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문제 정의
- 즉, 불용성인산을 가용화시킬 수 있는 미생물 (phosphate-solubilizing microorganism, PSM)을 토양에 접종함으로써 고정된 토양 인산의 가용화를 촉진시킬 수 있고, 이에 따라 농작물의 생산성을 높일 수 있다(9). 따라서 본 연구에서는 합성 비료 잔류로 인한 염류집적 피해 경감, 인산자원의 재활용 및 환경보전을 최종목적으로, 먼저 고농도염이 존재하는 환경에서도 불용성인산을 가용화시킬 수 있는 토양 미생물을 탐색한 후, 선정된 균주의 기초적인 생리적 특성을 파악함으로서 미생물 인산 비료의 실용화를 위한 기초자료를 구축코자 하였다.
제안 방법
- 05%, FeSO4 . 7H2O 0.05% 및 yeast extract 0.05% (pH 7.0)이었으며, 불용성 인산원으로 Ca3(PO4)2 0.5%를 첨가하였다. 경남 밀양의 각종 농경지 토양 및 농작물 근권 토양을 시료로 채취하였으며, 준비된 토양시료 현탁액을 단계적으로 희석한 후, 일정액을 PVK agar plate에 도말하여 30℃ 2에서 7일간 배양하였다.
- 가용성 인산을 생성할 수 있는 기질범위를 조사하기 위하여 각종 불용성인산(#, hydroxyapatite)이 각각 0.5%씩 함유된 최적배지에 분리균주를 접종하여 30°C, 200rpm에서 5일간 배양한 후, 가용성인산의 농도 및 배양액의 최종 pH를 측정하였다.
- 각종 불용성인산의 종류에 따른 가용성인산 생성능을 조사하기 위하여 CaHPO4, FePO4 - 4H2O, A1PO4 및 hydroxyapatite를 각각 0.5%씩 첨가한 최적배지에서 배양한 결과는 Fig. 4에서 보는 바와 같다. CaHPO4 및 hydroxyapatite의 경우, 698 mg/L, 912mg/L의 가용성인산이 생성되었으며, 배양액의 최종 pH는 2.
- 분리균주를 동정하기 위하여 형태학적, 배양적 특성 및 생리학적 특성을 Manual of Methods for General Bacteriology (6) 및 Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria (12)에 준하여 검토하였으며, 도출된 결과를 Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria (3) 및 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7)를 참조하여 동정하였다. 동시에 자동세균동정장치인 Vitek system (bioMerieux, France)을 통하여 동정 결과를 검정하였다.
- 배양액의 subsample과 1 N HC1 을 1 : 1의 비율로 혼합함으로서 배양액 속의 잔존 불용성인산을 가용화시킨 후, spectrophoto meter를 이용하여 660 nm에서의 흡광도를 측정하여 균체 생육도를 조사하였다(16). 배양액속의 가용성인산의 농도는 17, 418Xg, 20 분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액을 대상으로 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method (4)로 조사하였으며, 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였다. 모든 실험은 삼반복으로 실시하였으며, 나타낸 각 결과들은 이들의 평균값이 었다.
- 배양액의 subsample과 1 N HC1 을 1 : 1의 비율로 혼합함으로서 배양액 속의 잔존 불용성인산을 가용화시킨 후, spectrophoto meter를 이용하여 660 nm에서의 흡광도를 측정하여 균체 생육도를 조사하였다(16). 배양액속의 가용성인산의 농도는 17, 418Xg, 20 분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액을 대상으로 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method (4)로 조사하였으며, 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였다.
- 분리균주의 불용성인산 가용능에 영향을 미치는 조건을 알아 보기 위하여 배양온도, 초기 pH, 각종 탄소원, 질소원 및 무기이온의 종류 및 농도 등에 따른 균체 생육도, 가용성인산 농도 및 배지의 최종 pH를 200rpm에서 5일간 회전진탕배양 후, 측정하 였다.
- 선정균주들을 각각 2%의 NaCl이 함유된 PVK broth에 접종하여 30°C, 200 rpm, 5일간 회전진탕 배양하였다. 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 가 용성인산의 농도를 측정하여 인산 생성능이 가장 우수한 균주를 고농도 염존재하에서도 불용성인산을 가용화시킬 수 있는 균주로 최종 선정하였다.
