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문제 정의
- 본 연구에서는 붉은 곰팡이인 Monascus anka KCTC 6121 을 사용하여 적색 색소의 생성을 극대화시키기 위하여 최적 배양조건을 구명하고자 하였다.
가설 설정
- 함유한 백미가 된다. 즉 침지하기 전의 백미 무게보다침 지한 후 의 무게는 약 45% 증가하므로 함수율이 45% 라 가정했다. 최초 45%의 함수율인 백미를 건조시키면서 무게를 측정하여 수분 함유율이 각각 45%, 40%, 30%와 25%인 백미를 증자하여 사용했다.
제안 방법
- 실험 균주를 증자한 백미에 12일 배양한 배양체 20 g을 250 mL 삼각flask에 넣고, 10%에서 90%까지에탄올의 농도별로 각각 100 mL를 첨가한 후, 실온(25"C)에서 2일간 색소를 추출했으며, 추출하면서 6시간마다 1회씩 가볍게 교반하여 추출 효과를 높였다.
- 실험 균주의 적색색소 생성에 미치는 온도의 영향을 검토하기 위하여 증자한 백미에 포자를 접종(2.5xlO6/mL) 하여 80% 배양습도에서 25"C, 30°C 및 37°C로 온도를 각각 달리하여 12 일간 배양하면서 적색 색소 생성 능력을 측정하였다.
- 실험 균주를 PDA배지에 1백금이 접종한 후, 30。0에서 7〜 10일간 배양하였고, 생리적 활성을 유지하기 위하여 2주간격으로 계대 배양하여 4°C에서 보관하여 사용하였다.
- 실험 균주에 의한 적색 색소 생성에 미치는 백미배지의 초기수분 함량의 영향을 검토하기 위하여 , 백미 30으를 250 mL 삼각 flask에 넣고 물 100 mL를 첨가하여 2일간 침지시켜 수분함유율이 각각 45%, 40%, 35%, 30%, 25%인 백미를 증^하여 실험 균주의 포자(2xlO6/mL)를 접종하여 30°C에서 80% 배양 습도에서 12일간 배양하면서 색소 생성 능력을 측정하였다.
- 실험 균주를 배양해야 한다. 실험 균주에 의한 적색 색소생성에 미치는 백미의 침지일 수의 영향을 검토하기 위하여, 백미를 각각 1일에서 4일간 25°C의 물로 8시간마다 교환해 주면서 침지시켰다.
- 실험 균주의 색소 생성에 미치는 배양습도의 영향을 검토하기 위하여, 증자한 백미에 포자를 접종(2.5xiO6/mL) 하여 30°C 에 서 60%, 70%, 80%와 90%의 배양습도에 서 12일간 배 양하면서 적색색소생성 능력을 측정하였다. ’
- 실험 균주의 색소 생성은 침지일수를 다르게 한 30 g의 백미를 증자한 후, 포자의 접종량을 2 x 106/mL로 조절한 포자현 탁액 1 mL를 각각 증자한 백미에 접종하여 습도 80%의 항온항습기에서 30°C에서 12일간 배양한 후 적색 색소의 생성을 측정하였다. 그 결과는 Table 1에 나타난 바와 같이, 1일간 침지한 백미에서는 적색 색소를 거의 얻을 수 없었으며, 2일간 침지한 백미로부터 색소를 가장 많이 얻을 수 있었다.
- 실험 균주의 적색색소 생성에 미치는 접종 포자량의 영향을 검 토하기 위하여 포자의 접종량을 0.5xi06/mL, 1.0xl06/mL, 1.5xlO6/mL, 2.(〕xlO6/mL, 2.5xlO6/mL로 조절한 포자 현탁액 1 mL를 각각 증자한 백미(증자 전 백미 30 g)에 접종한 후, 3O‘’C, 80% 배양습도에서 12일간 배양하면서 적색 색소 생성능력을 측정하였다.
- 즉 침지하기 전의 백미 무게보다침 지한 후 의 무게는 약 45% 증가하므로 함수율이 45% 라 가정했다. 최초 45%의 함수율인 백미를 건조시키면서 무게를 측정하여 수분 함유율이 각각 45%, 40%, 30%와 25%인 백미를 증자하여 사용했다.
대상 데이터
- 색소 생성용 배지로는 백미를 사용했으며, 백미(안 계산, 황토 쌀) 30 g을 250 mL 삼각플라스크에 넣고 물에 침지한 후, 물을 제거하고 121"C에서 15분간 가압멸균하여 증자한 것을 색소 생성측정의 기본고체배지로 사용하였다.
