[논문]길경 수용액 추출물에 의한 인체 폐암세포의 apoptosis 유발에 관한 연구

이성열; 이재훈; 김원일; 배송자; 박동일; 최영현

doi:10.5352/JLS.2003.13.2.154

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길경 수용액 추출물에 의한 인체 폐암세포의 apoptosis 유발에 관한 연구

Apoptotic Cell Death of Human Lung Carcinoma A549 Cells by an Aqueous Extract from the Roots of Platycodon grandiflorum

생명과학회지 = Journal of life science v.13 no.2 = no.57 , 2003년, pp.154 - 162

이성열 (동의대학교 한의과대학 내과학교실 ) ; 이재훈 ( 동의대학교 한의과대학 생화학교실 및 한의학연구소 ) ; 김원일 ( 동의대학교 한의과대학 내과학교실 ) ; 배송자 ( 신라대학교 자연과학대학 식품영양학과 ) ; 박동일 ( 동의대학교 한의과대학 내과학교실 ) ; 최영현 ( 동의대학교 한의과대학 생화학교실 및 한의학연구소)

초록

용어
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전통 한의학에서 많이 사용되는 길경(Platycodi radix)은 도라지(Platycodon grandiflorum A. DC)의 뿌리 껍질을 벗기거나 또는 그대로 말린 것을 말하며, 염증성 호흡기 질환에 많이 사용되어져 오고 있다. 본 연구에서는 길경 수용액 추출물의 항암 활성 기전해석의 일환으로 A549 인체 폐암세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 길경 추출물의 처리에 의하여 처리 농도 의존적으로 암세포의 성장이 억제되었으며, 이는 apoptosis의 유발과 관련이 있었다. 즉 염색체 응축에 의한 apoptotic body의 출현과 sub-Gl기에 속하는 세포의 빈도가 길경 추출물 처리에 의하여 농도 의존적으로 증가하였다. Immunoblot 및 RT-PCR분석에서 길경 추출물의 처리에 의하여 Bcl-2의 mRNA 및 단백질의 발현은 감소되었으며, Bax의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 또한 길경 추출물의 처리에 의하여 caspase-3가 활성화되었으며, 이에 따른 PARP 및 $\beta$-catenin의 단백질 발현 감소 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들은 길경 추출물을 이용한 인체 암세포의 성장억제제의 개발 가능성이 있음을 시사하여 준다.

Abstract

Platycodi Radix, the root of Platycodon grandiflorum, commonly known as Doraji, is used as a traditional oriental medicine. Extracts from the roots of P grandiflorum have been reported to have wide ranging health benefits. In the present study, we investigated the effects of an aqueous extract from the roots of P. grandiflorum (AEPG) on the growth of human lung carcinoma A549 cells. Upon treatment with AEPG, a concentration-dependent inhibition of cell growth was observed and cells developed many of the hallmark features of apoptosis, including condensation of chromatin. Flow cytometry analysis confirmed that AEPG increased populations of apoptotic-sub Gl phase. Immunoblot and quantitative RT-PCR analyses indicated that the expressions of Bcl-2 was down-regulated but Bax was up-regulated in AEPG-treated A549 cells. The expression of active form of caspase-3 by AEPG treatment was markedly increased, and the levels of poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) and $\beta$-catenin, its target proteins, were decreased in a concentration dependent manner. Taken together, these findings suggest that P. grandiflorum has strong potential for development as an agent for prevention against human lung cancer.

주제어

#Platycodon grandiflorum #Lung cancer cells #Apoptosis #Bcl-2 #Bax #Caspase-3

본문요약
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문제 정의

따라서 길경 추출물 처리에 의한 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 apoptosis와 연관성을 가지는 대표적인 유전자 산물들의 발현 변화여부를 조사하였다.

상기의 결과들에서 알 수 있듯이 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 폐암세포의 성장 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 길경 추출물 처리에 의한 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 apoptosis와 연관성을 가지는 대표적인 유전자 산물들의 발현 변화여부를 조사하였다. 그 중 Bcl-2/Bax family의 대표적 유전자인 Bcl・2는 anti-apoptotic 분자로서 apoptosis의 유발을 억제하는 기능을 가지며, Bax는 pro- apoptotic 분자로 apoptosis의 유발과 관계가 있다[1, 4].
따라서 길경의 처리에 의한 upoptosis 유발의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포를 대상으로 핵의 형태적인 변화를 조사하였다.

