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문제 정의
- 본 연구의 목표는 가지과 작물인 토마토, 감자, 가지, 고추에서 분리한 Altemaria균들을 공시하여 이들의 형태적 특징과 병원성을 조사함과 동시에, 분자생물학적 기법인 URP-PCR, ITS rDNA 및 histone gene sequences 분석을 통하여 가지과 작물에서 분리한 Allernaria균들의 다양성 및 유연관계를 뱕히고 이를 토대로 한 분류체계를 확립하며 병원균의 정확한 동정을 하는데 있다.
제안 방법
- Histone H3 유전자의 염기서열 분석: Histone H3 유전자 염기서열의 상동성 비교를 통해 작성한 phylogenic tree(Fig. 8)에서 A. solani^: 포함하는 group 2(ASO 1)와 3(ASO 2)이 하나의 큰 cluster를 형성하였고, A. tomato- philA 포함하는 group 1(ATO)과 Altemaria sp를 포함하는 group 4(ASP)는 각각 다른 cluster* 형성하였다(Fig. 7). 대조균주로 사용한 A.
- ITS 영역 및 Histone H3 유전자의 염기서열 분석: 가지과 작물에서 발생하는 Altemaria rRNA 유전자 (rDNA) 상에 있는 ITS 영역, 즉 ITS1 과 ITS2, 그리고 5.8S의 ribosomal gene을 증폭하기 위해 ITS1 과 ITS4 primer(White et al., 1990)를 다카라코리아(Takara Korea) 바이오메디칼사에 의뢰하여 제작하였다. ITS 영역의 증폭은 15 ng의 genomic DNA, 각 0.
- DNA 증폭은 initial denaturation 94℃에서 4분간 실시하고, dena turation 1분(94℃), annealing 1분(55℃), extension 2분 (72℃으로 35 cycles을 실시한 뒤 72℃에서 7분간 incuba tion 하였다. PCR 반응 이후, 15㎕의 생성물을 1.2% agarose gel에서 80 V 5시간 동안 전기 영동하고 ethidium bromide로 염색하여 관찰하였다.
- PCR 증폭된 ITS 영역과 histone H3 유전자는 Wizard PCR Preps DNA Purification System(Promega)으로 정제하고, sequencing 반응은 BigDye™ Terminator Cycle Se quencing Ready Reaction kit(Perkin-Elmer Co.)를 이용, template 40 ng, primer 3.2 pmol, terminator ready reac tion mixture 8 ㎕에 H20를 첨가하여 20 ㎕의 volume으로 조절한 뒤 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4분으로 25 cycles 의 PCR 반응을 수행하였다. 반응에는 각각 ITS4 primer 와 H3-lb primer를 사용하였다.
- 반응에는 각각 ITS4 primer 와 H3-lb primer를 사용하였다. Sequencing 반응이 완료된 후 반응생성물은 ethanol 침전하여 건조시킨 뒤 한국생 명공학연구원에 의 뢰 하여 염 기서 열을 결정 하였다. 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(Ver.
- URP-PCR 분석: 본 실험의 PCR 핵산지문 분석에는 서린 생명과학연구소(SRILS)의 SRILS UniPrimer™ kit를 사용하였다. 12종의 UniPrimer 중에서 미약한 증폭생성물을 보이는 URP-07과 UPR-12를 제외한 10종의 primer 를 사용하였다.
- 가지과 작물에서 분리한 균주 중 분생포자의 형태적 특징을 고려하여 선발한 10균주와 Simmons 및 CBS에서 분양받은 대조균주 4균주, 그리고 A. dauci, A. porri 및 A. panax 각각 1 균주를 공시하여(Table 1), ITS 염기서열분석, Histone 유전자 염기서열분석 및 RAPD-PCR 분석을 통하여 분자생물학적 특징을 조사하였다.
