
- 염과 당에 대한 삼투압 내성을 갖는 변이균주의 선별을 위하여 야생균주의 생육이 불가능한 염 (KC1)과 당 (glucose)의농도를 결정하는 실험을 수행하였다. 염에 대한 내성 실험은 300 g/L glucose, 0.
- 결정하는 실험을 수행하였다. 염에 대한 내성 실험은 300 g/L glucose, 0.7 g/L YNB (w/o amino acid), 20 g/L agar가 포함된 배지에 KC1< 2.0 M-3.0 M의 농도범위로 각각 첨가하여 사용하였고, 당에 대한 내성 실험을 위해서는 0.7 g/L YNB (w/o amino acid)와 20 g/L agar에 glucose를각각 400 - 700 잉L의 농도범위로 첨가한 배지를 사용하였다. 실험 방법은 야생균주를 각각의 agar plate에 peaking한 후에 colony의 형성 여부를 확인하여 선택배지의 염과 당의 농도를 결정하였다.
- magnoliae JH와 선별한 염 내성 변이균주 M26의 발효특성을 알아보았다. 우선 glucose의 농도가 100 g/L인 발효배지에서 실험을 수행하였다. 이때 배양은 배지의 초기 pH가 7.
- 건조균체량은 흡광도와 건조균체량 (dry cell weight)의 표준곡선에 의하여 건조 균체량 (DCW : g/L) 으로 환산하였다. 이때 표준곡선은 일정 농도 비율의 균체에 대한 흡광도를 측정한 후에 이 용액 5 mL를 0.2 /加 membrane filter로 여과한 다음 진공건조기 (80℃ 의 50 mmHg) 에서 48시간 건조시켜 균체량을 측정하였다. 실험결과 C.
대상 데이터
- 를 이용한 glucose와 sucrose의 erythritol 발효에서 glucose 가 가장 빨리 대사에 이용된다는 보고와 일치하였다. 따라서 변이 균주 M26의 모 균주인 C. magnoliae JH는 꿀 벌집에서 분리되었고, 높은 삼투압에 내성인 균주들이 공통적으로 가지는 특성들을 지닌 효모로서 탄소원으로 glucose를 이용한 경우가 erythritol 의 생성이 가장 높았으므로 탄소원으로 glucose를 선정하였다.
- 선별한 4개 변이균주들의 발효 속도는 비슷하나 erythrit이의 생산능력에 차이가 있음을 알 수 있었다. 변이균주들 중에서 erythritol의 수율과 당의 소모속도에서 모두 우수한 변이균주 M26을 최종적으로 선별하였다.
- 본 연구에 사용한 균주는 서울대학교 식품공학과 서진호교수 연구실에서 꿀 벌집으로부터 분리하여 Candida magnoliae JH로 동정된 균주를 분양 받아 이용하였다<14).
이론/모형
- magnoliae JH의 spore를 얻었다. 변이유도는 본 실험실에서 사용하는 방법(25, 26)으로수행하였다. 즉 수집한 spores에 10 mM 2-mercaptoethanol에서 30분간 처리하였다.
- 실험 방법은 야생균주를 각각의 agar plate에 peaking한 후에 colony의 형성 여부를 확인하여 선택배지의 염과 당의 농도를 결정하였다. 야생균주의 변이유도를 위하여 먼저 spore를 Han 등(25)의 방법에 의하여 C. magnoliae JH의 spore를 얻었다. 변이유도는 본 실험실에서 사용하는 방법(25, 26)으로수행하였다.
성능/효과
- 5 M KC1 이 포함된 agar plate에 도말하여 30 ℃ 배양기에서 7일간 배양하였다. Colony 성장이 우수한 균주를 1차로 선별하였으며, 선별된 colony를 대상으로 flask 배양에의하여 erythritol의 수율과 생산성이 가장 우수한 변이균주를최종적으로 선발하였다.
- 이와 같이 C/N ratio가 낮은 배지에서는 erythritol의 수율이 감소하였는데, 이는 미생물 발효에서당알콜을 과량으로 얻기 위해서는 C/N ratio가 높은 배지를사용하였을 때 미생물의 성장이 제한되면서 당알콜의 분비가촉진된다는 결과와 일치하였다<24). 따라서 당알콜 생산을 위한 배지의 C/N ratio는 일반적인 발효배지의 C/N ratio 보다높아야 되며, 세포성장의 조절을 통해서 더 높은 수율의 erythritol을 생산할 수 있음을 알 수 있었다.
- 5 g/L 가 생산되었다. 또한 erythritol의 수율과 생산성도 glucose 농도의 증가에 따라 250 g/L까지 증가하여 최대의 수율은 51.0%이고 생산성은 0.63 g/L-h 이었으나, 300 g/L의 glucose 농도에서는 약간씩 감소하였다. 이러한 결과는 Kim 등(14)이야생균주인 C.
- 야생균주에 비하여 훨씬 우수하여 60시간 이후에 glucose가 모두 소모되었다 (Figure 2). 또한 배양초기의 세포 성장이 고농도 당에 의하여 억제되는 정도가 낮아서 야생 균주에 비하여 높은 세포농도를 나타내었다. 이러한 결과는 모두 야생균주에 비해 변이균주가 삼투압 내성이 크기 때문에 더 높은 당 농도에서는 발효속도가 더 큰 차이를 보일 것으로 판단되었다.
