흰점박이꽃무지로부터 Metarhizium속 사상균의 분리 및 ribosomal DNA 염기서열에 의한 동정 Identification of Metarhizium sp. Isolated from Protaetia brevitarsis seulensis (Kolbe) Using Ribosomal DNA Sequence원문보기
곤충자원의 대량사육을 위한 병 발생 예방과 해충의 효과적인 방제를 위하여 흰점박이꽃무지 이병충으로부터 곤충병원 사상균을 분리하였다. 전자현미경 관찰 결과 분리균주 KMA-1은 Metharizium속의 전형적인 쇠사슬형의 분생자를 paliside-like masse에 형성하였다. 따라서, 정확한 동정을 위하여 28S rRNA와 ITS염기 서열을 바탕으로 제작한 특이 프라이머쌍을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 각각의 프라이머쌍을 사용한 PCR반응으로부터 특이 밴드가 검출되었으며 이 증폭 산물들의 염기 서열을 결정, 비교하였다. 분리 균주 KMA-1의 PCR산물인 28S rRNA와 ITS DNA염기서열을 GenBank데이터베이스에 등록된 염기서열 정보와의 상동성을 검색한 결과, 모두 Metarhizium anisopliae와 가장 높은 서열 상동성을 보였다. 이상의 결과로서 본 실험에서 분리 명명된 KMA-1는 M. anisopliae로 동정되었다.
곤충자원의 대량사육을 위한 병 발생 예방과 해충의 효과적인 방제를 위하여 흰점박이꽃무지 이병충으로부터 곤충병원 사상균을 분리하였다. 전자현미경 관찰 결과 분리균주 KMA-1은 Metharizium속의 전형적인 쇠사슬형의 분생자를 paliside-like masse에 형성하였다. 따라서, 정확한 동정을 위하여 28S rRNA와 ITS염기 서열을 바탕으로 제작한 특이 프라이머쌍을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 각각의 프라이머쌍을 사용한 PCR반응으로부터 특이 밴드가 검출되었으며 이 증폭 산물들의 염기 서열을 결정, 비교하였다. 분리 균주 KMA-1의 PCR산물인 28S rRNA와 ITS DNA염기서열을 GenBank데이터베이스에 등록된 염기서열 정보와의 상동성을 검색한 결과, 모두 Metarhizium anisopliae와 가장 높은 서열 상동성을 보였다. 이상의 결과로서 본 실험에서 분리 명명된 KMA-1는 M. anisopliae로 동정되었다.
For the purpose of the protection of beneficial insects from pathogens and the development of control agent against pests, a strain of Metarhizium sp. was isolated from the infected Protaetia brevitarsis seulensis larvae in Korea. Under the scanning electron microscope, the isolate, Metarhizium sp. ...
For the purpose of the protection of beneficial insects from pathogens and the development of control agent against pests, a strain of Metarhizium sp. was isolated from the infected Protaetia brevitarsis seulensis larvae in Korea. Under the scanning electron microscope, the isolate, Metarhizium sp. KMA-1, showed distinct formation of conidia on the palisade-like masse which were comprised of elongate chains and this shape is a typical feature of Metarhizium species. PCR techniques were used to identify the isolate and the primers used were designed on the basis of two kinds of rRNAs sequences, 28S rRNA and internal transcribed spacer(ITS). The specific PCR products from each primer set were amplified and the DNA sequences were determined for the similarity comparison. Sequence alignment of these fragments using GenBank database resulted in the highest homology similarity between the isolate Metarhizium sp. KMA-1 and M. anisopliae. From these results, the isolate Metarhizium sp. KMA-1 in this study was identified as M. anisopliae.