- 가지과 작물인 감자, 토마토, 고추, 가지의 겹무늬병 반에서 분리한 Altemaria 25균주들을 V-8 agar 배지에서 배양한 후 분생자경과 분생포자의 형태적 특징을 조사하였다. 분리균주들은 모두 대형포자를 분생자경의 선단에 보통 1개씩 형성하였고 간혹 2개의 분생포자가 chain으로 연결되기도 하였다.
- 국내의 가지과 작물에서 분리한 Altemaria 25 균주를 공시하여 분생포자의 형태적 특징을 조사하였고 A. solani 와 A. tomaofphila의 대표균주와 비교하였다. 분리균주 중형태적으로 구별되는 몇 균주들과 대표균주를 공시하여 감자, 토마토, 가지, 고추에 대한 병원성 검정을 실시하였다.
- 즉 Altemaria 균주들을 V-8 agar 배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 7~ 10일 배양한 후 분생포자 형성을 유도하기 위하여 균총의 기중균사를 scrapper로 긁어주고 근자외선광이 1일 12시간씩 켜지는 20~22℃ 항온기에서 1~2일 배양하였다. 균총에 형성된 altemaria의 분생포자와 분생자경을 떼어 slide glass의 lactophenol 용액속에 넣고 cover glass를 덮은 후 복합현미경(×400)관찰을 통하여 형태적 특징을 측정하였고 drawing tube를 이용한 line drawing을 통하여 이를 구체화하였다.
- 공시한 균주는 10종의 primer 별로 증폭된 band의 수에 차이를 보였는데, URP-04 primei에서 52개로 가장 많았고URP-05에서 21개로 가장 적었다. 대부분의 primer 에서는 30~40개 정도의 band가 증폭되었고, 증폭 산물의 농도 및 증폭효율에 가장 큰 영향을 미치는 annealing 온도는 권장 온도인 55℃에서는 smearing 현상이 발생하여 증폭 band의 수에 변화를 주지 않는 58℃에서 반응을 실시하였다.
- 분리균주 중형태적으로 구별되는 몇 균주들과 대표균주를 공시하여 감자, 토마토, 가지, 고추에 대한 병원성 검정을 실시하였다. 대표균주를 포함한 Altemaria 17개 균주를 공시하여 ITS 영역과 histone h3 유전자의 염기서열분석, URP (universal rice primer)에 의한 핵산지문분석을 실시하였다. Altemaria 균주들은 분생포자의 형태적 특징에 의하여 A.
- 검정을 실시하였다. 병원성 검정에는 토마토(품종 : 서광), 가지(품종 : 장옥대장), 고추(품종 : 녹광)의 종자를 원예용 상토를 넣은 포트에 파종하여 20~25℃의 온실에서 30일간 생육시킨 식물체를 사용하였고 감자(품종 : 대서)는 씨감자를 실내에서 모래를 깔은 밧트에서 발아시킨 후 원예용 상토를 넣은 포트에 옮겨 위와 같은 조건인 20~25℃에서 생육시킨 식물체를 사용하였다.
- 병원성 검정은 공시균주의 분생포자 현탁액(포자농도을 식물체에 고르게 분무접종한 후 접종상에 넣어 25℃에서 48시간 포화습도를 유지시킨 후 20~25℃ 온실로 옮겨 4~5일 후에 병반수를 세어 병 발생정도를 조사하였다.
- 분리 균주들을 V-8 agar 배지에서 배양한 후 분생포자와 분생자경의 형태적 특징을 조사하였다. 즉 Altemaria 균주들을 V-8 agar 배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 7~ 10일 배양한 후 분생포자 형성을 유도하기 위하여 균총의 기중균사를 scrapper로 긁어주고 근자외선광이 1일 12시간씩 켜지는 20~22℃ 항온기에서 1~2일 배양하였다.
- tomaofphila의 대표균주와 비교하였다. 분리균주 중형태적으로 구별되는 몇 균주들과 대표균주를 공시하여 감자, 토마토, 가지, 고추에 대한 병원성 검정을 실시하였다. 대표균주를 포함한 Altemaria 17개 균주를 공시하여 ITS 영역과 histone h3 유전자의 염기서열분석, URP (universal rice primer)에 의한 핵산지문분석을 실시하였다.
