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문제 정의
- 본 연구는 국내외에서 수집한 기주특이적독소를 생성하는 3종의 Alternaria 병원균 즉, A. gaisen, A. mali, A. longipes와 그밖에 소형의 포자를 형성하는 8종의 Alternaria 를 공시 하여 rRNA의 internal transcribed spacer(ITS)와 mitochondrial small subunit rDNA(mt SSU rDNA)의 염기 서열 분석 및 universal rice primers(URPs) 에 의 한 PCR 핵산분석 방법들을 이용하여 DNA 다형성 및 그들 간의 계통학적 유연관계를 DNA 수준에서 조사하여 형태적인 유사성을 갖고 있는 소형의 포자를 형성하는 Alternaria 균류의 분류학적 체계를 확립하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- DNA 증 폭은 initial denaturation을 94, C에서 4분간 실시하고, denaturation 1분(94°C), annealing 1분(55°C), extension 2분 (7ZC以로 35 cycle을 실시한 뒤 72°C에서 7분간 incubation 하였다. PCR 반웅 이후, 15 卩/의 생성물을 1.2% agarose g이에서 60Y 5시간 동안 전기영동하고 ethidium bromide 로 염색하여 관찰하였다.
- PCR 산물은 Wizard PCR prep ki^Promega, Madison, WI, USA)으로 정제하고, sequencing 반응은 BigDye terminator cycle sequencing kits(Applied Biosystems, Forster City, CA, U.S.A.)를 이용, template 40 ng, primer 3.2 pmol, Terminator ready reaction mixture 8 卩/에 물을 첨 가하여 20 订의 volume으로 조절한 뒤 96°C 10초, 50°C 5초, 60°C 4분으로 25 cycle의 PCR 반응을 수행하였다. 반응에는 각 각의 PCR 반응에 사용한 동일한 primer를 사용하였다.
- 12종의 UniPrimer 중에서 미약한 증폭생성물을 보이는 URP-07과 URP-12를 제외한 10종의 primer를 사 용하였다. PCR 증폭은 15 ng의 genomic DNA, primer 100 ng, dNTP's 200 jiM, Taq DNA polymerase 2.5 unit, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 1.5mM MgCb에 HQ를 첨 가하여 최종 volume을 20 卩/로 조정 하였다. DNA 증 폭은 initial denaturation을 94, C에서 4분간 실시하고, denaturation 1분(94°C), annealing 1분(55°C), extension 2분 (7ZC以로 35 cycle을 실시한 뒤 72°C에서 7분간 incubation 하였다.
- 57c package(Felsenstein, 1985)를 사용하여 Kimura's 2- parameter distance model(Kimura, 1980)에 의해 작성되었 다. Tree의 topology를 조사하기 위하여 1000 반복의 bootstrap 분석을 실시하였다.
- DNA 증폭은 initial denaturation을 941에서 2분간 실시하고, denaturation 40초(94°C), annealing 1분(60°C), extension 1분(72°C)으로 30 cycle을 실시하고 마지막으로 72P에서 5분간 incubation 하였다. rDNA의 ITS 영역은 ITS 1과 ITS 4 primer(White 등, 1990), mitochondrial small subunit rDNA의 증폭을 위 해서 MS 1과 MS 2 primer(White 둥, 1990)를 이용하여 증폭하였다.
- PCR 증폭. 본 실험의 PCR 핵산지문 분석에는 서린 생명과학연구소(SRILS)의 SRILS UniPrimer™ kit를 사용 하였다. 12종의 UniPrimer 중에서 미약한 증폭생성물을 보이는 URP-07과 URP-12를 제외한 10종의 primer를 사 용하였다.
대상 데이터
- 로 공시하였다. A. alternated: 달래, 배, 사 과에서 분리한 15균주와 영국 IMI에서 분양받은 2균주, 그리고 미국의 Simmons로부터 분양받은 1균주를 공시하 였다. 분류 대조균주로는 A.