For the purpose of the protection of beneficial insects from pathogens and the development of control agent against pests, a strain of Metarhizium sp. was isolated from the infected Protaetia brevitarsis seulensis larvae in Korea. Under the scanning electron microscope, the isolate, Metarhizium sp. KMA-1, showed distinct formation of conidia on the palisade-like masse which were comprised of elongate chains and this shape is a typical feature of Metarhizium species. PCR techniques were used to identify the isolate and the primers used were designed on the basis of two kinds of rRNAs sequences, 28S rRNA and internal transcribed spacer(ITS). The specific PCR products from each primer set were amplified and the DNA sequences were determined for the similarity comparison. Sequence alignment of these fragments using GenBank database resulted in the highest homology similarity between the isolate Metarhizium sp. KMA-1 and M. anisopliae. From these results, the isolate Metarhizium sp. KMA-1 in this study was identified as M. anisopliae.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 곤충자원의 안정적인 대량 사육을 위한 병 발생 예방 차원뿐만 아니라 해충의 효과적인 방제법 개발을 위한 기초연구로서, 곤충에 강한 병원성을 보이는 Metarhizium속 균주를 흰 점박이 꽃무지 이병충으로부터 분리하고, 분리된 사상균의 분생자를 중심으로 주사 전자현미경으로 그 형태를 관찰하였으며, 또 분자 수준에서의 동정을 위하여 rDNA 염기서열을 이용하여 다른 종과의 상동성을 비교 분석하였다.
제안 방법
자동염기서열은 ABI prism 377 DNA sequencer를 사용하였으며, cycling sequencinge terminater ready reaction mixture 8 []. 1 와 template DNA (500ng/|il), primer 2^1 (3.0pmol), 그리고 증류수를 첨가하여 전체 20 μ1 volume으로 맞춰 PCR에 사용하였다. 염기서열 결정에 사용한 primer는 T7 primer와 SP6 primer이며, 94"C에서 5분간 denaturation하여 1.
용하였으며 template DNA 1 μ 1 (50ng/|il)와 각각의 프라이머는 1 μ1 (50pmol)를 취하여 Premix (한국바이오니아)를 이용하여 증폭하였다. PCR 반응 조건은 initial denaturation stepe 95℃에서 2분, denaturation, annealing 그리고 extension time-c; 각각 95℃에서 30초 61篁에서 30초 72℃에서 1분간 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 (Biometra PCR Thermal Cycler) 종료하였다. ITS region-g- White et al.
SDA + Y 배지에서 14일간 배양한 각균주의 분 생 자를 수거하여, yeast extract가 포함된 Sabouraud Dextrose Broth (Dextrose 2%, Bacto-peptone 1%, Yeast extract 0.2%)의 100 ml 삼각플라스크에 접종한 후 26 ℃, 150rpm에서 7일간 진탕배양하였다. 배양된 균사체는 3, 500rpm에서 20분간 원심분리하여 수거한 뒤 액체질소를 첨가해 마쇄하였다.
강원대학교 자원생물환경학부 곤충분류연구실에서 인공사육 중 이병된 흰점박이꽃무지(Profa爾a brevi- tarsis seulensis (Kolbe)) 유충으로부터 사상균을 분리하기 위하여, 이 병충을 70% 에탄올에 담궈 10초간 표면 소독한 후 멸균 증류수로 3번 씻어낸다. 내부 조직을 잘라내어, yeast extract가 포함된 Sabouraud Dextrose Agar 배지(Dextrose 4%, Bacto-peptone 1%, Yeast extract 0.
강원대학교 자원생물환경학부 곤충분류연구실에서 인공사육 중 이병된 흰점박이꽃무지(Profa爾a brevi- tarsis seulensis (Kolbe)) 유충으로부터 사상균을 분리하기 위하여, 이 병충을 70% 에탄올에 담궈 10초간 표면 소독한 후 멸균 증류수로 3번 씻어낸다. 내부 조직을 잘라내어, yeast extract가 포함된 Sabouraud Dextrose Agar 배지(Dextrose 4%, Bacto-peptone 1%, Yeast extract 0.2%, Agar 1.5%, pH 6.5)에 접종하고 사상균의 성장에 적당한 조건(26℃, 80% R.H.)에서 배양하면서 병원 사상균을 분리하였다.
얻어진 단편의 염기서열을 분석하기 위해 우선 pGEM-T easy vector에 이들 단편을 클로닝하였다. 단편의 삽입 여부는 pGEM-T easy vector의 polycloning site를 두 가지 제한 효소/WI과 Sphl으로 절단하여 3 kb 정도의 Vector와 PCR로 증폭하여 얻어진 단편 크기의 insert로 확인하였다. 얻어진 클론의 염기서열은 ABI prism 377 DNA sequencer# 사용하여 염기서열을 결 정하고(Fig.
배양된 균사체는 3, 500rpm에서 20분간 원심분리하여 수거한 뒤 액체질소를 첨가해 마쇄하였다. 마쇄한 균사체를 25 mg 취하여 Qiamp Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 제조회사의 방법에 따라 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA는 -2(TC에 보관하면서 실험에 사용하였다.