- 분리균주를 분생포자의 형태적 특징에 따라 4 group으로 구분한 후, 각 group 별로 대표균주를 2개씩 (group 4 는 1균주) 사용하여 감자, 토마토, 고추, 가지에 대한 병원성 검정을 실시하였다. 병원성 검정에는 토마토(품종 : 서광), 가지(품종 : 장옥대장), 고추(품종 : 녹광)의 종자를 원예용 상토를 넣은 포트에 파종하여 20~25℃의 온실에서 30일간 생육시킨 식물체를 사용하였고 감자(품종 : 대서)는 씨감자를 실내에서 모래를 깔은 밧트에서 발아시킨 후 원예용 상토를 넣은 포트에 옮겨 위와 같은 조건인 20~25℃에서 생육시킨 식물체를 사용하였다.
- 수집한 병반으로부터 Altemaria 균주를 분리하기 위하여 채집 직후에 병든 잎의 병반 가장자리를 포함한 신선한 병반을 10-mm2 절편으로 잘라 습지를 깐 플라스틱 페트리접시에 올려놓은 후 근자외선광(NUV lamp)이 1일 12시간씩 켜지는 20~22℃ 항온기(광조사시의 광도: 약 4000 lx)에서 1~2일 배양하였다. 해부현미경(×40) 관찰을 통하여 병반에 형성된 Altemaria 대형포자를 확인한 후 PDA 배지에 단포자 분리하여 25℃에서 배양하였다.
- 5% SDS]에 현탁하고 proteinase K 50 Mg을 첨가, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 여기에 400 ㎕ 2 × CTAB solution[2% CTAB(w/v), 100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 20 mM EDTA(pH 8.0), 1.4 M NaCl, 1% PVP (polyvinylpyrrolidone) Mr 40,000)을 첨가하여 섞어준 뒤 chloroform : isoamylalcohol(24 : 1)로 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액에 0.7 volume의 isopropanol을 첨가하여 DNA를 얻었다. TE buffer[Tris-HCl(pH 8.
- 2% agarose gel에서 전기 영동하고 ethidium bromideS. 염색하여 증폭 여부와 그 크기를 관찰하였다.
- 유사도(similarity)를 구하고 UPGMA(unweighted paired group methods using arithmetic average)에 의한 집괴분석을 실시하였다. 유사도와 UPGMA 분석은 NTSYS-pc program(Ver.
- 분생자경의 형태적 특징을 조사하였다. 즉 Altemaria 균주들을 V-8 agar 배지에 접종하여 25℃ 항온기에서 7~ 10일 배양한 후 분생포자 형성을 유도하기 위하여 균총의 기중균사를 scrapper로 긁어주고 근자외선광이 1일 12시간씩 켜지는 20~22℃ 항온기에서 1~2일 배양하였다. 균총에 형성된 altemaria의 분생포자와 분생자경을 떼어 slide glass의 lactophenol 용액속에 넣고 cover glass를 덮은 후 복합현미경(×400)관찰을 통하여 형태적 특징을 측정하였고 drawing tube를 이용한 line drawing을 통하여 이를 구체화하였다.
- 수집한 병반으로부터 Altemaria 균주를 분리하기 위하여 채집 직후에 병든 잎의 병반 가장자리를 포함한 신선한 병반을 10-mm2 절편으로 잘라 습지를 깐 플라스틱 페트리접시에 올려놓은 후 근자외선광(NUV lamp)이 1일 12시간씩 켜지는 20~22℃ 항온기(광조사시의 광도: 약 4000 lx)에서 1~2일 배양하였다. 해부현미경(×40) 관찰을 통하여 병반에 형성된 Altemaria 대형포자를 확인한 후 PDA 배지에 단포자 분리하여 25℃에서 배양하였다. 분리한 Altemaria 균주들은 시험관의 PDA 사면배지에 옮겨 25℃에서 7일간 배양한 후 5℃ 냉장고에 보관하면서 필요한 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 12종의 UniPrimer 중에서 미약한 증폭생성물을 보이는 URP-07과 UPR-12를 제외한 10종의 primer 를 사용하였다. PCR 증폭은 7.