- 본 연구에 사용한 Alternaria 균주들은 Table 1에서와 같다. A. gaisen^: 배에서 분리한 5균주와 일본 Tottori 대 학에서 분양받은 8균주를 공시하였고, A. m血는 사과에 서 분리한 4균주와 일본 Tottori 대학에서 분양받은 7균 주, 그리고 일본 IFO(Institute for Fermentation)에서 분양 받은 1균주를 공시하였다. A.
- a가)아*esc&is는 덴마 크 IBT에서 분양받은 2균주와 일본 Tottori 대학에서 뷴 양받은 4균주를 공시하였다. A. infectoria는 덴마크 IBT 에서 2균주를 분양받아 공시하였고, A. n이umbii는 연에 서 분리한 6균주를 공시하였다. A.
- m血는 사과에 서 분리한 4균주와 일본 Tottori 대학에서 분양받은 7균 주, 그리고 일본 IFO(Institute for Fermentation)에서 분양 받은 1균주를 공시하였다. A. tertuissima는 무궁화, 벼, 코스모스, 딸기에서 분리한 14균주와 영국 IMI(Intemational Mycological Institute)에서 분양받은 2균주, 덴마크 IBT (Institute of Biote아imology)에서 분양받은 2균주를 공시하 였으며, A. longipes^ 담배에서 분리한 6균주와 일본 Tottori 대학에서 분양받은 1균주를 공시하였다. A.
- m〃.는 감귤 에서 분리한 5균주를 공시하였고 A. a가)아*esc&is는 덴마 크 IBT에서 분양받은 2균주와 일본 Tottori 대학에서 뷴 양받은 4균주를 공시하였다. A.
- alternated: 달래, 배, 사 과에서 분리한 15균주와 영국 IMI에서 분양받은 2균주, 그리고 미국의 Simmons로부터 분양받은 1균주를 공시하 였다. 분류 대조균주로는 A. brassicicola, A. porri, A. brassicae를 각각 1 균주씩 공시하였다. 공시균주들은 PDA (potato dextrose agar) 사면배지에 옮겨 배양하여 5, C의 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- URP-PCR bands의 분석. 각 균주의 primer에 의한 증 폭 pattem의 비교는 동일한 크기의 band 존재 여부로 행하 였고, band의 유무에 따라 0과 1로 나열하여 UNI coefficient 로 유사도(similarity)를 구하고 UPGMA(unweighted paired group methods using arithmetic average)에 의한 집괴분석 을 실시하였다. 유사도와 UPGMA 분석은 NTSYS-pc program(Ver.
- 각 균주의 primer에 의한 증 폭 pattem의 비교는 동일한 크기의 band 존재 여부로 행하 였고, band의 유무에 따라 0과 1로 나열하여 UNI coefficient 로 유사도(similarity)를 구하고 UPGMA(unweighted paired group methods using arithmetic average)에 의한 집괴분석 을 실시하였다. 유사도와 UPGMA 분석은 NTSYS-pc program(Ver. 2.1, Rohlf, 2000)을 이용하였다.
이론/모형
- 반응에는 각 각의 PCR 반응에 사용한 동일한 primer를 사용하였다. Gel 전개 및 염기서열 분석에는 ABI Prism 310 Genetic analyzer(PE Applied Biosystem)를 이용하였다. 염기서열 은 CLUSTAL X(Thompson 등, 1997)와 PHYDIT program version 3.
- kr/ Tchun/phydit)으로 정렬하였고, 애매하게 정렬된 부분은 분석에서 제외하였다. Neighbor-joining tree는 PHYLIP 3.57c package(Felsenstein, 1985)를 사용하여 Kimura's 2- parameter distance model(Kimura, 1980)에 의해 작성되었 다. Tree의 topology를 조사하기 위하여 1000 반복의 bootstrap 분석을 실시하였다.