5%의 암세포가 apoptosis의 과정을 통하여 사 멸되었음을 알 수 있었다. 따라서 길경의 처리에 의한 upoptosis 유발의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포를 대상으로 핵의 형태적인 변화를 조사하였다. Fig.
따라서 븐 연구에서는 길경의 항암작용 해석의 일환으 토 인체 폐암세포의 성장에 미치는 길경 추출물의 영향을 초사하였다.

따라서 븐 연구에서는 길경의 항암작용 해석의 일환으 토 인체 폐암세포의 성장에 미치는 길경 추출물의 영향을 초사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 Bax의 발현 증가 및 0 와 연관돈 Bcl-2의 발현 감소에 의한 caspase-3의 활성화 과정이 길경 수용액 추출물에 의한 apoptosis 유발에 주요한 요인으로 작용함을 알 수 있었다.
따라서 지금까지 알려진 caspase 중 대부분의 apoptosis가 유발된 세포에서 높은 활성도를 보여 주는 caspase-3 (CPP32)의 발현 정도를 서로 다른 농도의 길경 추출믈이 처리된 폐암세포를 대상으로 조사하였다.

한편 ICE/CED-like protease family 인 caspase 는apoptosis 유발 경로에 중요한 조절인자로서 작용하는데 [1, 4, 33], 이들 family에 속하는 많은 단백질들은 세포에서 힘과 mitochondria2] 외막에 존재하며, Bcl-2/Bax family볕-혼의 변화에 따라 이들의 활성화가 조절되는 것으로 알 리고 있다[1, 4, 31]. 따라서 지금까지 알려진 caspase 중 대부분의 apoptosis가 유발된 세포에서 높은 활성도를 보여 주는 caspase-3 (CPP32)의 발현 정도를 서로 다른 농도의 길경 추출믈이 처리된 폐암세포를 대상으로 조사하였다. Caspase-3:7- 활성화된 형태로 관찰되려면 불활성 형태인 32 kDa의 상대적 발현이 줄어들거나 그들의 활성형인 17 또는 19 kDa 분자량을 가지는 활성형의 단백질 발현이 증 7뇌어야한다.
본 연구에서는 길경 수용액 추출물의 항암 활성 기전해석의 일환으로 A549 인체 폐암세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다.

DC)의 뿌리 껍질을 벗기거나 또는 그대로 말린 것을 말하며, 염증성 호흡기 질환에 많이 사용되어져 오고 있다. 본 연구에서는 길경 수용액 추출물의 항암 활성 기전해석의 일환으로 A549 인체 폐암세포의 성장에 미치는 영향을 조사하였다. 길경 추출물의 처리에 의하여 처리 농도 의존적으로 암세포의 성장이 억제되었으며, 이는 apoptosis의 유발과 관련이 있었다.

제안 방법

48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를0.5 mg/㎖ 농도가 되도록 성장배지로 희석하여 3시간 동안 배양한 다음, MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)를 첨가하여 각 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA, 540 nm)를 이용하여 흡광도를 측정 하였다 [10].

A549 폐암세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, 다양한 농도로 희석된 길경 추출물이 함유된 배지로 교체하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를0.5 mg/㎖ 농도가 되도록 성장배지로 희석하여 3시간 동안 배양한 다음, MTT 시약을 제거하고 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)를 첨가하여 각 well에 생성된 formazin을 모두 녹인 후 ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA, 540 nm)를 이용하여 흡광도를 측정 하였다 [10].
A549 폐암세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, 다양한 농도로 희석된 길경 추출물이 함유된 배지로 교체하였다.

A549 폐암세포를 분주하여 24시간 동안 안정화시킨 후, 다양한 농도로 희석된 길경 추출물이 함유된 배지로 교체하였다. 48시간 후 배지를 제거하고 tetrazolium bromide salt (MTT, Sigma Chemical Co.
각 PCR 산물들을 1% agarose g 이을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.

이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 internal control로 사용하였다. 각 PCR 산물들을 1% agarose g 이을 이용하여 전기영동하고 ethidium bromide (EtBr, Sigma)를 이용하여 염색한 후 UV 하에서 확인하였다.
그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PB&T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 ECL (Enhanced ChemiLuminoesence) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL,USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다.