분리된 곰팡이의 주사전자현미경 관찰은 King & Brown (1983)의 방법을 변형하여 사용하였다. 분리된 곰팡이를 두께 2mm의 SDA + Y 배지에서 26±1℃에서 14일간 배양한 후 5x5 mm 크기로 배지와 함께 분리하여 petri-dish 뚜껑(90 X 15 mm)에 접착시키고, 바닥에는 5 ml의 2% OsO4 용액을 넣고 상온에서 2시간 방치하여 훈증 고정을 실시하였다.
2의 주사전자 현미경 관찰에 의한 형태적 특징에 따른 Metarhizium속의 정확한 동정의 어려움과 문제점을 해결하기 위하여, 28S rRNA D3 expansion region의 primer를 사용하여 곤충병원 사상균에 대해 PCR하여 325bp의 단일 밴드를 얻을 수 있었다. 얻어진 단편의 염기서열을 분석하기 위해 우선 pGEM-T easy vector에 이들 단편을 클로닝하였다. 단편의 삽입 여부는 pGEM-T easy vector의 polycloning site를 두 가지 제한 효소/WI과 Sphl으로 절단하여 3 kb 정도의 Vector와 PCR로 증폭하여 얻어진 단편 크기의 insert로 확인하였다.
단편의 삽입 여부는 pGEM-T easy vector의 polycloning site를 두 가지 제한 효소/WI과 Sphl으로 절단하여 3 kb 정도의 Vector와 PCR로 증폭하여 얻어진 단편 크기의 insert로 확인하였다. 얻어진 클론의 염기서열은 ABI prism 377 DNA sequencer# 사용하여 염기서열을 결 정하고(Fig. 3), Blast program-g- 이용하여 GenBank database에 등록되어 있는 기존의 염기서열 정보와의 상동성 검색을 하였다{Table 1). 그 결과 Metarhizium sp.
1). 이병충로부터 분리된 곤충병원 사상균은 SDA+Y 배지에서 콜로니의 형태와 색깔로 1차 screening 하고, 주사전자현미경을 이용하여 분생자와 분생자병의 형태 및 분생자의 부착 형태를 관찰하였다(Fig. 2). 그 결과 꽃무지로부터 분리된 곤충병원 사상균은 Metarhi- ”"如속의 전형적인 특징인 palisade-like masse 위에 분생자가 형성되어 있는 모습을 보였으며, 분 생자병은 약간 길게 신장되어 있으며, 분생자는 9.
25 ng의 PCR 산물, 50 ng의 vector, 3 unit의 T4 DNA ligase, I 山의 10 x buffer 및 증斤수를 혼합하여 전체 부피를 10μ1로 맞춘 후 4℃에서 6시간 반응시킨다. 재조합된 벡터의 형질전환을 위해 2μ1의 반응물과 50 μ1 competent cell (JM 109, Promega Co.)을 혼합하고 얼음에 20분간 둔다으 42℃에서 45-50초간 열 충격을 가하고 세포를 LB배지에서 1시간 동안 진탕배양(200rpm)한 다음 원심분리(12,000rpm, 1 min.)하여 적당량의 LB 에 현탁한 후 ampicillin 이첨가된 LB 고체 배지에도 말하였다 blue/white screening에 의해 선발된 white colony를 배양하여 유전자 단편의 삽입 여부를 확인하였다.
분리된 곰팡이를 두께 2mm의 SDA + Y 배지에서 26±1℃에서 14일간 배양한 후 5x5 mm 크기로 배지와 함께 분리하여 petri-dish 뚜껑(90 X 15 mm)에 접착시키고, 바닥에는 5 ml의 2% OsO4 용액을 넣고 상온에서 2시간 방치하여 훈증 고정을 실시하였다. 탈수 과정은 에탄 올 농도를 20%, 70%, 80% 및 90%에서는 각각 20분, 100%에서는 20분씩 3번 반복하여 탈수한 후, 액체이산화탄소 Critical Point Drying하여 건조시킨 뒤 금으로 coating하여 주사전자현미경(LEO 1420 VP)으로 관찰하였다.