성능/효과
- 본 실험의 PCR 핵산지문 분석에는 서린 생명과학연구소(SRILS)의 SRILS UniPrimer™ kit를 사용 하였다. 12종의 UniPrimer 중에서 미약한 증폭생성물을 보이는 URP-07과 URP-12를 제외한 10종의 primer를 사 용하였다. PCR 증폭은 15 ng의 genomic DNA, primer 100 ng, dNTP's 200 jiM, Taq DNA polymerase 2.
- 3A). A. gaisen은 13균주 모두 동일한 pattern 을 보이면서 다른 종들과 구별되는 증폭 pattern을 보여 주었다. 그러나 A.
- alternator 종 내 균주간의 유연관계가 다양하여 이들 종들은 타 종 에 비해 유전적으로 다양함을 알 수 있었다. A. gossypina 와 A. Hehmbii는 종간 가장 가까운 유연관계를 나타내었 으며 이들은 부생균인 A. 와도 근연의 관계에 있 었다. A.
- altemata 균주들과 유사하였다. A. longipes, A. citri, A. infectoria, 그리고 자리공 분리균 주들은 각각 종 특이적인 band pattenr을 나타내어 다른 종들과 구별이 가능하였다. 이 primer에서도 A.
- A. 讥彻toria는 분생포자의 형태적 특징이 다른 소형의 포자형성 균들과 많은 차이를 갖고 있으며 특히 ITS 영 역 및 미토콘드리아의 small subunit rDNA 영역의 염기 서열 및 URP-PCR 핵산지문 분석한 결과 다른 소형의 포 자형성 종들과 뚜렷하게 구분되는 것을 볼 수 있었다. 이 는 A.
- MS 1과 MS 2 프라이머를 이용하여 Alternaria 종들의 mt SSU을 증폭한 결과 600 bp 정도의 증폭 산물을 얻었 다. ITS에서와 마찬가지로 A.
- URP-06 primer에서 A. gaisen 13균주는 다른 종들과 구 별되는 band pattern을 나타내었으나, A. tenuissima 균주 들 중 벼에서 분리한 3균주의 band pattern은 A. g爾倒의 AK-11, AK-21, AK、42, No. 15A, 0-275 균주와 동일하였 다(Fig. 3B). A.
- infectoric를 제외한 10종의 Alternaria 는 서로 높은 유연관계를 보이고 있지만 종에 따른 유전 적인 특징을 보유하고 있음을 알 수 있었다. URP-PCR 핵산지문분석과 rDNA의 ITS 영 역 및 미토콘드리아의 small subunit의 염기서열 분석 결과들을 종합할 때 소형 의 포자를 형성하는 Alternaria는 분생포자의 형태적 특 징이나 병원성 등과 같이 각 종별로 고유의 특성을 어느 정도 보유하고 있지만 이들이 DNA 수준에서는 상당한 공통점을 갖고 있는 것으로 판단되었다.
- URP-PCR 핵산지문분석에서 보여주는 각 종간의 유전 적 유사도는 93-95% 정도로 매우 높았다. 이것은 분생 포자의 형태적 유사성, rDNA ITS와 미토콘드리아 small subunit rDNA 영역의 100% 상동성을 반영하는 것으로 생각된다.
- gaisen은 13균주 모두 동일한 pattern 을 보이면서 다른 종들과 구별되는 증폭 pattern을 보여 주었다. 그러나 A. mali, A. arborescens, A. 이temata는 종 내 균주간 1宀3개 band에 차이를 보이며 다양한 pattern으 로 증폭되었다. 특히 A.
- 또한 동 일 종 내의 균주간의 유사도는 종에 따라 그 차이가 심하였다. 그중에서도 A. mali, A. tenuissima, A. alternator 종 내 균주간의 유연관계가 다양하여 이들 종들은 타 종 에 비해 유전적으로 다양함을 알 수 있었다. A.
