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문제 정의
- 그 후 계속된 연구에서 이들 항균성 물질이 직장암 세포주에 강력한 생육저해 효과를 보임에 따라 다양한 암세포주에 대한 항암효과를 비롯하여 항변이원성효과, 기타 각종 생리활성기능을 가진 성분의 규명이 기대되고 있으나, 이전의 연구결과는 분리된 항균성 물질의 안정성에 문제가 야기되었다. 따라서 한국산 도꼬마리 중에 존재하는 모든 성분을 안정하고 효율적인 새로운 정제방법을 확립하여 항균효과 및 변이원성, 항변이원성 등 생리활성 효과를 조사, 확인하여 우수한 항균 및 항암물질을 탐색하여 부가가치가 높은 신규 약제로서 개발하고자 한다. 본 연구에서는 한국산 도꼬마리로부터 추출한 성분이 항균 및 항암효과를 가지는 점과 이들 물질을 다양한 추출법으로 분리 정제한 결과를 보고하고자 한다.
- 따라서 한국산 도꼬마리 중에 존재하는 모든 성분을 안정하고 효율적인 새로운 정제방법을 확립하여 항균효과 및 변이원성, 항변이원성 등 생리활성 효과를 조사, 확인하여 우수한 항균 및 항암물질을 탐색하여 부가가치가 높은 신규 약제로서 개발하고자 한다. 본 연구에서는 한국산 도꼬마리로부터 추출한 성분이 항균 및 항암효과를 가지는 점과 이들 물질을 다양한 추출법으로 분리 정제한 결과를 보고하고자 한다.
- 한편 XE-N-S1과 XE-N-S3 물질은 항암제인 etoposide 보다 높은 독성을 나타내었으며, XE-A-S3 물질은 etoposide 보다는 독성이 높았으나, cisplatin보다는 낮았다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 분리·정제된 물질 중, 항균 및 항암효과가 뚜렷이 있으며 안정성이 있는 XE-N-S1 물질에 대하여현재 구조결정을 수행 중에 있으며, 또한, 항암효과는 뚜렷이있으나 불안정한 물질에 대해서 안정한 형태를 유지할 수 있는 조건을 검토 중에 있다.
- 또한, 녹차를 비롯하여 식품 중에 함유된 성분을 분리하여 항균·항암 및 각종 생리기능 효과에 관한 수많은 연구가 수행되어 있다(1-6). 이와 같은 관점에서 본 연구자는 한국산 도꼬마리로부터 새로운 항균 및 항암효과 등 다양한 생리활성기능이 있는 신규물질의 탐색과 응용을 위한 일환으로서 도꼬마리의 각 부위로부터 추출한 성분이 세균 및 진균류 등에 대한 광범위한 항균효과를 가진다는 사실과 더불어 분자량 386 및 230인 2종류의 항균성 물질을 분리 ' 정제한 결과를 보고하였다(7). 그 후 계속된 연구에서 이들 항균성 물질이 직장암 세포주에 강력한 생육저해 효과를 보임에 따라 다양한 암세포주에 대한 항암효과를 비롯하여 항변이원성효과, 기타 각종 생리활성기능을 가진 성분의 규명이 기대되고 있으나, 이전의 연구결과는 분리된 항균성 물질의 안정성에 문제가 야기되었다.
제안 방법
- Ether 중성 추출물 중, 위에서 분리한 S1 이외의 혼합된 S2와 S3을 분리하기 위하여 먼저 XE-N-S1 을 분리한 후, Rf 치가 0.59 (S2)와 0.39 (S3)를 포함한 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 다음, TLC를 사용하여 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 8.
- FDA 측정은 Chand 등(8)의 방법을 변형하여 사용하였다. 즉, 대수증식기의 시험균 175 J1L와 시료 20 J1L을 (각 시료당 3점씩) 96 well microplate에 넣고 30℃에서 40분간 배양 毛 0.
- 39 (S3)로서 세 개의 sig呀al 이 검출되었다. TLC plate 必ay를 통하여 항균활성이 우수한 signal SI, S2 및 S3을 silica gel column을 이용하여 각각분리하였다. 분리된 S1 을 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column Cis, MeOH : 压0 = 1:1)를 이용하여 분석한 결과, retention time 20.
- 46 (S3)으로서 3 종류의 물질이 검출되었다. TLC분석 결과를 바탕으로 농축액을 silica gel 60 column에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다. 그 결과, XEA-N-S2를 분리하였으며, HPLC (Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil Cis, MeOH : H2O = 6:4)를 이용하여 재 정제한 결과, retention time 14.