형질전환된 E. coli colonye 취해 ampicillin 이첨가된 50ml의 LB배지에 배양한 후 Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega Co.)를 이용해 plasmid DNA를 분리 ・ 정제하였다. 자동염기서열은 ABI prism 377 DNA sequencer를 사용하였으며, cycling sequencinge terminater ready reaction mixture 8 [].
대상 데이터
0pmol), 그리고 증류수를 첨가하여 전체 20 μ1 volume으로 맞춰 PCR에 사용하였다. 염기서열 결정에 사용한 primer는 T7 primer와 SP6 primer이며, 94"C에서 5분간 denaturation하여 1.5 μ1씩 loading, 7시간 동안 running하여 염기서열을 결정하고 GenBank에 등록하였다(Accession No. AY237118, AY237119). 결정된 염기 서열 분석은 DS Gene software (Accelrys Inc.
PCR 반응 조건은 initial denaturation stepe 95℃에서 2분, denaturation, annealing 그리고 extension time-c; 각각 95℃에서 30초 61篁에서 30초 72℃에서 1분간 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 (Biometra PCR Thermal Cycler) 종료하였다. ITS region-g- White et al. (1990)에 보고된 ITS 1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘)과 ITS 4 (5Z- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')를 사용하였다. PCR 반응 조건은 initial denaturation stepe 95 ℃ 에서 2분, denaturation, annealing 그리고 extension timee 각각 95℃에서 30초, 56℃에서 30초 72℃에서 1분간 35회 반복하고, 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시켜 (Biometra PCR Thermal Cycler) 종료하였다.
흰점박이꽃무지(Pro/aMa brevitarsis seulensis (Kolbe)) 이 병충으로부터 곤충병원 사상균의 분리는 인공사육 중 사상균에 의해 이병된 꽃무지 유충 개체를 70% 에탄올로 표면 살균하고, SDA + Y 배지에서 배양함으로서 분리하였다. 곤충병원 사상균에 감염된 유충의 경우 초기에는 침입부피부에 암갈색의 반점이 생기는데 이는 진피조직 내 층에서의 혈구의 집적이나 체벽 내에서의 멜라닌 형성에 의한 기주 반응의 결과이다.
이론/모형
염기서열 분석 목적으로 사용될 PCR product DNA 는 Gel Extraction kit (Qiagene, German)를 사용하여 제조회사의 방법에 따라 회수하여 pGEM-T easy vector system (Promega Co.)을 이용하여 재조합하였다. 25 ng의 PCR 산물, 50 ng의 vector, 3 unit의 T4 DNA ligase, I 山의 10 x buffer 및 증斤수를 혼합하여 전체 부피를 10μ1로 맞춘 후 4℃에서 6시간 반응시킨다.
성능/효과
2). 그 결과 꽃무지로부터 분리된 곤충병원 사상균은 Metarhi- ”"如속의 전형적인 특징인 palisade-like masse 위에 분생자가 형성되어 있는 모습을 보였으며, 분 생자병은 약간 길게 신장되어 있으며, 분생자는 9.4-11.2gmX 2.5-3.5 jam의 장타원형으로 쇠사슬모양(elongate cha- ins)으로 되어 있었다. 이상의 형태적인 특징은 靑木 裏兒(1989)의 형태적인 특징에 따른 사상균의 분리·동정 방법에서 나타난 Metarhizium속의 전형적인 형태를 보여주었다.
이상의 형태적 특징과 염기서열 상동 성 분석 결과, 국내 흰점박이 꽃무지 이병충으로부터 분리한 KMA-1은 M. anisopliae var. anisopliae으로 동정되며, 딱정벌레목의 해충 방제에 적용이 기대된다.
5 jam의 장타원형으로 쇠사슬모양(elongate cha- ins)으로 되어 있었다. 이상의 형태적인 특징은 靑木 裏兒(1989)의 형태적인 특징에 따른 사상균의 분리·동정 방법에서 나타난 Metarhizium속의 전형적인 형태를 보여주었다.