- 5 M에서 미약한 생육이 관찰되어 각각의 농도를 당내성과 염 내성의 변이균주를 선별하기 위한 농도로 결정하였다. 또한 사용한 C. magnoliae JH는 일반적인 다른 osmophilic yeast와 같이 염 보다 당에 대한 내성이 더 뛰어났으며, 이는배지내의 삼투압 조건을 높이는 시도를 통하여 높은 수율의 erythritol 생성을 유도하려는 실험을 수행할 경우 염보다 당을 사용하는 것이 유리하다는 점을 알 수 있었다(27).
- 5 g/L 가 생산되었으며, 발효말기에는 이ycerol이 존재하지 않았다. 또한 수율과 생산성도 glucose의 농도 증가에 따라 250 g/L까지 증가하여 최대 51.0%의 수율과 0.63 g/L-h의 생산성을 나타내었다.
- 3배 증가한 것으로서산업적인 erythritol 생산이 가능한 수준의 수율인 것으로 사료되었다. 또한 지금까지의 결과에서 250 g/L의 glucose 농도는 최대 수율의 erythritol 생성을 위한 최적의 C/N raitio 및삼투압 조건을 제공한다는 것을 알 수 있었다. 즉 250 g/L 이상의 glucose 배지는 세포성장을 저해하여 초기의 세포성장속도를 떨어뜨리며, 또한 그 이하의 낮은 glucose 농도에서는 erythritol 생산을 위하여 충분한 삼투압을 제공해 주지 못하기 때문인 것으로 생각된다(27, 30).
- 그러나 84시간 이후에는 erythritol의 농도가 약간 감소하는 경향을나타내었는데, 이는 기질인 glucose가 다 소모된 후에 erythritol 을 기질로서 이용하기 때문으로 사료되었다. 또한 최대 균체의 농도가 나타나는 시간에 최대의 erythritol 농도를 나타내었으므로 erythritol 의 생산은 growth associated form 인 것으로 관찰되었다. Erythritol 이외의 다른 부산물로는 소량의 glycerol이 배양 초기에 생성되었으나 erythritol이 최대로 생성되는 84시간 이후에는 생성되지 않고 오히려 - 감소하였다.
- 유기질소원인 yeast extract는 5 g/L의 농도에서 erythritol 수율이 가장 우수하였다. 발효조를 이용한 glucose 농도 결정에 대한 실험에서 세포농도는 glucose의 농도 증가에 따라 감소하였으나, erythritol 농도는 당 농도의 증가에 따라 증가하여 250 g/L 잉ucose의 농도에서 최대 127.5 g/L 가 생산되었으며, 발효말기에는 이ycerol이 존재하지 않았다. 또한 수율과 생산성도 glucose의 농도 증가에 따라 250 g/L까지 증가하여 최대 51.
- 즉 120시간 발효에서 erythrit이의 생성능력이 우수한 4개의 변이균주와 야생균주에 대한 실험 결과를 Table 2에 나타내었다. 선별한 4개 변이균주들의 발효 속도는 비슷하나 erythrit이의 생산능력에 차이가 있음을 알 수 있었다. 변이균주들 중에서 erythritol의 수율과 당의 소모속도에서 모두 우수한 변이균주 M26을 최종적으로 선별하였다.
- 2 /加 membrane filter로 여과한 다음 진공건조기 (80℃ 의 50 mmHg) 에서 48시간 건조시켜 균체량을 측정하였다. 실험결과 C. magnoliae JH 및 mutant M26의 1.0 O.D는 0.25 g/L의 건조균체량을 나타내었다.
- 실험결과(Table 5)에서 최대 세포농도는 당 농도의 증가에따라 감소하였으나 최대 erythritol의 농도는 당 농도의 증가에 따라 증가하여 250 g/L의 glucose 농도에서 최대 127.5 g/L 가 생산되었다. 또한 erythritol의 수율과 생산성도 glucose 농도의 증가에 따라 250 g/L까지 증가하여 최대의 수율은 51.
- 실험결과에서 5 g/L의 yeast extract 농도에서 최대 51%의수율을 나타내었으며, yeast extract 농도가 5 g/L 이상에서는수율은 감소하였으나, 생산성은 증가하였다. 이와는 반대로세포농도는 yeast extract의 농도가 증가함에 따라 증가하여 10 g/L의 yeast extract 농도이상에서 최대 44.
- 야생균주의 실험결과에서 erythrit이은 세포성장과 더불어증가함을 알 수 있었으며, 최대 ery버ritol의 생산은 glucose가거의 소모된 84시간 배양에서 나타났다 (Figure 1). 그러나 84시간 이후에는 erythritol의 농도가 약간 감소하는 경향을나타내었는데, 이는 기질인 glucose가 다 소모된 후에 erythritol 을 기질로서 이용하기 때문으로 사료되었다.
- 또한 배양초기의 세포 성장이 고농도 당에 의하여 억제되는 정도가 낮아서 야생 균주에 비하여 높은 세포농도를 나타내었다. 이러한 결과는 모두 야생균주에 비해 변이균주가 삼투압 내성이 크기 때문에 더 높은 당 농도에서는 발효속도가 더 큰 차이를 보일 것으로 판단되었다. 더구나 변이균주 M26은 야생균주 보다이ycerol을 더 적게 생산함을 알 수 있었으며, 이는 삼투압조절기작이 erythritol에 의하여 전적으로 이뤄지고 있음을 보여주었다.
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