- citri는 유사한 pattern을 갖고 있었 다. 대부분의 종들은 서로 동일하거나 유사한 증폭 pattern 을 보였지만, A. infectoria, A. gossypina, 그리고 자리공 분리균주들은 각각 독특한 pattern으로 증폭되었다. 특히 A.
- gossypina, 그리고 자리공에서 분리한 균주들만이 동일 하였고, 나머지 종들에서는 균주간 다양한 pattern을 보여 주었다. 또한 A. gg*加시와 자리공 분리균주들은 각각 다른 소형의 포자 형성 종들과 구별되는 종 특이적인 증 폭양상을 보여주었다. A.
- 본 연구에서도 소형포자를 형성하는 Altemaria 종들은 ITS 영역 및 미토콘드리아의 small subunit rDNA 영역의 염기서열에서 소형포자를 형성하는 균류 간에는 차이가 없었다. 따라서 rDNA의 ITS와 미토콘드리아의 small subunit rDNA 영역에서 보여주는 100%의 상동성은 소형 포자를 형성하는 균들이 유전적 배경이 동일한 근연의 균 류인 것으로 해석할 수 있다.
- 소형의 포자를 형성하는 Alternaria 종들의 URP-PCR 핵산지문 분석 결과, A. infectoric를 제외한 10종의 Alternaria 는 서로 높은 유연관계를 보이고 있지만 종에 따른 유전 적인 특징을 보유하고 있음을 알 수 있었다. URP-PCR 핵산지문분석과 rDNA의 ITS 영 역 및 미토콘드리아의 small subunit의 염기서열 분석 결과들을 종합할 때 소형 의 포자를 형성하는 Alternaria는 분생포자의 형태적 특 징이나 병원성 등과 같이 각 종별로 고유의 특성을 어느 정도 보유하고 있지만 이들이 DNA 수준에서는 상당한 공통점을 갖고 있는 것으로 판단되었다.
- 소형의 포자를 형성하는 Alternaria 종들의 계통분석을 하기 위하여 ITS 1과 ITS 4 프라이머를 이용하여 rDNA 의 ITS 영역을 증폭한 결과 600bp 정도의 증폭 산물을 얻었다. 이들 염기서열을 바탕으로 Kimura's two-parameter 모델로 distance 분석을 한 결과 Fig.
- PCR 증푹. 연구에 사용된 12종의 URP primer는 소 형의 포자를 형성하는 Alternaria 균주들에 대해 많은 증 폭 band를 형성하였으나, URP-07과 URP-12 primer는 전 균주에 걸쳐 매우 미약한 증폭반응을 나타내어 PCR 분 석에서 제외하였다. URP primer URP-04, URP-06 및 U琅P・11 에 증폭된 대표적인 pattern은 Fig.
- 자리공의 병반에서 분리한 Altemaria sp는 rDNA의 ITS 영역과 미토콘드리아의 small subunit rDNA 영역의 염기 서열을 분석한 결과 소형의 포자를 형성하는 Altemaria 종들과 monophyletic group을 형성하고 염기성열이 100% 일치하였지만, URP-PCR 핵산지문분석에서 다른 소형의 포자 형성 균들과 다른 그룹을 형성하였고, 분생포자의 형태 및 포자사슬의 형성 양상에서도 차이가 있었다(자 료 미발표). 이들 결과를 바탕으로, 자리공에서 분리한 Altemaria는 다른 소형의 포자 형성 균들과 구별되는 새 로운 종으로 예상된다.
- 이상의 결과에서 개별 URP primer에 의 하여 증폭된 PCR band에서는 모든 종에 대한 특이적인 증폭 pattern 이 나타나지 않았지 만, 여 러 종의 primer에 의 한 URP- PCR 결과를 종합하여 작성된 dendrogram에서 소형의 포 자를 형성하는 Altemaria는 종간 유사도는 높았으나 각 각의 종에 따라 서로 다른 유전적인 특징을 보유하고 있 음을 알 수 있었다.