- 각 추출물 중 ether 중성 추출물(XE-N)의 항균효과가 가장우수하였으므로 이 획분에 대하여 항균 spectnmm을 조사하였다. 추출물 10 Jig에 대한 항균효과는 Table 2에서 보는 바와같이 그람 양성세균 7균주, 그람 음성세균 7균주를 비롯하여진균 중 병원성 효모인 Cryptococcus 에서도 항균효과를 나타내었다.
- 각 추출물 중 항균효과가 가장 우수한 추출 획분 10 曲에대하여 그람 양성세균 8균주, 그람 음성세균 8균주 및 진균 3균주에 대한 항균 spectmm을 조사하였다.
- 도꼬마리 추출액의 조제는 잎과 열매를 대상으로 시료 300 g를 3~5회 열수 추출하여 evaporator(EYELA Co. Japan)로 농축한 추출액 1 L을 유기용매인 ether 및 ethylacetate를 이용하여 분별 추출하였다. 각 추출물을 중성, 산성 및 알칼리성 조건에서 추출하여 filter paper로 여과한 후, 수지성분 및 유독 성분으로 알려진 불용성의 황색물질인 xanthostrumarin 배당체를 제거하여 항균 및 항암활성의 검사 시료로 사용하였다.
- 이들 signal에 대한 항균활성은 TLC plate assay를 통하여 확인한 결과, 3개의 signal 즉, SI, S2, S3에서 각각 항균활성을 나타내었다. 따라서 이들을 분리하기 위해 TLC분석 결과를 기초로 농축액을 silica gel 60 column에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다. 그 결과 4개의 signal 중 분리가 용이한 XE-A-S3을 단리하였으며, HPLC(Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil Cig, MeOH : 压0 = 6:4)를 이용하여 분석한 결과, retention time 11.
- XE-N의 정제과정과 동일한 방법으로 수행하였다. 먼저 추출 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 후, TLC(SiUca gel 60 F254)로 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, short wave UV lamp (254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.
- 1에서 보는 바와 같이 도꼬마리 300 g(잎 및 열매)를 증류수를 사용하여 3 회 열수 추출하여 감압 농축한 열수 추출액(1 L)을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 분별 추출하고, 각 추출물을 다시 중성, 산성, 염기성의 6개 faction으로 나누어 추출하였다. 무수 NazSQ로 건조한 후, 농축하여 항균 및 항암효과를 검토한 다음, 농축액을 소량의 methanol로 용해시켜 TLC(Silica gel 60 F254)를 사용하여 정성 분석하고 항균활성이 우수한 signal 을 silica gel column을 사용하여 분리하였다. 분리된 물질은 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column Cis) 및 GC/MS 를 통하여 분석하여 정제도와 분자량을 확인하였으며, 정제과정 중의 항균성 물질의 확인은 E.
- TLC plate 必ay를 통하여 항균활성이 우수한 signal SI, S2 및 S3을 silica gel column을 이용하여 각각분리하였다. 분리된 S1 을 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column Cis, MeOH : 压0 = 1:1)를 이용하여 분석한 결과, retention time 20.664분에서 peak가 나타났으나 소량의 혼합물이 공존하므로 Second-HPLC로서 재 정제를 수행하였다. 분취용 Metachem nucleosil (C18)column을 사용하여 MeOH : H2O = 6:4의 용매로서 흡광도 254 nm에서 검출된 peak를분취하였다.
- 따라서 액체배양을 통한 항균효과의 정량분석을 하기 위해 시험균이 생산하는 esterase생산 저해를 지표로 하는 fluorescein diacetate(FDA)법을 사용하였다. 우선 항균효과가 입증된 추출물을 대상으로 FDA 분석조건을 확립하기 위해 XE-N(ether의 중성 주줄물), XEA-N (ethylacetate의 중성 추출물)을 대상으로 항균효과를 분석하였다. Table 3에서 보인 바와 같이 시험균으로서 세균인 E.
- 위암 세포주, 폐암 세포주, 자궁암 세포주, 간암 세포주, 대장암 세포주, 골육종 세포주, 전립선암 세포주, 흑색종 세포주 및 인간 정상피부 섬유아 세포주를 각각 배양하다가 대수증식기에 도달되면, 단계별로 희석된 농도의 추출물 시료를각각의 배양세포에 접종하고 일정시간 배양한 후, 나타나는항종양 효과를 검토하였다. 항종양 효과의 분석방법은 3-(4, 5-dimethyl-2-tetrazolyl)-2, 5~diphenyl-2H tetrazolium bromide (MTT)검사를 하였다.