- sp. F-2를 NTG로 처리하여 색소 생성능이 친균주보다 5배 높은 변이주를 선발하였으며, Iliroi 등(18)은 Monascus anka를 NTG로 처리하여 고체 배양에서 적색색소 생성능력이 친 균주에 비해 17.7배와 21.4배의 색소 생성능을 갖는 UN2604 와 UN202-13 변이주를 각각 선발하였으며, Wong과 Koehler (19) 은 자외선으로 돌연변이를 유발시켜 색소 생성능은 높고 항균작용은 약해진 돌연변이 주를 선발하였다.
- 본 실험에 사용된 실험 균주는 붉은 곰팡이인 Monascus anka KCTC 6121는 생명공학 연구소 유전자은행으로부터 분양 받아 사용하였다.
- 실험 균주의 생육 배 지는 potato dextrose agar(PDA)배지 (20% infusion from potato, 2% Bacto dextrose, 1.5% Bacto agar, pH 5.6±0.2, Difco Co., USA)를 사용하였다.
성능/효과
- 그러나 배양 5일 이후부터는 30°C 색소 생성이 급격히 증가하기 시작하면서부터 12일째까지 꾸준히 증가하는 양상을 보이며 가장 많은 색소가 생성되었다. 각각의 온도에서 배양 시간이 경과함에 따라 색소 생성이 증가하였으나, 37°C에서는 25°C와 30"C에 비해 색소 생성 능력이 급격히 감소했다. 이는 액 체배양에 의한 A/ona.
- 그 결과는 Table 1에 나타난 바와 같이, 1일간 침지한 백미에서는 적색 색소를 거의 얻을 수 없었으며, 2일간 침지한 백미로부터 색소를 가장 많이 얻을 수 있었다. 그러나 3일 이상으로 침지한 백미는 색소 생성이 급격히 감소하여 2 일침 지한 백미보다 약 1/4 이상으로 감소했다.
- 색소가 생성되기 시작한 3일째에는 25。0에서 가장 많은 적색 색소가 생성되었다. 그러나 배양 5일 이후부터는 30°C 색소 생성이 급격히 증가하기 시작하면서부터 12일째까지 꾸준히 증가하는 양상을 보이며 가장 많은 색소가 생성되었다. 각각의 온도에서 배양 시간이 경과함에 따라 색소 생성이 증가하였으나, 37°C에서는 25°C와 30"C에 비해 색소 생성 능력이 급격히 감소했다.
- 빛이 완전히 차단된 냉장고인 4"C에서 90일간 저장하여도 실험 균주의 적 색색소색상은 전혀 변화되지 않았다. 그러나 색소 추출액에 직사광선을 30일간 직접 조사하면 54% 정도로 탈색되며, 90일간 조사하면 적색색소가 23% 남아 있어서 실험 균주의 적색색소는 직사광선에도 빛 안정성이 비교적 높음을 나타냈다. 그러나 Monascus anka를 액체배양하여 얻은 색소는 자외선에 대하여 는 비교적 안정 하나 태양광선에 상당한 색도의 저하를 초래하여 내광성이 약한 것이 큰 결점이라고 하여(12), 본인의 연구 결과와는 다른 결과를 나타냈다.
- 백미의 초기 수분함수율이 25%에서 12일간 배양하므로 적색 색소 생성량은 83 을 나타내었다. 그리고 백미의 초기 수분 함수율이 증가하므로 적 색 색소생성은 서서히 감소하여 수분 함수율 45%에서는 적색 색소 생성량이 19를 나타내어 수분 함수율 25%에 비하여 1/5의 값인 20.4%의 색소 생성 능력을 나타내었다. 이상의 결과는 고체 배양법에서 배양 초기의 기질인 백미의 수분함량은 25~30%(w/w)가 양호(22) 하다는 보고와 일치하는 결과를 나타내었다.
- 배양습도 60%와 70%에서는 3일부터 5일째까지는 약간의 색소 생성을 보이다가 5일 이후로는 색소 생성이 서서히 진행되었으나 80%와 90% 배양 습도에서보다 미약함을 볼 수 있다. 배양습도 90%에서는 배양 3일부터 색소생성이 양호하였고, 5일 이후부터 급격히 증가하여 배양 12일째에 최고 값에 도달하여 적색 색소 생성량은 78로 나타났다. 이 값은 60%와 70%의 배양습도에서의 색소생성 보다 거의 100배 이상 증가된 수치였으며, 80%의 배양습도에서 보다 2배 이상의 색소생성능력을 나타내는 값이었다.