1% Tween 20 in PBS)에 4℃에서 1시간이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 block- ing을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PB&T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 ECL (Enhanced ChemiLuminoesence) 용액 (Amersham Life Science Corp., Arlington Heights, IL,USA)을 적용시킨 다음 X-ray film에 감광시켜 특정 단백질의 양을 분석하였다. 본 실험에 사용된 항체들은 Santa Cruz Biotechnology Inc.
길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변화 관찰을 위하여 길경 추출물이 처리된 세포들을 PBS로 수세하고 3.7% paraformal- dehyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다.

길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 apoptosis 유발 여부를 확인하기 위한 핵의 형태변화 관찰을 위하여 길경 추출물이 처리된 세포들을 PBS로 수세하고 3.7% paraformal- dehyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수 세한 후 fluorescence microscope를 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다[10, 11].
분리된 단백질을 함유한 acrylamide g이을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) 으로 이ectroblotting에 의해 전이시킨 후, 10% skim milk를 함 유한 PB9T (0.1% Tween 20 in PBS)에 4℃에서 1시간이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 block- ing을 실시하였다.

로 용해한 후, 고속원 심분리로 세포 내 잔사물을 분리시킨 후 동량의 단백질을SDS-polyacrylamide gel 전기영동으로 분리한다. 분리된 단백질을 함유한 acrylamide g이을 nitrocellulose membrane (Schleicher and Schuell, Keene, NH, USA) 으로 이ectroblotting에 의해 전이시킨 후, 10% skim milk를 함 유한 PB9T (0.1% Tween 20 in PBS)에 4℃에서 1시간이상 incubation하면서 비특이적인 단백질들에 대한 block- ing을 실시하였다. 그리고 특정 단백질에 대한 항체를 membrane에 적용시켜 항원 항체 반응을 일으킨 후, PB&T로 씻어내고 특정 항체에 대한 이차 항체 반응을 실시한 후 ECL (Enhanced ChemiLuminoesence) 용액 (Amersham Life Science Corp.
암세포의 성장에 미치는 길경 추출물의 영향 A549 인체 폐암세포의 성장에 미치는 길경 수용액 추출물의 영향을 알아보기 위하여 48시간동안 다양한 농도의 길경 추출물을 처리한 후 MTT assay를 이용하여 암세포의 성장억제 효과를 살펴보았다.

암세포의 성장에 미치는 길경 추출물의 영향 A549 인체 폐암세포의 성장에 미치는 길경 수용액 추출물의 영향을 알아보기 위하여 48시간동안 다양한 농도의 길경 추출물을 처리한 후 MTT assay를 이용하여 암세포의 성장억제 효과를 살펴보았다. 길경 추출물이 함유된 배지 게서 자란 암세포는 Fig.
이들 세포를 다시 PBS로 2회 수 세한 후 fluorescence microscope를 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다[10, 11].

7% paraformal- dehyde로 상온에서 10분간 고정시킨 후 형광 염색물질인4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 이들 세포를 다시 PBS로 2회 수 세한 후 fluorescence microscope를 이용하여 핵의 형태 변화를 정상군과 비교하였다[10, 11].
이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후/ nylon mesh 로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose CAZ USA)에 적용시켜 형광 반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson)프로그램으로 분석하였다[9, 1 기.

5% Tween 20)을 첨가하여 4℃에서 고정시킨 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DNA intercalating dye pro- pidium iodide (PI, concentration, 50 /zg/m-E; Sigma) 와 10 kunit의 RNase (Sigma)를 처리하고 4℃ 에서 1 시간동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후/ nylon mesh 로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose CAZ USA)에 적용시켜 형광 반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson)프로그램으로 분석하였다[9, 1 기.
이를 위하여 실험 방법에서 술한 것처럼 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 세포들을 고정한 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 PI로 염색하여 DNA flow cytometry로 분석한 결과는 Fig. 2와 같다.