- 1에서 보인 바와 같이 열수 추출액을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 중성, 산성, 염기성의 6개 fraction으로 나누어 각각 추출하였다. 이 중 항균활성이 가장 강한 ether 중성 추출물을 대상으로생리활성물질의 분리·정제를 수행하였다 농축액을 소량의 methanol로 용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)로 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 아iort wave UV lamp (254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.
- 39 (S3)를 포함한 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 다음, TLC를 사용하여 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 8.5:1.5의 비율로혼합하여 사용하였으며 TLC분석 결과를 참조하여 동일용매 조건 하에서 silica gel column을 사용하여 분리하였다. 분리된 XE-N-S3을 HPLC(Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil Cis, MeOH : H2O = 6:4)를 이용하여 분석한 결과, retention time 10.
- 항종양 효과의 분석방법은 3-(4, 5-dimethyl-2-tetrazolyl)-2, 5~diphenyl-2H tetrazolium bromide (MTT)검사를 하였다. 즉, 대수증식기에 있는 세포 1x10, 개씩을 180 J1L의 배양액에 부유시켜 96 well plate에 분주하고 3 7℃, 5% CO2 incubator에서 하루 동안 배양한 후 단계적으로희석된 추출물 10 此을 첨가하여 24시간 배양하였다. 배양후 5 mg/mL 농도의 MTT 10 此을 첨가하여 4시간 더 배양하고, 상층액 180 此을 제거한 다음 DMSO 150 吐을 첨가하여 rocker에서 20분간 혼들어 준다.
- 항균 및 항암성 물질을 탐색하기 위하여 도꼬마리 열수 추출액을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 중성, 산성, 염기성조건에서 추출한 후, 각각의 추출물을 세균 16균주 및 곰팡이와 효모 2균주를 대상으로 항균활성을 조사하였다. Ether 중성 추출물(XE-N)은 항균효과가 가장 우수하였으며, 특히그람 양성세균(7균주), 그람 음성세균(7균주)을 비롯하여 진균중 Cryptococcus ne晒mans에도 뚜렷한 항균효과를 나타내었다.
- 항균 및 항암성 물질의 분리·정제는 Fig. 1에서 보는 바와 같이 도꼬마리 300 g(잎 및 열매)를 증류수를 사용하여 3 회 열수 추출하여 감압 농축한 열수 추출액(1 L)을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 분별 추출하고, 각 추출물을 다시 중성, 산성, 염기성의 6개 faction으로 나누어 추출하였다. 무수 NazSQ로 건조한 후, 농축하여 항균 및 항암효과를 검토한 다음, 농축액을 소량의 methanol로 용해시켜 TLC(Silica gel 60 F254)를 사용하여 정성 분석하고 항균활성이 우수한 signal 을 silica gel column을 사용하여 분리하였다.
- 항균 및 항암성 물질의 분리·정제는 Fig. 1에서 보인 바와 같이 열수 추출액을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 중성, 산성, 염기성의 6개 fraction으로 나누어 각각 추출하였다. 이 중 항균활성이 가장 강한 ether 중성 추출물을 대상으로생리활성물질의 분리·정제를 수행하였다 농축액을 소량의 methanol로 용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)로 분석하였다.
- 항균 및 항암성 물질의 분리·정제를 위하여 도꼬마리 열수 추출액을 ether 및 ethylacetate를 이용하여 분별 추출하였다. 각각의 추출물을 다시 중성, 산성, 염기성 조건에서 추출한 후, E.
- 항균 및 항암효과가 입증된 한국산 도꼬마리의 ethylacetate 중성 추출물(XEA-N)로부터 항균, 항암성 물질의 분리·정제는 XE-N의 정제과정과 동일한 방법으로 수행하였다. 먼저 추출 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 후, TLC(SiUca gel 60 F254)로 분석하였다.
- )를 올려놓고, 28 ℃ (효모, 곰팡이)와 37 ℃ (세균) 에서 24시간 배양하였다. 항균력 test는 clear zone의 형성 유무로 확인하였으며 50, 100, 150 및 200 Rg의 농도에 따른 항균효과를 검토하였다. 항균성 물질의 확인은 시험균이 함유된 agar plate위에 전개한 TLC plate를 얹고 30분간 방치한 毛 TLC plate를 제거하고, 37 ℃ 에서 agar plate를 24시간 배양하였을 때 spot 부위의 clear zone 형성 유무로서 확인하였다.