- DNA 증폭은 initial dena turation 94℃에서 4분간 실시하고, denaturation 40초 (94℃), annealing 1분(60℃), extension 1분(72℃)으로 30 cycles을 실시하고 마지막으로 72℃에서 5분간 incubation 하였다. Histone H3 유전자의 증폭에 사용된 primer는 Glass(1995) 등의 H3-la와 H3-1K 한국 Bioneer사에 의뢰하여 제작하였다. PCR reaction mixture의 조성은 ITS 영역 증폭의 경우와 동일하였고, initial denaturation 92℃ 에서 2분간 실시한 뒤 denaturation 1분(92℃), annealing 1분(68℃), extension 1분(72℃)으로 30 cycles을 수행하고 반응이 끝난 뒤 72℃에서 5분간 incubation하였다.
- 가지과 작물인 감자, 토마토, 가지, 고추의 겹무늬병(겹둥근무늬병, early blight)에 병든 잎을 전국의 주요 재배단지에서 2002년 4월에서 9월에 걸쳐 수집하였다. 수집한 병반으로부터 Altemaria 균주를 분리하기 위하여 채집 직후에 병든 잎의 병반 가장자리를 포함한 신선한 병반을 10-mm2 절편으로 잘라 습지를 깐 플라스틱 페트리접시에 올려놓은 후 근자외선광(NUV lamp)이 1일 12시간씩 켜지는 20~22℃ 항온기(광조사시의 광도: 약 4000 lx)에서 1~2일 배양하였다.
- 한편 표준균주로서 미국의 Simmons로부터 분양받은 전형적인 A. solani(EGS 44-098)와 A. tomatophila(EGS 42-156)를,네덜란드의 CBS(Centraalbureau voor Schim- melculture)로부터 분양받은 A. solani(CBS 34779)를 사용하였고, 대조 균주로서 CBS로부터 분양 받은 A. elegansiC&S 109159)와 본 연구팀이 당근에서 분리한 A. dauci(CNU3 408), 양파에서 분리한 A. porri(CN[J 3366), 인삼에서 분리한 A. panax(CNU 3405)를 사용하였다. A.
데이터처리
- 각 균주의 primer에 의한 증폭 pattern의 비교는 동일한 크기의 band 존재 여부로 행하였고, band의 유무에 따라 0과 1로 나열하여 UNI coefficient. 유사도(similarity)를 구하고 UPGMA(unweighted paired group methods using arithmetic average)에 의한 집괴분석을 실시하였다.
- Sequencing 반응이 완료된 후 반응생성물은 ethanol 침전하여 건조시킨 뒤 한국생 명공학연구원에 의 뢰 하여 염 기서 열을 결정 하였다. 얻어진 염기서열은 PHYDIT program(Ver. 3.1, Chun)을 이용하여 align하였다.
- 유사도(similarity)를 구하고 UPGMA(unweighted paired group methods using arithmetic average)에 의한 집괴분석을 실시하였다. 유사도와 UPGMA 분석은 NTSYS-pc program(Ver. 2.1, Rohlf, 2000)을 이용하였다.
이론/모형
- 8S ribosomal DNA. The tree was obtained by neighbor joining method using Kimura two-parameter model. The number above branch indicates bootstrap values of distance.
- 8S ribosomal DNA. The tree was obtained by neighbor joining method using Kimura two-parameter model. The number above branch indicates bootstrap values of distance.
성능/효과
- 또한 감자에서 분리한 Altemaria sp.(ASP)는 A. solani(ASO) 와 형태적으로 유사하였지만 분생포자의 폭이 두껍고 부리(beak)가 작다는 점에서 ASO와 구별되었으며 가지과작물에서 보고된 바 없는 신종으로 추정되었다.