- 질소원이 가용성인산 생성능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 yeast extract와 (NH^SQ;를 제외한 분리용 배지에 각종 질소원을 0.1%씩 첨가하여 30℃, 200rpm에서 5일간 배양한 결과는 Table 4에서 보는 바와 같다. 유기질소원이 무기질소원보다 균체 생육도 및 가용성인산 생성능이 높았으며, 질소원의 첨가가가용성인산 생성에 필수적인 것은 아니었다.
대상 데이터
- 5%를 첨가하였다. 경남 밀양의 각종 농경지 토양 및 농작물 근권 토양을 시료로 채취하였으며, 준비된 토양시료 현탁액을 단계적으로 희석한 후, 일정액을 PVK agar plate에 도말하여 30℃ 2에서 7일간 배양하였다. 콜로니 주위에 생성된 투명환의 직경이 큰 콜로니들을 1 차적으로 불용성인산 가용화미생물로 선정하였다.
- 경남 밀양지역의 논, 밭 및 농작물의 근권 토양으로부터 Ca3(PQ)2가 함유된 평판배지상에서 직경 1 cm 이상의 투명환을 생성하는 42개 균주를 분리하였다(Fig. 1). 그 중 논 토양시료로 부터 분리된 P-8, P-25, 밭토양시료로부터 분리된 F-27, 근권 토양시료로부터 분리된 R-38, R-41, R-42 균주가 2% NaCl이 함유된 PVK broth에서 불용성인산 가용능이 우수하였다.
- 그 중 논 토양시료로 부터 분리된 P-8, P-25, 밭토양시료로부터 분리된 F-27, 근권 토양시료로부터 분리된 R-38, R-41, R-42 균주가 2% NaCl이 함유된 PVK broth에서 불용성인산 가용능이 우수하였다. 이 중에서 콩의 근권 토양으로부터 분리되었으며, 가용성인산 생성능이 가장 우수한 R-38을 실험균주로 선정하였다. 실험균주의 분류학적 위치를 밝힌 결과는 Table 1과 같다.
- 경남 밀양의 각종 농경지 토양 및 농작물 근권 토양을 시료로 채취하였으며, 준비된 토양시료 현탁액을 단계적으로 희석한 후, 일정액을 PVK agar plate에 도말하여 30℃ 2에서 7일간 배양하였다. 콜로니 주위에 생성된 투명환의 직경이 큰 콜로니들을 1 차적으로 불용성인산 가용화미생물로 선정하였다. 선정균주들을 각각 2%의 NaCl이 함유된 PVK broth에 접종하여 30°C, 200 rpm, 5일간 회전진탕 배양하였다.
데이터처리
- 배양액속의 가용성인산의 농도는 17, 418Xg, 20 분간 원심분리하여 균체를 제거한 배양 상등액을 대상으로 vanadomolybdophosphoric acid colorimetric method (4)로 조사하였으며, 균주를 접종하지 않은 배지를 대조구로 사용하였다. 모든 실험은 삼반복으로 실시하였으며, 나타낸 각 결과들은 이들의 평균값이 었다.
이론/모형
- 분리균주를 동정하기 위하여 형태학적, 배양적 특성 및 생리학적 특성을 Manual of Methods for General Bacteriology (6) 및 Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria (12)에 준하여 검토하였으며, 도출된 결과를 Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria (3) 및 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (7)를 참조하여 동정하였다. 동시에 자동세균동정장치인 Vitek system (bioMerieux, France)을 통하여 동정 결과를 검정하였다.
성능/효과
- 가용성인산 생성에 최적인 glucose의 농도를 조사한 결과, glucose의 농도증가에 따라 가용성인산의 생성량도 증가하였으나 3% 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 0.5% 및 1%에서 각각 59mg/L 및 103mg/L의 가용성인산이 생성되었는데, 이것은 pH 감소가 그다지 크지 않은데 기인하는 것으로 추정되며, 3% 이상의 농도에서 가용성인산의 생성량이 감소하는 것은 상대적 균체 생육도가 저조함에 기인하는 것으로 추정된다. 따라서 glucose 3%를 최적농도로 결정하였다(Fig.