- 항균력 test는 clear zone의 형성 유무로 확인하였으며 50, 100, 150 및 200 Rg의 농도에 따른 항균효과를 검토하였다. 항균성 물질의 확인은 시험균이 함유된 agar plate위에 전개한 TLC plate를 얹고 30분간 방치한 毛 TLC plate를 제거하고, 37 ℃ 에서 agar plate를 24시간 배양하였을 때 spot 부위의 clear zone 형성 유무로서 확인하였다.
- 2% FDA (acetone에 용해) 5 J1L을 첨가하여 90분간 배양을계속하였다. 항균효과는 microplate reader(Bio-rad Co. Model 550)를 사용하여 시험균이 생산하는 esterase에 의한 FDA 분해산물인 fluorescein 생성량을 흡광도 490 nm에서 그리고 균생육도는 655 nm에서 측정하였으며, 항균효과는 시료의 첨가및 미첨가의 차이로서 확인하였다.
대상 데이터
- Xanthium strumarium L.(한국명: 도꼬마리)을 2000년 10월 중 채취하여 음건, 세절한 후 사용하였다.
- Japan)로 농축한 추출액 1 L을 유기용매인 ether 및 ethylacetate를 이용하여 분별 추출하였다. 각 추출물을 중성, 산성 및 알칼리성 조건에서 추출하여 filter paper로 여과한 후, 수지성분 및 유독 성분으로 알려진 불용성의 황색물질인 xanthostrumarin 배당체를 제거하여 항균 및 항암활성의 검사 시료로 사용하였다.
- 도꼬마리 추출물의 항균효과를 검토하기 위하여 본 실험에사용한 시험균주는 8종의 그람 양성세균, 8종의 그람 음성세균 및 3종의 진균류를 선정하여 사용하였다.
- D를 측정하여 항암효과를 판정하였으며, 대조군으로 항암제를 녹인 용매를 사용하였다. 또한, 기존에 시판되는 항암제와 항암효과를 비교 ' 검토하기 위하여 etoposide, cisplatin 및 5-flurouracil (5-FU) 등을 사용하였다
- 시험균주의 생육배지는' 세균의 경우 LB agar(tiyptone 10 g/L, NaCl 10 g/L, yeast extract 5 g/L)를 효모류는 Y agar (yeast extract 10 g/L, peptone 20 g/L, glucose 20 g/L) 그리고곰팡이는 YM agar (yeast extract 3 g/L, malt extract 3 g/L, peptone 5 g/L, glucose 10 g/L, pH 5.5)를 사용하였다.
- 위암 세포주(SNU 668), 폐 편평세포암 세포주GO H1703), 폐 선암 세포주3CI H 522), 전립선암 세포주(LN CAP clone), 흑색종 세포주(Clone M3) 및 대장암 세포주(HT29)는 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine이 함유된 RPMI-1640 media를 사용하였고, 자궁암 세포주인 HeLa cell과 간암 세포주인 HepG2 cell 은 10% fetal calf serum, 2 mM glutamine이 함유된 F10 media를 사용하였으며, 골육종 세포주인 Saos2 cell 및 인간 정상피부 섬유아세포(Human Normal Skin Fibroblast) 는 10% fetal calf serum, 2 mM ghitam面ne 이 함유된 DMEM high glucose media를 사용하여 36℃, 5% CCh incubator에서 배양하였다.
- 먼저 추출 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 후, TLC(SiUca gel 60 F254)로 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, short wave UV lamp (254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.73 (SI), 0.61 (S2) 및 0.46 (S3)으로서 3 종류의 물질이 검출되었다. TLC분석 결과를 바탕으로 농축액을 silica gel 60 column에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다.
- 이 중 항균활성이 가장 강한 ether 중성 추출물을 대상으로생리활성물질의 분리·정제를 수행하였다 농축액을 소량의 methanol로 용해시켜 TLC (Silica gel 60 F254)로 분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 9:1의 비율로 혼합하여 사용하였으며, 아iort wave UV lamp (254 nm)로 확인한 결과, Rf치가 0.71 (S1), 0.59 (S2) 및 0.39 (S3)로서 세 개의 sig呀al 이 검출되었다. TLC plate 必ay를 통하여 항균활성이 우수한 signal SI, S2 및 S3을 silica gel column을 이용하여 각각분리하였다.
