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문제 정의
- 따라서 본 논문은 어병세균에 대한 넓은 항균 스펙트럼을 갖고 있는 probiotics 균주를 어류의 장내와 한국의 전통 발효식품인 김치와 젓갈 등에서 선발하여 항균특성을 밝히고 어류의 세균성 질병 예방 혹은 치료를 증대시키기 위한 기초 실험이다.
제안 방법
- Bacteriocin 유사물질에 의한 항균활성을 갖고 있는 균주를선발하기 위하여 nutrient agar (NA, Difco, Detroit, USA) 배지상에서 spotted method (2, 10)로 검토하였다. Agar spotted method는 전 배양된 probiotic 후보균주 5 를 NA 한천배지 표면에 적하시킨 후 3TC에서 24 시간 배양하여 집락이 형성된 표면에 lO^CFU/ml의 피검균이 첨가된 연 한천배지(0.7% agar) 10ml를 중층하여 4에서 4 시간 방치한 후 32에서 24 시간배양하여 저지 환을 확인함으로써 항균활성을 측정하였다.
- L. sakei BK19 supematant-^l 항균성 기작은 병원 균수의 확인 및 주사전자현미경(SEM) 관찰을 통하여 관찰하였다. 각각 V anguillarum^ V alginolyticus^: 접종한 BHI broth에 L.
- L. sakei BK를 MRS brotli로 37C에서 24 시간 동안 전 배양 한 후 7000Xg에서 10 분간 원심 분리하여 세균을 제거하고 유기산과 과산화수소에 의한 항균력을 배제하기 위하여 0.1 N NaOH로 pH를 6.5로 중화시키고 catalase (5 mg/ml)를 5 분간 처리한 후 얻어진 상등액을 evaporator로 5 배 농축하였다.
- 생화학적 성상은 Api 50CHL (Biomerieux, France) 을 이용하여 상법에 따라 시행하였고 16S rRNA PCR을 통한동정은 전 배양된 균체를 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) 을 이용하여 상법에 따라 선발균주의 total DNA를 분리하여 TE buffed] 희석 시킨 후 PCR 반응을 하였다. PCR 반응은 총 부피 50 에 genomic DNA 3 11, Taq DNA polymerase (Bioneer, Changwon, Korea) 2.5, 10 X reaction buffer 5 1, deoxy nucleoside triphosphates 2111, TE buffer 32.5 1, 각각의 primer (forward primer 5'-GCC GCG TGA GTG AAT AAG G-3와 reverse primers 5-ACA TGC TCC ACC GCT TGT G-3') 2.5 를 첨가하여 반응하였다. 증폭은 프로그래밍 된 DNA mini cy 이 er (PTC-150, MJ Research, US A) 에서 수행하였다.
- Supernatant의 항균기작 확인을 위해 병원균수의 확인 및 병원균의 형태적 변화를 SEM을 통하여 관찰하였다. 각각 V anguillarum^}- V alginolyticus^: 접종한 BHI broth에 중화시킨 L.
- 형태적 변화를 SEM을 통하여 관찰하였다. 각각 V anguillarum^}- V alginolyticus^: 접종한 BHI broth에 중화시킨 L. sakei BK19 supernatant# 첨가한 후 3 시간 동안 상온에서배양한 후 간계희석법에 의해 생균수를 확인하고, 동시에 원심분리하여(8000Xg, 5 분) pellet을 모은 후 인산 완충액(PBS, pH 7.2) 으로 15 분씩 2 회 세척하였다. 모아진 cell은 2.
- 김치 및 각종 젓갈류는 생리식염수로 단계 희석시켜 사용하였고 양식어류는 장내를 생리식염수로 세척 후 단계 희석시킨 후배양하여 20 여종의 유산균을 분리하였다. 유산균 배양배지로는 1%의 CaCQ를 첨가한 mann, rogosa and sharpe broth 및 agar (MRS, Difco, Detroit, USA)를 사용하였다.
- 병원성 vibrio인 V parahaemolyticus, V tms에 대해서도항균활성이 관찰되었다. 그러나 V alginolyticus, V salmonicida, V harveyii 및 V.
- 유산균 배양배지로는 1%의 CaCQ를 첨가한 mann, rogosa and sharpe broth 및 agar (MRS, Difco, Detroit, USA)를 사용하였다. 분리된 균은 면양 혈청배지에 도말하여 용혈성을 확인하여 비용혈성 유산균을 선택하였다.