- solani(ASO) 및 미동정의 Altemaria sp.(ASP)의 group으로 나눌 수 있었고 A. solani(ASO)는 분생포자 부리 (beak)의 특징에 의하여 다시 ASO(l)과 ASO(2)의 2 type으로 나눌 수 있었다. ATO 와 ASO 균주들은 실험에 사용한 감자, 토마토, 가지, 고추에 모두 병원성이 있었고 ATO 균주는 특히 토마토에 강한 병원성이 있었으나, ASP 균주는 감자에만 병원성이 있었다.
- solani(ASO)는 분생포자 부리 (beak)의 특징에 의하여 다시 ASO(l)과 ASO(2)의 2 type으로 나눌 수 있었다. ATO 와 ASO 균주들은 실험에 사용한 감자, 토마토, 가지, 고추에 모두 병원성이 있었고 ATO 균주는 특히 토마토에 강한 병원성이 있었으나, ASP 균주는 감자에만 병원성이 있었다. 이 연구에서 사용한 molecular marker 증 ITS와 histon H3 유전자의 염기서열 분석은 4개의 형태적 group 을 명확히 구분할 수 없었지만, URP-PCR 핵산 지문분석법은 이들 group을 명확히 구분할 수 있었다.
- 수 있는 marker로 판단되었다. DNA 증폭생성물에 대한 UPGMA 분석은 개별 primer에서보다 이들을 종합하였을 때 grouping이 명확해짐을 알 수 있었다. 또한 10 개의 primer에 대한 증폭 pattern을 종합한 dendrogram은 URP-03 primer에서의 dendrogram과 가장 유사하므로 개별 primer로서 가지과 작물에서 분리한 Altemaria속 균의 구별에는 URP-03 primer가 적당한 것으로 생각되었다.
- 9). Group 1에 속하는 균주들은 1.4 kb 부근의 band가 특이적으로 존재하고, group 2 에 속하는 균주들은 0.9 kb의 band로 다른 group들과 구분되었으며 균주간에도 증폭 pattern에 약간의 차이를 보였다. Group 3에 속한 균주들은 group 1, 2와는 달리 0.
- 약한병원성을 나타내었다. Group 2(A. solani type 1)에 속하는 CNU 3585와 CNU 3601 균주는 모두 감자에서 분리된 균주였지만, 감자, 토마토, 가지에 모두 병원성이 있었고 고추에는 약한 병원성을 나타내었다. Group 3(A.
- solani type 2)은 분생포자의 형태에는 다소 차이가 있었고 분리 기주도 감자, 가지, 고추로 다양하였지만 병원성은 큰 차이가 없이 감자, 토마토, 가지 등에 모두 비슷한 병원성을 보여 주었다. Group4(Altemaria sp.)의 균주는 다른 group의 균들에 비하여 병원성이 약하여 단지 감자에만 약한 병원성을 보여주었다.
- ITS 영역의 염기서열 분석: 가지과 작물에서 분리한 Altemaria 균주들의 ITS 영역은 PCR 증폭 결과 600 bp 정도의 크기를 갖고 있으며 17균주 모두 동일한 크기를 보여주었다. ITS 영역의 염기서열 분석의 상동성 비교를 통해 작성된 phylogenic tree(Fig.
- 크기를 갖고 있으며 17균주 모두 동일한 크기를 보여주었다. ITS 영역의 염기서열 분석의 상동성 비교를 통해 작성된 phylogenic tree(Fig. 6)에서 가지과 작물에서 분리한 Altemarici균들은 대부분이 동일 cluster를 형성하여 이들이 근연의 관계에 있음을 알 수 있었고, 형태적 특칭에 따라 구분한 group간에 구별되는 특성은 나타나지 않았다. 단지 감자에서 분리한 CNU 3530 균주는 독립적인 cluster를 형성하여 다른 균주들과 명확하게 구분되었다.
- solani와 동일한 cluster를 형성하였다. ITS와 histon H3 data* 조합한 분석 결과는 histon H3 유전자의 염기서열 분석결과와 일치하였고, 높은 resolu- tion< 보여주었다(Fig. 8).