- P. agglomerans R-38을 25, 30, 37℃2에서 각각 배양한 결과, 30℃2에서 가장 우수한 가용성인산 생성능을 나타내었으며, 25℃ 및 37℃2에서 배양한 경우, 30℃2의 85% 및 90%의 가용성인산 생성능을 가지고 있었다. 한편, 본 균주는 초기 pH 4~9의 영역에서 가용성인산을 생성할 수 있었으며, 그중 pH 7.
- 따라서 앞으로 본 균주가 생성하는 유기산의 종류와 농도에 대한 실험이 뒤따라야 할 것으로 판단된다. 가용성인산 생성에 최적인 glucose의 농도를 조사한 결과, glucose의 농도증가에 따라 가용성인산의 생성량도 증가하였으나 3% 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 0.
- NaNOz의 첨가는 균체생육을 완전히 저해하였다. 경제성을 고려하여 무기질소원중 가장 높은 가용성인산 생성능을 나타낸 NH4NO3를 최적질소원으 로 선정한 후, 최적농도를 조사한 결과 0.1%로 나타났으며, yeast extract의 부수적인 첨가는 가용성인산 생성능에 아무런 영향을 미치지 않았다. Penicillium mgulosium의 경우, nitrate가 ammonium보다 훨씬 우수한 가용성인산 생성능(15)을 보였으나, 본 균주에서는 이러한 경향이 나타나지 않았다.
- 1). 그 중 논 토양시료로 부터 분리된 P-8, P-25, 밭토양시료로부터 분리된 F-27, 근권 토양시료로부터 분리된 R-38, R-41, R-42 균주가 2% NaCl이 함유된 PVK broth에서 불용성인산 가용능이 우수하였다. 이 중에서 콩의 근권 토양으로부터 분리되었으며, 가용성인산 생성능이 가장 우수한 R-38을 실험균주로 선정하였다.
- 4H2O, A1PQ로부터 각각 176, 10, Omg/L의 가용성인산을 생성(19)하며, Rahnella aquatilis는 hydroxyapatite 로부터 230mg/L의 가용성인산을 생성한다고 보고되어 있다(11). 따라서 본 균주는 이들보다 훨씬 우수한 불용성인산 가용능을 가지고 있음을 알 수 있었다. 한편, calcium phosphate에 활발하게 작용하는 미생물들은 iron 또는 aluminum phosphate 가용화능이 매우 저조한 것으로 알려져 있으며(8), 본 균주도 유사한 결과를 나타내었다.
- Pantoea 속은 1989년 Gavini 등에 의하여 최초로 제안된 속이며, Pantoea agglomerans는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에는 기재되어 있지 않으나 Bergey's Manual Determinative Bacteriology 제 9 판에는 기재되어 있는 세균으로, 현재 Enterobacter agglomerans와 구분없이 사용되고 있다(7). 따라서 분리균주 R-38을 Pantoea agglomerans R-38로 명명하였다.
- 그 외 각종 탄소원으로부터 102~207 mg/L의 가용성인산이 생성되었다. 또한 가용성인산 생성에 탄소원은 필수적인 것으로 나타났으며, 가용성인산 생성은 배지의 pH 감소와 밀접한 관련이 있는 것으로 추정되었다. 일반 적으로 불용성인산이 가용성인산으로 전환되는 이유는 미생물이 생산한 각종 유기산에 의한 배양액의 pH 감소가 주원인으로 보고되어 있다(14).
- 이러한 문제는 농촌진홍청이 설정한 우리나라 토양에 적합한 표준 비료 시비량에 비해 인산은 138%를 더 시비하며, 그 결과 토양 평균 잔류인산이 231 mg/L이고, 적정량보다 많은 인산을 포함한 토양의 비율이 50%에 달하는 것을 보아도 알 수 있다(2). 또한, 농업기 술연구소가 10 년간 하우스 재배 토양을 조사한 결과, 인산(적정 량 150mg/L)이 최고 1, 951 mg/L이나 존재하는 것으로 조사되었고 특히, 대량의 인산이 식물체가 이용할 수 없는 불용성 인산염의 형태로 토양에 축적되어 있음이 확인되었다(1).