- 먼저 추출 농축액을 소량의 MeOH로 용해시킨 다음 TLC로분석하였다. 전개용매로는 CH2CI2와 ethylacetate를 각각 9:1의비율로 혼합하여 사용하였으며, short wave UV lamp (254 nm) 로 확인한 결과, Rf치가 0.74 (SI), 0.63 (S2), 0.55 (S3)와 0.38 (S4)로 4 종류의 sign询이 검출되었다. 이들 signal에 대한 항균활성은 TLC plate assay를 통하여 확인한 결과, 3개의 signal 즉, SI, S2, S3에서 각각 항균활성을 나타내었다.
- 항암효과를 검토하기 위하여 도꼬마리 추출물 및 정제된생리활성물질을 DMSO 및 EtOH에 용해하여 사용하였는데, XE-A와 XE-B 및 XEA-A와 XEA-B는 잘 용해되지 않았다. 각종 시료에 대한 암세포 억제농도(MIC)는 Table 4, 5에 나타낸 바와 같이, HeLa 자궁암 세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였고 XE-N-S3도 우수한 효과를 나타내었다.
이론/모형
- 도꼬마리 추출물 중 항균활성의 효과는 지금까지 agar diffusion법을 사용하여 확인하였다. Agar diffusion법은 시료의확산, 배지 중의 성분, 장시간이 요구되는 점 등에서 시료에따라 다소 부정확한 경우도 있다.
- Agar diffusion법은 시료의확산, 배지 중의 성분, 장시간이 요구되는 점 등에서 시료에따라 다소 부정확한 경우도 있다. 따라서 액체배양을 통한 항균효과의 정량분석을 하기 위해 시험균이 생산하는 esterase생산 저해를 지표로 하는 fluorescein diacetate(FDA)법을 사용하였다. 우선 항균효과가 입증된 추출물을 대상으로 FDA 분석조건을 확립하기 위해 XE-N(ether의 중성 주줄물), XEA-N (ethylacetate의 중성 추출물)을 대상으로 항균효과를 분석하였다.
- 무수 NazSQ로 건조한 후, 농축하여 항균 및 항암효과를 검토한 다음, 농축액을 소량의 methanol로 용해시켜 TLC(Silica gel 60 F254)를 사용하여 정성 분석하고 항균활성이 우수한 signal 을 silica gel column을 사용하여 분리하였다. 분리된 물질은 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Shimpak column Cis) 및 GC/MS 를 통하여 분석하여 정제도와 분자량을 확인하였으며, 정제과정 중의 항균성 물질의 확인은 E. coll K-12 및 B. subtilis PCI 219주를 사용하여 agar diffusion법으로 확인하였다.
- 효과를 검토하였다. 항종양 효과의 분석방법은 3-(4, 5-dimethyl-2-tetrazolyl)-2, 5~diphenyl-2H tetrazolium bromide (MTT)검사를 하였다. 즉, 대수증식기에 있는 세포 1x10, 개씩을 180 J1L의 배양액에 부유시켜 96 well plate에 분주하고 3 7℃, 5% CO2 incubator에서 하루 동안 배양한 후 단계적으로희석된 추출물 10 此을 첨가하여 24시간 배양하였다.
성능/효과
- Ether 중성 추출물(XE-N)은 항균효과가 가장 우수하였으며, 특히그람 양성세균(7균주), 그람 음성세균(7균주)을 비롯하여 진균중 Cryptococcus ne晒mans에도 뚜렷한 항균효과를 나타내었다. XE-N 및 XEA-N을 대상으로 FDA method에 의한 항균효과를 검토한 결과, P.
- 각종 시료에 대한 암세포 억제농도(MIC)는 Table 4, 5에 나타낸 바와 같이, HeLa 자궁암 세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였고 XE-N-S3도 우수한 효과를 나타내었다. HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 2종류, XE-N-S1 과 XE-N-S3의 물질, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N 추출물과 XE-N-S1의 물질이 우수하였고, Saos2 골육종암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였지만 XE-N 추출물도 우수하였다. 또한 NCI H522 폐 선암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였고, NCI H1703 폐 편평세포암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였으며, XE-N-S3 물질도 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다.
- 도꼬마리 추출물 및 정제된 생리활성물질에 대한 항암효과를 검토한 결과, HeLa 자궁암 세포에 대해서는 XE-N-SI이 가장 우수하였다. HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S, XE-N-S3가 우수하였고, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N, XE-N-S1 이우수하였다. Saos2 골육종 암세포, NCI H522 폐선 암세포, NCI H1703 폐 편평세포 암세포와 Clone M3 흑색종 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였다.