- 가지과 식물에서 분리한 Altemaria 균주들의 유전적 다양성과 균주간의 유연관계를 각종 molecular marker로 분석한 결과, ITS 영역의 염기서열분석은 유전적 다양성 및 형태적인 종의 구별에 적합하지 않았다. ITS 영역은 진화적으로 매우 보존된 ribosomal DNA(rDNA) 보다 많은 변이를 갖고 있어 종간에는 염기서열에 많은 차이가 있지만 종내에서는 그 차이가 극히 드물기 때문에 대부분의 균류의 종간 유연관계 해석에 이용되고 있다(Gardes 등, 1990).
- Group 4는 감자에서 분리한 CNU 3530 균주를 포함하고 다른 가지과 작물에서 분리한 균주들과 구별된 하나의 group을 형성하였는데 형태적 특징과 병원성 검정에서도 이 균주는 다른 그룹에 속한 균주들과 차이를 보여 지금까지 감자에서 보고된 종과는 다른 미기록의 새로운 종으로 생각되어진다. 가지과 작물에서 분리한네 group 의 Altemaria간의 유사도는 약 87%정도였으며, 증폭 band의 양상에 큰 차이를 보였던 대조균주인 A. panax, A. elegans는 약 70% 정도의 낮은 유사도를 보였다.
- 공시한 균주는 10종의 primer 별로 증폭된 band의 수에 차이를 보였는데, URP-04 primei에서 52개로 가장 많았고URP-05에서 21개로 가장 적었다. 대부분의 primer 에서는 30~40개 정도의 band가 증폭되었고, 증폭 산물의 농도 및 증폭효율에 가장 큰 영향을 미치는 annealing 온도는 권장 온도인 55℃에서는 smearing 현상이 발생하여 증폭 band의 수에 변화를 주지 않는 58℃에서 반응을 실시하였다.
- 이 group의 균들은 부리가 길고 분지한 것이 많은 점은 group 1의 균들과 유사하였다. 그러나 몸통부위에서 부리로 이어지는 부위가 급격히 좁아지지 않고 서서히 좁아지며 부리의 폭이 두꺼운 점은 group 2(A. solani) 균주들의 특징과 유사하였으며 전체적으로 A. solani의 범주에 들어감으로 이 group은 A. solani type 2로 구분하였다.
- 또한 감자분리 균주인 CNU 3530균주는 ITS영역과, histone H3 유전자의 염기서열분석으로 다른 종의 균들과 구별할 수 있었고, URP-PCR 핵산지문 분석에서도 증폭 band 양상에 큰 차이를 보이며 다른 종의 균들과 낮은 유전적 유사도를 보였음으로 기존에 보고 된 Altemaria 균과는 다른 미기록 종으로 판단되며 이 균의 명명을 포함한 정확한 동정과 국내분포 정도에 관한 추후검토가 필요하다. 대조균주 A. porri는 Allium^- 을 침해하는 병원균임에도 불구하고 ITS와 histone H3의염기서열 결과 유전적으로 A. soEi와 높은 유연관계를 보였다. 앞으로 A.
- 7). 대조균주로 사용한 A. dauci, A. panax, A. elegant outgroup을 형성하였으나, A. poE는 ITS 분석에서와 같이 A. solani와 동일한 cluster를 형성하였다. ITS와 histon H3 data* 조합한 분석 결과는 histon H3 유전자의 염기서열 분석결과와 일치하였고, 높은 resolu- tion< 보여주었다(Fig.
- DNA 증폭생성물에 대한 UPGMA 분석은 개별 primer에서보다 이들을 종합하였을 때 grouping이 명확해짐을 알 수 있었다. 또한 10 개의 primer에 대한 증폭 pattern을 종합한 dendrogram은 URP-03 primer에서의 dendrogram과 가장 유사하므로 개별 primer로서 가지과 작물에서 분리한 Altemaria속 균의 구별에는 URP-03 primer가 적당한 것으로 생각되었다. Weir et al.