이상의 길경 추출물에 의한 암세포의 성장 억제 효과가 임세포의 apoptosis 유발과 연관성이 있을 것으로 기대되 거 DNA flow cytometry를 이용하여 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 분석하였다. 이를 위하여 실험 방법에서 술한 것처럼 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 세포들을 고정한 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 PI로 염색하여 DNA flow cytometry로 분석한 결과는 Fig. 2와 같다. 즉 정상 배지에서 자란 암세포의 자연적 apoptosis 유발 현상은 2.
이상과 같은 동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 RNAzol B(TEL-TESTZ INC, Texas, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다.

이상과 같은 동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 RNAzol B(TEL-TESTZ INC, Texas, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, Choi [1 이의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 ㎍의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다.
이상의 길경 추출물에 의한 암세포의 성장 억제 효과가 임세포의 apoptosis 유발과 연관성이 있을 것으로 기대되 거 DNA flow cytometry를 이용하여 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 분석하였다.

이상의 길경 추출물에 의한 암세포의 성장 억제 효과가 임세포의 apoptosis 유발과 연관성이 있을 것으로 기대되 거 DNA flow cytometry를 이용하여 apoptosis 유발의 정도를 정량적으로 분석하였다. 이를 위하여 실험 방법에서 술한 것처럼 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 세포들을 고정한 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 PI로 염색하여 DNA flow cytometry로 분석한 결과는 Fig.
정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 세포들을PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액 (70% ethyl alcohol, 0.5% Tween 20)을 첨가하여 4℃에서 고정시킨 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DNA intercalating dye pro- pidium iodide (PI, concentration, 50 /zg/m-E; Sigma) 와 10 kunit의 RNase (Sigma)를 처리하고 4℃ 에서 1 시간동안 염색하였다.

정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 세포들을PBS로 두세 번 씻어내고, 고정액 (70% ethyl alcohol, 0.5% Tween 20)을 첨가하여 4℃에서 고정시킨 후, 핵산에 특이적으로 결합하는 형광물질인 DNA intercalating dye pro- pidium iodide (PI, concentration, 50 /zg/m-E; Sigma) 와 10 kunit의 RNase (Sigma)를 처리하고 4℃ 에서 1 시간동안 염색하였다. 이를 다시 PBS로 두 번 씻어낸 후/ nylon mesh 로 세포를 하나씩으로 분리시킨 후 DNA flow cytometry (Becton Dickinson, San Jose CAZ USA)에 적용시켜 형광 반응에 따른 histogram을 ModiFit LT (Becton Dickinson)프로그램으로 분석하였다[9, 1 기.

이론/모형

[26]의 방법에 준하여 배양하였다.

본 실험에 사용한 A549 인체 폐암세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) 에서 구입 하였으며 Lee et al.[26]의 방법에 준하여 배양하였다. 길경 은 동의대학교 한의과대학 부속 한방병원에서 공급받았으며 100 g을 1,000 ml의 증류수에 3시간 이상 끓인 후, 3, 000 rpm으로 20분간 원심 분리시켜 침전물을 제거하였다.
분리된 RNA를 정량한 후, Choi [1 이의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 ㎍의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다.

이상과 같은 동일한 조건에서 준비된 암세포를 대상으로 RNAzol B(TEL-TESTZ INC, Texas, USA)을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 정량한 후, Choi [1 이의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 ㎍의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다(Table 1).
이 cDNA를 template로 사용하여 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다(Table 1).

분리된 RNA를 정량한 후, Choi [1 이의 방법에 준하여 oligo dT primer와 AMV reverse transcriptase를 이용하여 2 ㎍의 RNA에서 ss cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 template로 사용하여 Bax, Bcl-2 및 caspase-3 유전자를 polymerase chain reaction (PCR) 방법으로 증폭하였다(Table 1). 이때 housekeeping 유전자인 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 유전자를 포함하여 internal control로 사용하였다.

성능/효과

Fig. 3은 DAPI 염색에 의한 핵의 형태에 미치는 길경 추출물의 영향을 나타낸 결과로서, 길경 추출물이 처리된 배지에서 자란 암세포의 경우 정상배지에서 자란 세포들에서 관찰할 수 없는 apoptosis 유발 특이적인 핵 내 DNA 단편화에 의한 apoptotic body의 출현[2, 1 기이 길경 추출물 처리 농도의 존적으로 증가됨을 알 수 있었다.