- 또한 NCI H522 폐 선암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였고, NCI H1703 폐 편평세포암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였으며, XE-N-S3 물질도 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다. LN CAP 전립선 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S3가 가장우수하였고, XE-A-S3, XE-N-S1 물질도 우수한 효과를 나타내었다. Clone M3 흑색종암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수한 물질이었다.
- HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S, XE-N-S3가 우수하였고, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N, XE-N-S1 이우수하였다. Saos2 골육종 암세포, NCI H522 폐선 암세포, NCI H1703 폐 편평세포 암세포와 Clone M3 흑색종 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였다. LN CAP 전립선 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S3가 가장 우수한효과를 나타내었다.
- 우선 항균효과가 입증된 추출물을 대상으로 FDA 분석조건을 확립하기 위해 XE-N(ether의 중성 주줄물), XEA-N (ethylacetate의 중성 추출물)을 대상으로 항균효과를 분석하였다. Table 3에서 보인 바와 같이 시험균으로서 세균인 E. coli, P. aeruginosa, S. aureus 및 효모인 C. albicanse 대상으로 검토한 결과, P. aemginosa를 제외한 3균주에 대해 30 i里/mL에서도 뚜렷한 저해효과를 나타내었다.
- Ether 중성 추출물(XE-N)은 항균효과가 가장 우수하였으며, 특히그람 양성세균(7균주), 그람 음성세균(7균주)을 비롯하여 진균중 Cryptococcus ne晒mans에도 뚜렷한 항균효과를 나타내었다. XE-N 및 XEA-N을 대상으로 FDA method에 의한 항균효과를 검토한 결과, P. aeruginosa를 제외한 3균주에 대해 30 ng/mL 에서도 저해효과를 나타내었다. XE-N 으로부터 XE-N-S1, XE-N-S3을, Ether 산성 추출물(XE-A)로부터 XE-N-S3 을, ethylacetate 중성 추출물(XEA-N)로부터 XEA-N-S2를 항균, 항암성 물질로 정제하였으나, XE-N-S1 을 제외한 다른 물질들은 빠른 시간 내에 모두 분해되었다.
- 각각의 추출물을 다시 중성, 산성, 염기성 조건에서 추출한 후, E. coli 및 B. wbtilis를 대상으로 agar diffusion법으로항균활성을 검토한 결과 ether 및 ethylacetate의 중성 및 산성추출물에서 우수한 항균효과를 나타내었다(결과 미게재). 따라서 이들 추출물을 각각의 농도로 희석하여 항균활성을 검토한 결과, 50 Jig의 농도에서 ethylacetate의 중성 추출물보다 ether의 중성 추출물에서의 항균효과가 우수하였다(Table 1).
- 않았다. 각종 시료에 대한 암세포 억제농도(MIC)는 Table 4, 5에 나타낸 바와 같이, HeLa 자궁암 세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였고 XE-N-S3도 우수한 효과를 나타내었다. HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 2종류, XE-N-S1 과 XE-N-S3의 물질, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N 추출물과 XE-N-S1의 물질이 우수하였고, Saos2 골육종암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였지만 XE-N 추출물도 우수하였다.
- 따라서 이들을 분리하기 위해 TLC분석 결과를 기초로 농축액을 silica gel 60 column에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다. 그 결과 4개의 signal 중 분리가 용이한 XE-A-S3을 단리하였으며, HPLC(Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil Cig, MeOH : 压0 = 6:4)를 이용하여 분석한 결과, retention time 11.222분의 peak가 main으로 정제도가 92%를 보였으며, 8.930분의 peak가 약간 혼합되어 나타났다. 이들 물질을 단리하기 위해 용매조건을 달리하여 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Methachem nucleosil C18, MeOH : HO = 1:1)로 정제하였으나(결과 미게재), XE-N-S3와 마찬가지로 수일 내에 분해되는 것으로 보아 이 물질 또한 상당히 불안정한 것으로 추정되었다.
- TLC분석 결과를 바탕으로 농축액을 silica gel 60 column에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다. 그 결과, XEA-N-S2를 분리하였으며, HPLC (Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil Cis, MeOH : H2O = 6:4)를 이용하여 재 정제한 결과, retention time 14.691 분의 단일 peak임이 확인되었지만, 이 물질 또한 빠른 시간 내에 분해되었다.