- 5xio7mL의 실험 균주의 포자, 배양 온도 3O‘’C, 배양 습도 90%에서 배양 12일째가 가장 양호했다. 생산된 적색 색소의 추출은 80% 에탄올에서 2일간 추출이 가장 양호했으며 2일 이후의 색소 추출은 색소 추출량에 거의 변화가 없음을 알 수 있었다. 실험 균주로부터 추출한 색소의 빛에 대한 안정성 은반 직사광선에서 색소의 색상이 30일간 8% 미만으로 감소하여 햇빛에 대한 안정성은 비교적 높았다.
- 실험 균주가 생산하는 적색색소 생산의 최적 배양조건은 초기 수분함량 25%, 2.5xio7mL의 실험 균주의 포자, 배양 온도 3O‘’C, 배양 습도 90%에서 배양 12일째가 가장 양호했다. 생산된 적색 색소의 추출은 80% 에탄올에서 2일간 추출이 가장 양호했으며 2일 이후의 색소 추출은 색소 추출량에 거의 변화가 없음을 알 수 있었다.
- 실험 균주가 생성한 적 색색소의 추출용 매로서 에탄올을 사용하여 색소추출에 미치는 에탄올 농도의 영향은 Table 2에 나타난 바와 같이, 에탄올 농도 '80%에서 2일째 색 소의 추출이 최대로 나타났으며, 1일째 색소 추출은 2일째 추출의 90.6%가 추출되었으며, 2일간 이상의 추출 시간에서는 거의 추출되지 않았다. 실험 균주의 적 색 색소는 에탄올 70%와 90%에서는 에탄올 80%에서의 추출량에 비하여 약 60%와 83% 추출되었으며, 40% 에탄올에서는 약 30%의 색소만이 추출되었다.
- 생산된 적색 색소의 추출은 80% 에탄올에서 2일간 추출이 가장 양호했으며 2일 이후의 색소 추출은 색소 추출량에 거의 변화가 없음을 알 수 있었다. 실험 균주로부터 추출한 색소의 빛에 대한 안정성 은반 직사광선에서 색소의 색상이 30일간 8% 미만으로 감소하여 햇빛에 대한 안정성은 비교적 높았다.
- 실험 균주의 색소생성 에 미치는 접종 포자량의 영향은 Fig. 2에 나타난 바와 같이, 배양 3일 이후부터 색소생성이 시작되었으며 배양 12일에 적색 색소 생성량이 최고 값에 도달하였다. 접종 포자량은 2.
- 6%가 추출되었으며, 2일간 이상의 추출 시간에서는 거의 추출되지 않았다. 실험 균주의 적 색 색소는 에탄올 70%와 90%에서는 에탄올 80%에서의 추출량에 비하여 약 60%와 83% 추출되었으며, 40% 에탄올에서는 약 30%의 색소만이 추출되었다.
- 실험 균주의 적색색소 생성에 미치는 습도의 영향은 Fig. 4에 나타난 바와 같이, 실험에 사용된 모든 배양습도에서 배양 2일째까지 색소가 거의 생성되지 않았고, 3일째부터 모든 습도 조건에서 색소를 생성하기 시작했다. 배양습도 60%와 70%에서는 3일부터 5일째까지는 약간의 색소 생성을 보이다가 5일 이후로는 색소 생성이 서서히 진행되었으나 80%와 90% 배양 습도에서보다 미약함을 볼 수 있다.
- 실험균주의 적색색소의 빛 안정성은 30일간 반 직사광선에 조사하므로 색소의 색상이 4% 미만으로 감소했음을 볼 수 있었고, 90일째에도 27%의 감소를 나타내어 적 색색소의 색상이 거의 탈색되지 않았음을 보여주고 있다. 빛이 완전히 차단된 냉장고인 4"C에서 90일간 저장하여도 실험 균주의 적 색색소색상은 전혀 변화되지 않았다.