- 생화학적 성상은 Api 50CHL (Biomerieux, France) 을 이용하여 상법에 따라 시행하였고 16S rRNA PCR을 통한동정은 전 배양된 균체를 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) 을 이용하여 상법에 따라 선발균주의 total DNA를 분리하여 TE buffed] 희석 시킨 후 PCR 반응을 하였다. PCR 반응은 총 부피 50 에 genomic DNA 3 11, Taq DNA polymerase (Bioneer, Changwon, Korea) 2.
- 후고정을 위해 1 시간 동안 1% osmium tetroxide (OsO4)로 처리한 후 PBS로 다시 세척하였다. 세척된 cell은 50-100% 까지 조절된 에탄올에 침적하여탈수하고 60-100% 까지 조절된 isoamylacetate를 이용하여 치환시키고 critical point dryer (HITACHI, HCP-2, Japan)를 이용하여 CO2 dry를 하고 gold 코팅(HITACHI, E-1010, 10N sputter, Japan)한 후 전자현미경 (HITACHI, S-2460N, Japan)으로 관찰을하였다.
- 유산균에 의한 항균활성은 V anguillarum, E. tarda 및 Streptococcus sp에 대한 길항능을 확인하여 후보균주를 선발하였다. Bacteriocin 유사물질에 의한 항균활성을 갖고 있는 균주를선발하기 위하여 nutrient agar (NA, Difco, Detroit, USA) 배지상에서 spotted method (2, 10)로 검토하였다.
- 5 를 첨가하여 반응하였다. 증폭은 프로그래밍 된 DNA mini cy 이 er (PTC-150, MJ Research, US A) 에서 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 941에서 5 분간 denaturation하고, 30 주기 동안 9*C 4에서 45 초간 denaturation, 50℃에서 45 초 annealing, 72℃에서 45 초간 extension 하여 마지막으로 72℃에서 10 분간 extension을 수행하였다.
- 7% agar)를 BK19가 성장해있는 배지 표면에 중층한 후 앞에서 기술한 바와 같이 저지 환을 확인하였다. 최소억제 농도(minimum inhibition concentra tion, MIC) 측정은 microtitre plate assay를 통하여 확인하였다. 피검균에 따라 200)니의 적정 배양액과 상등액을 2 배 희석법으로 희석, 혼합한 후 피검균을 iNCFU/ml의 농도로 2]니 접종하여 32℃에서 24 시간 배양하면서 시간대별(4, 6, 12, 24 시간) 흡광도를 630 nm에서 확인하였다.
- 최소억제 농도(minimum inhibition concentra tion, MIC) 측정은 microtitre plate assay를 통하여 확인하였다. 피검균에 따라 200)니의 적정 배양액과 상등액을 2 배 희석법으로 희석, 혼합한 후 피검균을 iNCFU/ml의 농도로 2]니 접종하여 32℃에서 24 시간 배양하면서 시간대별(4, 6, 12, 24 시간) 흡광도를 630 nm에서 확인하였다.
- 항균활성이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선발하여 그람염색, 포자유무, 운동성 및 전자현미경 관찰 등 형태학적 특성을확인하였다. 생화학적 성상은 Api 50CHL (Biomerieux, France) 을 이용하여 상법에 따라 시행하였고 16S rRNA PCR을 통한동정은 전 배양된 균체를 QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) 을 이용하여 상법에 따라 선발균주의 total DNA를 분리하여 TE buffed] 희석 시킨 후 PCR 반응을 하였다.
대상 데이터
- 20 여종의 유산균을 분리하였다. 유산균 배양배지로는 1%의 CaCQ를 첨가한 mann, rogosa and sharpe broth 및 agar (MRS, Difco, Detroit, USA)를 사용하였다. 분리된 균은 면양 혈청배지에 도말하여 용혈성을 확인하여 비용혈성 유산균을 선택하였다.
- sakei BK19의 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여 agar spotted method를 이용하였다. 피검균으로는 병원성 세균인 V alginolyticus KCTC 2928, V. mimicus KCTC 2737, V. parahaemolyticus KCTC 2471, V vulnificus KCTC 2962, V. salmonicida KCTC 2726 및 V harveyii KCTC 2717를 1()5 CFU/ml의 농도로 희석시킨 연 한천배지(0.7% agar)를 BK19가 성장해있는 배지 표면에 중층한 후 앞에서 기술한 바와 같이 저지 환을 확인하였다. 최소억제 농도(minimum inhibition concentra tion, MIC) 측정은 microtitre plate assay를 통하여 확인하였다.