- XE-N 으로부터 XE-N-S1, XE-N-S3을, Ether 산성 추출물(XE-A)로부터 XE-N-S3 을, ethylacetate 중성 추출물(XEA-N)로부터 XEA-N-S2를 항균, 항암성 물질로 정제하였으나, XE-N-S1 을 제외한 다른 물질들은 빠른 시간 내에 모두 분해되었다. 도꼬마리 추출물 및 정제된 생리활성물질에 대한 항암효과를 검토한 결과, HeLa 자궁암 세포에 대해서는 XE-N-SI이 가장 우수하였다. HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S, XE-N-S3가 우수하였고, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N, XE-N-S1 이우수하였다.
- wbtilis를 대상으로 agar diffusion법으로항균활성을 검토한 결과 ether 및 ethylacetate의 중성 및 산성추출물에서 우수한 항균효과를 나타내었다(결과 미게재). 따라서 이들 추출물을 각각의 농도로 희석하여 항균활성을 검토한 결과, 50 Jig의 농도에서 ethylacetate의 중성 추출물보다 ether의 중성 추출물에서의 항균효과가 우수하였다(Table 1).
- 실험에 사용한 추출물과 정제품중 XE-A, XE-B, XEA-A 및 XEA-B 추출물은 용매에 잘 녹지 않았기 때문에 실제로 이들에 대한 항암효과는 Table 4, 5에 나타낸 것보다 더 높은 항암효과를 가지고 있을 것으로생각된다. 또한 HSF 인간 정상 피부 섬유아세포에 대한 각종 추출물 및 정제물의 세포독성을 조사하기 위해 기존에 시판되는 항암제 etoposide와 cisplatin을 구입하여 비교 ■ 검토해본 결과, XE-A, XEA-A 및 XEA-B 추출물이 가장 독성이 낮았으며, XE-B 추출물도 etoposide에 비해 상대적으로 독성이낮았다. 한편 XE-N-S1과 XE-N-S3 물질은 항암제인 etoposide 보다 높은 독성을 나타내었으며, XE-A-S3 물질은 etoposide 보다는 독성이 높았으나, cisplatin보다는 낮았다.
- LN CAP 전립선 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S3가 가장 우수한효과를 나타내었다. 또한 HSF 인간 정상 피부 섬유아세포에대한 각종 추출물 및 정제물의 세포독성을 기존의 항암제인 etoposide와 cisplatin과 비교·검토한 결과, XE-A, XEA-A 및 XEA-B가 가장 독성이 낮았으며, XE-B도 etoposide에 비해독성이 낮았다. 한편 XE-N-SI, XE-N-S3은 etoposide보다 높은 독성을 나타내었으며, XE-A-S3은 etoposide보다는 독성이높았으나, cisplatin보다는 낮았다.
- HepG2 간암세포에 대한 항암효과는 2종류, XE-N-S1 과 XE-N-S3의 물질, HT29 대장암세포에 대한 항암효과는 XE-N 추출물과 XE-N-S1의 물질이 우수하였고, Saos2 골육종암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였지만 XE-N 추출물도 우수하였다. 또한 NCI H522 폐 선암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였고, NCI H1703 폐 편평세포암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S1 이 가장 우수하였으며, XE-N-S3 물질도 상대적으로 우수한 효과를 나타내었다. LN CAP 전립선 암세포에 대한 항암효과는 XE-N-S3가 가장우수하였고, XE-A-S3, XE-N-S1 물질도 우수한 효과를 나타내었다.
- 5의 비율로혼합하여 사용하였으며 TLC분석 결과를 참조하여 동일용매 조건 하에서 silica gel column을 사용하여 분리하였다. 분리된 XE-N-S3을 HPLC(Shimadzu LC-10AD, Metachem nucleosil Cis, MeOH : H2O = 6:4)를 이용하여 분석한 결과, retention time 10.735분의 peak가 main으로 정제도는 91%를 보였으며, 8.979분의 peak가 혼합되어 나타났다(결과 미게재). 이들 화합물을 단리하기 위하여 Second-HPLC (Shimadzu LC-10AD, Methachem nucleosil C18, MeOH : H2O = 1:1)를 실시하여 재 정제한 결과, retention time 20.
- 275분의 단일 peak임을 확인하였다. 분리된 화합물의 분자량을 조사하기 위하여 GC/MS로 측정한 결과, 분자량 262인 단일 물질로 확인되었지만, 정제 후 수일 내에 분해되는 것으로보아 상당히 불안정한 물질로 판단되었다.
- 38 (S4)로 4 종류의 sign询이 검출되었다. 이들 signal에 대한 항균활성은 TLC plate assay를 통하여 확인한 결과, 3개의 signal 즉, SI, S2, S3에서 각각 항균활성을 나타내었다. 따라서 이들을 분리하기 위해 TLC분석 결과를 기초로 농축액을 silica gel 60 column에 충진한 후, 위와 동일한 용매를 사용하여 용출하였다.