따라서 길경의 처리에 의한 upoptosis 유발의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포를 대상으로 핵의 형태적인 변화를 조사하였다. Fig. 3은 DAPI 염색에 의한 핵의 형태에 미치는 길경 추출물의 영향을 나타낸 결과로서, 길경 추출물이 처리된 배지에서 자란 암세포의 경우 정상배지에서 자란 세포들에서 관찰할 수 없는 apoptosis 유발 특이적인 핵 내 DNA 단편화에 의한 apoptotic body의 출현[2, 1 기이 길경 추출물 처리 농도의 존적으로 증가됨을 알 수 있었다. 이상의 결과는 길경 수용액 추출물의 처리에 의한 암세포 성장 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 보여 주는 것으로 사료된다.
Fig. 4A는Western blotting법에 의한 Bax 및 Bcl-2 단백질의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사한 것으로, 결과에서 알 수 있듯이 길경 추출물의 처리 농도가 증가할수록 A549 폐암세포의 Bax 단백질 발현이 증가됨을 알 수 있었으나 Bcl-2 단백질의 경우는 처리 농도 의존적으로 발현이 감소 되었다.

이들은 서로 dimer의 형태로 존재하며 그들의 발현 수준에 변화가 초래되면 apop- tosis가 유발되는 것으로 알려져 있다[1, 25, 31]. Fig. 4A는Western blotting법에 의한 Bax 및 Bcl-2 단백질의 발현에 미치는 길경 추출물의 영향을 조사한 것으로, 결과에서 알 수 있듯이 길경 추출물의 처리 농도가 증가할수록 A549 폐암세포의 Bax 단백질 발현이 증가됨을 알 수 있었으나 Bcl-2 단백질의 경우는 처리 농도 의존적으로 발현이 감소 되었다. 이들 단백질의 발현 변화는 Fig.
Fig. 5A의 결과에서 볼 수 있듯이 길경 추출 둘의 처리에 의하여 caspase-3의 mRNA의 발현에는 큰 영향 없이 불활성형인 pro-caspase-3 단백질의 발현은 길경 추출물 처리 농도 의존적으로 감소되었으나 active- caspase-3의 발현은 상대적으로 증가되어 길경 추출물의 처리에 의한 폐암세포의 apoptosis 유발은 Bcl-2/Bax family의 발현 변화에 의한 caspase-3의 활성화와 관련이 있었음을 알 수 있었다.

Caspase-3:7- 활성화된 형태로 관찰되려면 불활성 형태인 32 kDa의 상대적 발현이 줄어들거나 그들의 활성형인 17 또는 19 kDa 분자량을 가지는 활성형의 단백질 발현이 증 7뇌어야한다. Fig. 5A의 결과에서 볼 수 있듯이 길경 추출 둘의 처리에 의하여 caspase-3의 mRNA의 발현에는 큰 영향 없이 불활성형인 pro-caspase-3 단백질의 발현은 길경 추출물 처리 농도 의존적으로 감소되었으나 active- caspase-3의 발현은 상대적으로 증가되어 길경 추출물의 처리에 의한 폐암세포의 apoptosis 유발은 Bcl-2/Bax family의 발현 변화에 의한 caspase-3의 활성화와 관련이 있었음을 알 수 있었다.
Immunoblot 및 RT-PCR 분석에서 길경 추출물의 처리에 의하여 Bcl-2의 mRNA 및 단백질의 발현은 감소되었으며, Bax의 발현이 증가됨을 알 수 있었다.

즉 염색체 응축에 의한 apoptotic body의 출현과 sub-Gl기에 속하는 세포의 빈도가 길경 추출물 처리에 의하여 농도 의존적으로 증가하였다. Immunoblot 및 RT-PCR 분석에서 길경 추출물의 처리에 의하여 Bcl-2의 mRNA 및 단백질의 발현은 감소되었으며, Bax의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 또한 길경 추출물의 처리에 의하여 caspase-3가 활성화 되었으며, 이에 따른 PARP 및 6-catenin의 단백질 발현 감소 현상을 관찰할 수 있었다.
길경 추출물 처리에 의한 apoptosis가 이러한 세포 유착과 밀접한 관계를 지니는지의 여부를 조사하기 위해서 길경이 함유된 배지에서 자란 세포들의 -catenin 발현을 조사한 결과 Fig. 5B에서처럼 길경 추출물의 처리 농도 증가에 따라 대조군에 비하여 6-catenin의 발현이 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다.