- 본 연구에 사용된 12종의 URP primer는 가지과 작물에서 분리한 Altemaria 균주들에 대해 많은 증폭 band를 형성하였으나, URP-07과 URP-12 primed 전 균주에 걸쳐 매우 미약한 증폭반응을 나타내어 PCR 분석에서 제외하였다. 공시한 균주는 10종의 primer 별로 증폭된 band의 수에 차이를 보였는데, URP-04 primei에서 52개로 가장 많았고URP-05에서 21개로 가장 적었다.
- 본 연구에 사용한 10종의 URP primer들의 개별 primer 에 의한 증폭 결과, 가지과 작물에서 분리한 14균주 모두 공통적 인 band들이 많았고, 종간 균주간 차이를 나타내는 band들은 그 비율이 상대적으로 적었다. 그러나 URP-03, URP-05 그리고 URP-09와 같은 primer에서는 가지과 작물에서 분리한 Altemaria 종들을 grouping할 수 있는 특이적인 증폭 pattern을 보여주었다.
- (2002)은 tublin과 histone H3 유전자의 염기서열분석을 통하여 South Africa에서 분리한 Cry phone ctria cubensis^\ 균주들은 Asia와 South America에서 분리한 균주들과 구별되는 종임을 보고하였다. 본 연구에서 histone H3 유전자의 염기서열분석은 A. solani^- A. tomatophila의 구별이 가능하였으나 A. solani 내의 형태적 차이에 의한 group의 구별은 불가능하였다.
- 본 연구에서 공시한 molecular marker 중 URP-PCR 핵산 지문분석은 Altemaria 균주들의 형태적 종 및 group에 따라 독립된 cluster를 형성함으로서 형태적 특징을 잘 구분할 수 있는 marker로 판단되었다. DNA 증폭생성물에 대한 UPGMA 분석은 개별 primer에서보다 이들을 종합하였을 때 grouping이 명확해짐을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 분리 균주들의 기주, 분생포자의 형태, 병원성 검정 및 분자생물학적 특징을 종합할 때 토마토 겹무늬 병 균인 A. tomatophila는 감자겹 둥근무늬 병 균인 A. solani와 구분이 되었다. 또한 감자분리 균주인 CNU 3530균주는 ITS영역과, histone H3 유전자의 염기서열분석으로 다른 종의 균들과 구별할 수 있었고, URP-PCR 핵산지문 분석에서도 증폭 band 양상에 큰 차이를 보이며 다른 종의 균들과 낮은 유전적 유사도를 보였음으로 기존에 보고 된 Altemaria 균과는 다른 미기록 종으로 판단되며 이 균의 명명을 포함한 정확한 동정과 국내분포 정도에 관한 추후검토가 필요하다.
- alterata와 구별할 수 없었고, 이들의 형태적 차이는 HST 생성균의 종내 변이로 해석해야 한다고 주장하였다. 본 연구에서도 ITS 영역의 염기서열 분석은 가지과 작물에서 분리한 대형포자를 형성하는 Altemaria 균들의 형태적으로 구별되는 종간 및 group 간의 구별에 적합지 않은 marker임 이 판명되 었다.
- 본 연구에서도 국내의 가지과 작물에서 분리한 Altemaria 균주들은 형태와 분자생물학적 특성에서 다양성이 인정되었다. 분리 균주들은 분생포자의 형태적 특징에 따라 네 group으로 나눌 수 있었는데 group 1은 토마토 분리 균주들로서 A.
- 분리 균주들은 분생포자의 형태적 특징에 따라 네 group으로 나눌 수 있었는데 group 1은 토마토 분리 균주들로서 A. tomatophila와 유사하였고 group 2와 3은 감자, 가지, 고추에서 분리한 균주들로서 형태적 차이가 인정되지만 모두 A. solani^} 범주에 들어가며 group 4는 감자 분리 균주로서 다른 group의 균들과 형태적으로 차이가 있고 현재까지 가지과 작물에서 보고 된 바 없는 미기록 종으로 추정되었다.