- 본 균주는 그람음성의 운동성이 있는 통성혐기성 간균으로서, 배양적 및 생리생화학적 제반 특성을 Cowan and Steel's Manual for the Identification of Medical Bacteria 및 Bergey's Manual of Determinative Bacterio logy0!] 준하여 검토한 결과, Enterobacter aggkmerans일 가능성이 가장 높았다. 또한, 자동세균동정장치인 Vitek system과 GNI card를 이용하여 4 시간 반응 후 동정한 결과, Pantoea agglo- merans (Enterobacter agglomerans)와 가장 유사한 것으로 나타 났다(98%, Table 2). Pantoea 속은 1989년 Gavini 등에 의하여 최초로 제안된 속이며, Pantoea agglomerans는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에는 기재되어 있지 않으나 Bergey's Manual Determinative Bacteriology 제 9 판에는 기재되어 있는 세균으로, 현재 Enterobacter agglomerans와 구분없이 사용되고 있다(7).
- 1%씩 첨가하여 30℃, 200rpm에서 5일간 배양한 결과는 Table 4에서 보는 바와 같다. 유기질소원이 무기질소원보다 균체 생육도 및 가용성인산 생성능이 높았으며, 질소원의 첨가가가용성인산 생성에 필수적인 것은 아니었다. NaNOz의 첨가는 균체생육을 완전히 저해하였다.
- 이에 따라 농작물 생산성을 향상시키기 위하여 대량의 합성인산비료를 그만큼 더 사용하게 되었고, 결과적으로 환경오염을 비롯한 여러 가지 문제가 발생하게 되었다. 이러한 문제는 농촌진홍청이 설정한 우리나라 토양에 적합한 표준 비료 시비량에 비해 인산은 138%를 더 시비하며, 그 결과 토양 평균 잔류인산이 231 mg/L이고, 적정량보다 많은 인산을 포함한 토양의 비율이 50%에 달하는 것을 보아도 알 수 있다(2). 또한, 농업기 술연구소가 10 년간 하우스 재배 토양을 조사한 결과, 인산(적정 량 150mg/L)이 최고 1, 951 mg/L이나 존재하는 것으로 조사되었고 특히, 대량의 인산이 식물체가 이용할 수 없는 불용성 인산염의 형태로 토양에 축적되어 있음이 확인되었다(1).
- 6으로 감소하였으며, 이에 따라 가용성인산도 생성되기 시작하였다. 이후, 배양시간 경과 에 따라 pH의 변화는 없었으나, 가용성인산 생성량은 증가하여 배양 5일경, 898mg/L의 가용성인산이 생성되었다. 이것은 알칼리성 토양에서 분리된 세균들인 NBRI 0603, 2601, 2346 및 4003에서 나타난 경향(14)과 일치하는 결과였다.
- agglomerans R-38을 25, 30, 37℃2에서 각각 배양한 결과, 30℃2에서 가장 우수한 가용성인산 생성능을 나타내었으며, 25℃ 및 37℃2에서 배양한 경우, 30℃2의 85% 및 90%의 가용성인산 생성능을 가지고 있었다. 한편, 본 균주는 초기 pH 4~9의 영역에서 가용성인산을 생성할 수 있었으며, 그중 pH 7.5에서 최적 생성능을 나타내었다.
후속연구
- 일반 적으로 불용성인산이 가용성인산으로 전환되는 이유는 미생물이 생산한 각종 유기산에 의한 배양액의 pH 감소가 주원인으로 보고되어 있다(14). 따라서 앞으로 본 균주가 생성하는 유기산의 종류와 농도에 대한 실험이 뒤따라야 할 것으로 판단된다. 가용성인산 생성에 최적인 glucose의 농도를 조사한 결과, glucose의 농도증가에 따라 가용성인산의 생성량도 증가하였으나 3% 이상의 농도에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다.
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