- 930분의 peak가 약간 혼합되어 나타났다. 이들 물질을 단리하기 위해 용매조건을 달리하여 HPLC (Shimadzu LC-10AD, Methachem nucleosil C18, MeOH : HO = 1:1)로 정제하였으나(결과 미게재), XE-N-S3와 마찬가지로 수일 내에 분해되는 것으로 보아 이 물질 또한 상당히 불안정한 것으로 추정되었다.
- 979분의 peak가 혼합되어 나타났다(결과 미게재). 이들 화합물을 단리하기 위하여 Second-HPLC (Shimadzu LC-10AD, Methachem nucleosil C18, MeOH : H2O = 1:1)를 실시하여 재 정제한 결과, retention time 20.275분의 단일 peak임을 확인하였다. 분리된 화합물의 분자량을 조사하기 위하여 GC/MS로 측정한 결과, 분자량 262인 단일 물질로 확인되었지만, 정제 후 수일 내에 분해되는 것으로보아 상당히 불안정한 물질로 판단되었다.
- )으로 분석한 결과, 순도가 100%로 정제되었음을 알 수 있었다. 정제된 XE-N-S1 을 UV/Visible spectrophotometer(Parmacia Co. Bighrom 4060)를 사용하여 200~900 nm에서 scanning한 결과 Fig. 3에서 보는 바와 같이, 215 nm에서 최대 흡광도를나타내었으며, GC/MS를 통하여 분석한 결과, Fig. 4에서 보는 바와 같이 분자량이 248인 단일물질로 확인되었다
- 또한 HSF 인간 정상 피부 섬유아세포에 대한 각종 추출물 및 정제물의 세포독성을 조사하기 위해 기존에 시판되는 항암제 etoposide와 cisplatin을 구입하여 비교 ■ 검토해본 결과, XE-A, XEA-A 및 XEA-B 추출물이 가장 독성이 낮았으며, XE-B 추출물도 etoposide에 비해 상대적으로 독성이낮았다. 한편 XE-N-S1과 XE-N-S3 물질은 항암제인 etoposide 보다 높은 독성을 나타내었으며, XE-A-S3 물질은 etoposide 보다는 독성이 높았으나, cisplatin보다는 낮았다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 분리·정제된 물질 중, 항균 및 항암효과가 뚜렷이 있으며 안정성이 있는 XE-N-S1 물질에 대하여현재 구조결정을 수행 중에 있으며, 또한, 항암효과는 뚜렷이있으나 불안정한 물질에 대해서 안정한 형태를 유지할 수 있는 조건을 검토 중에 있다.
- 또한 HSF 인간 정상 피부 섬유아세포에대한 각종 추출물 및 정제물의 세포독성을 기존의 항암제인 etoposide와 cisplatin과 비교·검토한 결과, XE-A, XEA-A 및 XEA-B가 가장 독성이 낮았으며, XE-B도 etoposide에 비해독성이 낮았다. 한편 XE-N-SI, XE-N-S3은 etoposide보다 높은 독성을 나타내었으며, XE-A-S3은 etoposide보다는 독성이높았으나, cisplatin보다는 낮았다.
후속연구
- 이와 같은 관점에서 본 연구자는 한국산 도꼬마리로부터 새로운 항균 및 항암효과 등 다양한 생리활성기능이 있는 신규물질의 탐색과 응용을 위한 일환으로서 도꼬마리의 각 부위로부터 추출한 성분이 세균 및 진균류 등에 대한 광범위한 항균효과를 가진다는 사실과 더불어 분자량 386 및 230인 2종류의 항균성 물질을 분리 ' 정제한 결과를 보고하였다(7). 그 후 계속된 연구에서 이들 항균성 물질이 직장암 세포주에 강력한 생육저해 효과를 보임에 따라 다양한 암세포주에 대한 항암효과를 비롯하여 항변이원성효과, 기타 각종 생리활성기능을 가진 성분의 규명이 기대되고 있으나, 이전의 연구결과는 분리된 항균성 물질의 안정성에 문제가 야기되었다. 따라서 한국산 도꼬마리 중에 존재하는 모든 성분을 안정하고 효율적인 새로운 정제방법을 확립하여 항균효과 및 변이원성, 항변이원성 등 생리활성 효과를 조사, 확인하여 우수한 항균 및 항암물질을 탐색하여 부가가치가 높은 신규 약제로서 개발하고자 한다.
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