이론/모형
- tarda 및 Streptococcus sp에 대한 길항능을 확인하여 후보균주를 선발하였다. Bacteriocin 유사물질에 의한 항균활성을 갖고 있는 균주를선발하기 위하여 nutrient agar (NA, Difco, Detroit, USA) 배지상에서 spotted method (2, 10)로 검토하였다. Agar spotted method는 전 배양된 probiotic 후보균주 5 를 NA 한천배지 표면에 적하시킨 후 3TC에서 24 시간 배양하여 집락이 형성된 표면에 lO^CFU/ml의 피검균이 첨가된 연 한천배지(0.
- L. sakei BK19의 항균 스펙트럼을 확인하기 위하여 agar spotted method를 이용하였다. 피검균으로는 병원성 세균인 V alginolyticus KCTC 2928, V.
성능/효과
- sakei BK19 supematant-^l 항균성 기작은 병원 균수의 확인 및 주사전자현미경(SEM) 관찰을 통하여 관찰하였다. 각각 V anguillarum^ V alginolyticus^: 접종한 BHI broth에 L. sakei BK19 supernatant# 첨가한 후 세균의 형태와 생균수를 확인한 결과(Fig. 4) V anguillarum^ 경우 초기 1X If/CFU/ml에서 3 시간의 supernatant 처리에 의해 그 수가 전멸한 반면, V alginolyticus^ 경우 IXlOWFU/ml 의 균수가 확인되어 V angMamm에 비해 상대적으로 감수성이 낮았다. 형태적 관찰을 통한 항균성 기작은 병원성 세균들의 세포벽이 붕괴됨으로써 항균 활성이 확인되었다(Fig.
- 에 대한 항균활성이 확인되었다. 그러나 본 실험에서 분리된 김치 유산균의 항균활성은 BK1 에서만 V angular 대한 항균활성이 관찰되었고 BK2 및 BK3에서는 항균활성이 관찰되지 않았다. NA배지 상에서 관찰된 저지환은 병원세균에 대한 특이적 항균활성이 확인되었는데 이는 NA배지의 구성 성분이 단백질원 중심으로 되어있고 발효를 위한 탄소원이 결핍되어 유기산을 생산하지 못하기 때문이며 NA배지에서 관찰되는 저지환의 영향은 유기산이 아닌 bacteriocin-like substance에 의한 것이라고 판단된다.
- 상기의 결과를 토대로 항균 스펙트럼이 넓어 probiotic 균주로서 적합한 균을 창란젓에서 분리하여 BK19로 간이 명명하고 동정하였다. 창란젓에서 분리된 BK19 균주는 그람양성, 비 운동성, catalase 음성인 유산균으로서 16S rRNA PCR 증폭을 통한 555 bp의 oligo nucleotides# sequence하여 GeneBank의 database에 있는 Lactobaciillus spp.
- 창란젓에서 분리된 BK19 균주는 그람양성, 비 운동성, catalase 음성인 유산균으로서 16S rRNA PCR 증폭을 통한 555 bp의 oligo nucleotides# sequence하여 GeneBank의 database에 있는 Lactobaciillus spp.와 alignment한 결과(Fig. 2) Lactobacil lus sakei와 100% 유사하여 본 공시균을 Lactobacillus sakei BK19로 명명하였다.
- 5). 특히, V anguillarum의 세포벽은 3 시간의 supernatant 처리에 의해 완전히 붕괴된 반면, V. alginolyticus는 상대적으로 V. angarum에 비해 생균수의 감소도 적었고 세포벽의 붕괴현상이 없는 세균도 관찰되었다.
- 4) V anguillarum^ 경우 초기 1X If/CFU/ml에서 3 시간의 supernatant 처리에 의해 그 수가 전멸한 반면, V alginolyticus^ 경우 IXlOWFU/ml 의 균수가 확인되어 V angMamm에 비해 상대적으로 감수성이 낮았다. 형태적 관찰을 통한 항균성 기작은 병원성 세균들의 세포벽이 붕괴됨으로써 항균 활성이 확인되었다(Fig. 5). 특히, V anguillarum의 세포벽은 3 시간의 supernatant 처리에 의해 완전히 붕괴된 반면, V.
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