- 자리공의 병반에서 분리한 Altemaria sp는 rDNA의 ITS 영역과 미토콘드리아의 small subunit rDNA 영역의 염기 서열을 분석한 결과 소형의 포자를 형성하는 Altemaria 종들과 monophyletic group을 형성하고 염기성열이 100% 일치하였지만, URP-PCR 핵산지문분석에서 다른 소형의 포자 형성 균들과 다른 그룹을 형성하였고, 분생포자의 형태 및 포자사슬의 형성 양상에서도 차이가 있었다(자 료 미발표). 이들 결과를 바탕으로, 자리공에서 분리한 Altemaria는 다른 소형의 포자 형성 균들과 구별되는 새 로운 종으로 예상된다.
- 4는 10종의 primeH] 의해 생성된 총 386개의 band를 종합하여 UPGMA (unweighted paired group methods with arithmetic average)에 의한 집괴분석을 실시한 결과이다. 작성된 dendrogram 에서 소형의 포자를 형성하는 Altemaria 균주들은 형태 적 특징과 병원성에 근거하여 구분한 종에 따라 독립된 cluster* 형성하였으며, 종간의 유연관계도 서로 차이가 있음을 알 수 있었다. 종간의 유사도는 93~95%로 비교 적 높았으며, 증폭 band의 양상에 큰 차이를 보였던 A.
- 3C). 종 내 균주간의 증폭 pattern은 각각 A. nelumbii, A. gossypina, 그리고 자리공에서 분리한 균주들만이 동일 하였고, 나머지 종들에서는 균주간 다양한 pattern을 보여 주었다. 또한 A.
- arborescens^z 가까 운 근연관계 없이 cluster# 이루며 존재하였다. 종 특이 적인 URP-PCR 양상을 보여주었던 자리공 분리균주들은 다른 소형의 포자형성 종들과 비교적 먼 유연관계를 나 타내었고, 특히 A. Mectoria는 다른 소형 분생포자를 형 성하는 Altemaria 종들과 대형 분생포자 형성균들이 갖 는 유전적 거리만큼 먼 유연관계를 나타내어 유전적으로 큰 차이가 있는 종으로 나타났다. 한편 A.
- 작성된 dendrogram 에서 소형의 포자를 형성하는 Altemaria 균주들은 형태 적 특징과 병원성에 근거하여 구분한 종에 따라 독립된 cluster* 형성하였으며, 종간의 유연관계도 서로 차이가 있음을 알 수 있었다. 종간의 유사도는 93~95%로 비교 적 높았으며, 증폭 band의 양상에 큰 차이를 보였던 A. i*ctoria는 85% 정도의 낮은 유사도를 보였다. 또한 동 일 종 내의 균주간의 유사도는 종에 따라 그 차이가 심하였다.
- Mectoria는 다른 소형 분생포자를 형 성하는 Altemaria 종들과 대형 분생포자 형성균들이 갖 는 유전적 거리만큼 먼 유연관계를 나타내어 유전적으로 큰 차이가 있는 종으로 나타났다. 한편 A. alternata 균주 인 CNU-HR704는 다른 A. alternata 균주들과는 달리 A. nelumbii, A. gossypina 및 A. alternata를 포함하는 3종의 cluster group에 포함되었다.
후속연구
- 따라서 ITS와 같이 일 부의 염기서열만을 대상으로 하지 않고, 전체 유전자를 대상으로 하는 핵산지문법은 각 종간 특징적인 결과를 얻 을 수 있다. 추후, 다수의 copy로 구성된 repetitive sequence 를 이용한 유전자의 핵산지문 분석을 통하여 보다 포괄 적인 genome 분석을 실시한다면 소형의 포자를 형성하 는 仙egia의 계통분류에 관한 많은 정보를 얻을 수 있 을 것으로 생각된다.
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