- 배양습도 90%에서는 배양 3일부터 색소생성이 양호하였고, 5일 이후부터 급격히 증가하여 배양 12일째에 최고 값에 도달하여 적색 색소 생성량은 78로 나타났다. 이 값은 60%와 70%의 배양습도에서의 색소생성 보다 거의 100배 이상 증가된 수치였으며, 80%의 배양습도에서 보다 2배 이상의 색소생성능력을 나타내는 값이었다. 이상의 결과로 실험 균주의 색소생 성 에 있어 배양습도의 영향이 매우 크다는 것을 알 수 있었으며, 색소 생성의 최적 배양습도는90% 임을 알 수 있었다.
- 4%의 색소 생성 능력을 나타내었다. 이상의 결과는 고체 배양법에서 배양 초기의 기질인 백미의 수분함량은 25~30%(w/w)가 양호(22) 하다는 보고와 일치하는 결과를 나타내었다.
- 그러나 수분함수율 35%에서는 실험 균주의 배양 백미를 건조 시 켰을 때 표면은 약간의 주름이 생겼고, 40%와 45%의 실험 균주의 배양 백미는 배양하기 전의 백미형태를 잃어버리고 심하게 주름이 잡혔으며 백미끼리 서로 엉겨 붙는 현상까지 나타났다. 이상의 결과로 실험 균주에 의한 색소 생성에 대한 백미 배지의 최적 초기 함수율은 25%임을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로 실험 균주의 색소 생성의 최적 온도는 30°C임을 알 수 있었으며, 액체 배양에서 최적 온도의 범위에서와 같이 고체 배양에서도 그 범위를 벗어나지 않는다는 것을 알‘수 있었다.
- 이 값은 60%와 70%의 배양습도에서의 색소생성 보다 거의 100배 이상 증가된 수치였으며, 80%의 배양습도에서 보다 2배 이상의 색소생성능력을 나타내는 값이었다. 이상의 결과로 실험 균주의 색소생 성 에 있어 배양습도의 영향이 매우 크다는 것을 알 수 있었으며, 색소 생성의 최적 배양습도는90% 임을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로 실험 균주의 적색색소는 80% 에탄올 내에서 햇빛에 대하여 빛 안정성이 비교적 높음을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로 실험 균주의 적색색소의 추출의 최적 에탄올 농도는 80%이며, 1일간 추출이 산업적으로는 양호한 것으로 생각되었다.
- 그러나 3일 이상으로 침지한 백미는 색소 생성이 급격히 감소하여 2 일침 지한 백미보다 약 1/4 이상으로 감소했다. 이상의 결과로부터 백미의 침지는 2일간 침지하는 것이 양호했으며 3일간 침지는 색소생성을 억제시켰다.
- 이상의 결과로부터 실험 균주에 의한 적색 색소 생성은 실험 균주의 접종 포자량에는 영향을 받지 않으므로 최적 접종 포자량은 0.5乂 106/mL 개로 접종하는 것이 양호하다. 그러나 이 실험에서는 2.
- 2에 나타난 바와 같이, 배양 3일 이후부터 색소생성이 시작되었으며 배양 12일에 적색 색소 생성량이 최고 값에 도달하였다. 접종 포자량은 2.5 x 106/mL 개로 접종한 시료에서 적색 색소가 가장 많이 생성되었으며, 실험에 사용된 포자량이 가장 적은 양인 0.5xl07mL 개로 접종한 시료에서도 적색색소 생성량이 52.5으로 2.5xiO6/mL 개로 접종한 시료의 적색색소 생성량에 비 하여 90.5%를 나타내어 접종 포자량에 관계없이 모든 시료에서 적색색소의 생성이 비슷하게 생성되었다. 이는 상업적인 대량 배양이 아닌 실험실 규모에서 소량의 백미배지 에 접종하였기 때문에 배양 초기 3일째에는 포자량의 영향을 받는 듯싶었으나, 배양 일수가 길어짐에 따라 적은 수의 포자량으로같은 수준의 적색 색소를 생성하게 되었다.
- 초기 수분함수율이 다른 백미를 12일간 배양한 각 시료를 60°0의 건 열 건조기에서 하룻밤 건조시켜 실험 균주가 배양된 백미의 형태와 적색 색소량을 관찰한 결과, 백미의 초기 수분함수율 25%와 30%에서는 백미의 형태를 그대로 잘 유지하였다. 그러나 수분함수율 35%에서는 실험 균주의 배양 백미를 건조 시 켰을 때 표면은 약간의 주름이 생겼고, 40%와 45%의 실험 균주의 배양 백미는 배양하기 전의 백미형태를 잃어버리고 심하게 주름이 잡혔으며 백미끼리 서로 엉겨 붙는 현상까지 나타났다.
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