- 분리한 Altemaria 균주들은 시험관의 PDA 사면배지에 옮겨 25℃에서 7일간 배양한 후 5℃ 냉장고에 보관하면서 필요한 실험에 사용하였다. 분리한 균주수는 감자에서 15균주, 토마토에서 7균주, 가지에서 2균주, 고추에서 1균주, 총 25균주였다.
- 분리균주들은 모두 대형포자를 분생자경의 선단에 보통 1개씩 형성하였고 간혹 2개의 분생포자가 chain으로 연결되기도 하였다. 분생자경의 특징은 균주간에 큰 차이가 없었고 분생포자의 형태와 부리(beak)의 특징에 따라 분리 균주들은 4개의 형태적 group으로 구분할 수 있었다.
- 이 연구에서 사용한 molecular marker 증 ITS와 histon H3 유전자의 염기서열 분석은 4개의 형태적 group 을 명확히 구분할 수 없었지만, URP-PCR 핵산 지문분석법은 이들 group을 명확히 구분할 수 있었다. 분생포자의 형태, 병원성검정, 분자생물학적 특징을 종합할 때 토마토 겹 무늬 병 에 관여 하는 A. tomatophila^ 감자겹 둥근무늬 병에 관여하는 A. solani^ 뚜렷이 구분할 수 있었다. 또한 감자에서 분리한 Altemaria sp.
- 같다. 분생포자의 형태는 group 1 균주들에 비하여 몸통이 길고 두개 이상의 부리를 갖는 분생포자의 비율이 한 개의 부리를 갖는 분생포자의 비율보다 높았다. 또한 몸통에서 부리가 시작되는 부위가 넓고(4~7 ㎛) 부리 끝부분으로 서서히 좁아진다.
- ATO 와 ASO 균주들은 실험에 사용한 감자, 토마토, 가지, 고추에 모두 병원성이 있었고 ATO 균주는 특히 토마토에 강한 병원성이 있었으나, ASP 균주는 감자에만 병원성이 있었다. 이 연구에서 사용한 molecular marker 증 ITS와 histon H3 유전자의 염기서열 분석은 4개의 형태적 group 을 명확히 구분할 수 없었지만, URP-PCR 핵산 지문분석법은 이들 group을 명확히 구분할 수 있었다. 분생포자의 형태, 병원성검정, 분자생물학적 특징을 종합할 때 토마토 겹 무늬 병 에 관여 하는 A.
- 단지 감자에서 분리한 CNU 3530 균주는 독립적인 cluster를 형성하여 다른 균주들과 명확하게 구분되었다. 한편 대조균주로 사용한 A. dauci, A. panax, A. elegans는 구별되는 outgroup을 형성하였으나 A. porri는 A.solani의 cluster에 포함되어 이들이 유전적으로 유연관계가 높은 것을 알 수 있었다.
- 형태적 특징에 따라 분류한 4개의 group중 group 1(A. tomatophila)은 토마토에서 분리한 균주들로서 감자, 가지 등에도 병원성을 나타내었으나 토마토에 특히 강한 병원성을 나타내어 다른 group의 균들과 차이를 보여 주었다. Group 2(A.
후속연구
- solani와 구분이 되었다. 또한 감자분리 균주인 CNU 3530균주는 ITS영역과, histone H3 유전자의 염기서열분석으로 다른 종의 균들과 구별할 수 있었고, URP-PCR 핵산지문 분석에서도 증폭 band 양상에 큰 차이를 보이며 다른 종의 균들과 낮은 유전적 유사도를 보였음으로 기존에 보고 된 Altemaria 균과는 다른 미기록 종으로 판단되며 이 균의 명명을 포함한 정확한 동정과 국내분포 정도에 관한 추후검토가 필요하다. 대조균주 A.
- soEi와 높은 유연관계를 보였다. 앞으로 A. g의 많은 균주를 공시하여 A. solani와의 유전적 유연관계에 대한 검토가 필요하다.
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