후속연구
anisopliae으로 동정되며, 딱정벌레목의 해충 방제에 적용이 기대된다. 그리고 본 실험에서 사용한 28S rRNA 유전자는 Rakotonirainy et al. (1994)가 Metarhizium속의 유연관계 분석에 사용하여 그 다양성이 확인된 바가 있는 유전자로서 앞으로 국내 분리Metarhizium속 사상균의 용이한 동정을 위해 유용한 수단이 될 수 있을 것이다
참고문헌 (21)
Anderson, J.B., S.S. Bailey and P.J. Pukkila. 1989. Variation in ribosomal DNA among biological species of Armillasria, a genus of root-infecting fungi. Evolution. 43: 1652-1662
Boucias, D.G. and J.C. Pendland. 1998. Principle of insect pathol-ogy. 537 pp. Kluwer academic publishers, Boston
Cerenius, L., P.O. Thornqvist, A. Vey, M.W. Johansson and K. Soderhall. 1990. The effect of the fungal toxin destruxin E on isolated crayfish haemocytes. J. Insect Physiol. 36: 785-789
Curran, J., F. Driver, J.W.O. Ballard and R.J. Milner. 1994. Phy-logeny of Metarhizium : sequence analysis of the internally transcribed and 5.8s region of the ribosomal DNA repeat. My-cological Research 9: 547-552
Driver, F., R.J. Milner and J.W.H. Trueman. 2000. A taxonomic revision of Metarhizium based on a phylogenetic analysis of rRNA sequence data. Mycol. Res. 104: 134-150
Dumas, C., V. Matha, J.M. Quiot and A. Vey. 1996. Effects of dextruxins, cyclic depsipeptide mycotoxins, on calcium balance and phosphorylation on intracellular proteins in lepidopteran cell lines. Comp. Biochem. Physiol. 114C: 213-219
Glare, T.R., R.J. Milner and C.D. Beaton. 1996. Variation in Metarhizium, a genus of fungal pathogen attacking Orthoptera: Is phialide morphology a useful criterion? J. Orthopteran Res. 5: 19-27
Hanel, H. 1982. The life cycle of the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae in the termite Nasutitermes exitiosus. Mycopathologia. 80: 137-145
Kang, L.J., H.K. Kim, C.K. Chung, S.I. Kim and D.W. Oh. 2000. Effects of Protaetia orientalis (Gory et Perchlon) larva on the lipid metabolism in ethanol administered rats. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 29: 479-484
King, E.J. and M.F. Brown. 1983. A technique for preserving aerial fungal structures for scanning electron microscopy. Can. J. Microbiol. 29: 653-658
Knudsen, G.R.M., D.J. Eschen, L.M. Dandurand and Z.G. Wang. 1991. Method to enhance growth and sporulation of pelletized biological fungi. Appl. Environ. Microbiol. 57: 2864-2867
Leal, S.C.M., D.J. Bertioli, B.V. Ball and T.M. Butt. 1994. Pre-sence of double-stranded RNAs and virus-like particles in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Biocontrol Science and Technology 4: 89-94
Nunn, G.B., B.F. Theisen, B. Christensen and P. Arctander. 1996. Simplicity corrected size growth of the nuclear 28S ribosomal RNA D3 expansion segment in the crustacean order Isopoda. J. Mol. Evol. 42: 211-223
Park, H.Y., S.S. Park, H.W. Oh and J.I. Kim. 1994. General char-acteristics of the white-spotted flower chafer, Protaetia brevi-tarsis reared in the laboratory. Kor. J. Entomol. 24: 1-5
Pipe, N.D., D. Chandler, B.W. Bainbridge and J.B. Heale. 1995. Restriction fragment length polymorphisms in the ribosomal RNA gene complex of isolates of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae. Mycol. Res. 99: 485-491
Rakotonirainy, M.S., M. Dutertre, Y. Brygoo and G. Riba. 1994. Phylogenetic relationships within the genus Metarhizium based on 28S rRNA sequences and isozyme comparisons. Mycol. Res. 98: 225-230
Sosa-Gomez, D.R., D.G. Boucias and J.L. Nation. 1997. Attach-ment of Metarhizium anisopliae to the southern green stink bug Nezara viridula cuticle and fungistatic effect of cuticular lipids and aldehydes. J. Invertebr. Pathol. 69: 31-39
Suh, Y., L.B. Thien, H.E. Reeve and E.A. Zimmer. 1993. Molecu-lar evolution and phylogenetic implications of internal trans-cribed spacer sequences of ribosomal DNA in witeraceae. American J. Botany. 80: 1042-1055
White, T.J., T. Bruns, S. Lee and J. Taylor. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phy-logenies. pp. 315-322. In PCR Protocols: A Guide to Method and Applications. ed. by M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky and T.J. White. 482 pp. Academic Press. New York
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