한편 Svatenine 세포 내 골격의 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요하며 세포 유착과 관계된 apoptosis 조절과 연관성을 가지고 있으며 [14, 2이, -catenin 역시 apoptosis가 일어난 세포에서 caspase의 활성에 의하여 분해되는 단백질이다[8, 12, 18]. 길경 추출물 처리에 의한 apoptosis가 이러한 세포 유착과 밀접한 관계를 지니는지의 여부를 조사하기 위해서 길경이 함유된 배지에서 자란 세포들의 -catenin 발현을 조사한 결과 Fig. 5B에서처럼 길경 추출물의 처리 농도 증가에 따라 대조군에 비하여 6-catenin의 발현이 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 실험 과정에서 관찰된 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포의 부착력 상실과 연관성이 있었음을 알 수 있었으나, 이와 연관된 정확한 기전 해석의 보안을 위해서는 관련 cadherin 단백질들과의 상호작용 및 kinase 활성도와 연관된 연구가 요구되어진다.
길경 추출물이 처리된 배지에서 배양된 세포의 경우 본 실험 조건에서 85 kDa 위치에서 발현되는 band는 관찰할 수 없었으나 PARP 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소되었음 을 알 수 있었다.

5B에서 볼 수 있듯이 정상 배지에서 배양된 세포들의 경우 116 kDa 위치에 강한 주 band를 볼 수 있었다. 길경 추출물이 처리된 배지에서 배양된 세포의 경우 본 실험 조건에서 85 kDa 위치에서 발현되는 band는 관찰할 수 없었으나 PARP 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소되었음 을 알 수 있었다. 한편 Svatenine 세포 내 골격의 유지와 다양한 부착성 세포의 전사 조절에 중요하며 세포 유착과 관계된 apoptosis 조절과 연관성을 가지고 있으며 [14, 2이, -catenin 역시 apoptosis가 일어난 세포에서 caspase의 활성에 의하여 분해되는 단백질이다[8, 12, 18].
길경 추출물이 함유된 배지 게서 자란 암세포는 Fig. 1에서 볼 수 있듯이 처리 농도의 존적으로 성장억제의 효과가 뚜렷하게 관찰되었다.

암세포의 성장에 미치는 길경 추출물의 영향 A549 인체 폐암세포의 성장에 미치는 길경 수용액 추출물의 영향을 알아보기 위하여 48시간동안 다양한 농도의 길경 추출물을 처리한 후 MTT assay를 이용하여 암세포의 성장억제 효과를 살펴보았다. 길경 추출물이 함유된 배지 게서 자란 암세포는 Fig. 1에서 볼 수 있듯이 처리 농도의 존적으로 성장억제의 효과가 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 U) tng/ml 이상의 처리 농도군에서는 대조군에 비하여 5C% 이상의 성장억제 현상을 관찰할 수 있었으며, 2.
또한 길경 추출물의 처리에 의하여 caspase-3가 활성화 되었으며, 이에 따른 PARP 및 6-catenin의 단백질 발현 감소 현상을 관찰할 수 있었다.

Immunoblot 및 RT-PCR 분석에서 길경 추출물의 처리에 의하여 Bcl-2의 mRNA 및 단백질의 발현은 감소되었으며, Bax의 발현이 증가됨을 알 수 있었다. 또한 길경 추출물의 처리에 의하여 caspase-3가 활성화 되었으며, 이에 따른 PARP 및 6-catenin의 단백질 발현 감소 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들은 길경 추출물을 이용한 인체 암세포의 성장억제제의 개발 가능성이 있음을 시사하여 준다.
본 연구의 결과에 의하면 Bax의 발현 증가 및 0 와 연관돈 Bcl-2의 발현 감소에 의한 caspase-3의 활성화 과정이 길경 수용액 추출물에 의한 apoptosis 유발에 주요한 요인으로 작용함을 알 수 있었다.

따라서 븐 연구에서는 길경의 항암작용 해석의 일환으 토 인체 폐암세포의 성장에 미치는 길경 추출물의 영향을 초사하였다. 본 연구의 결과에 의하면 Bax의 발현 증가 및 0 와 연관돈 Bcl-2의 발현 감소에 의한 caspase-3의 활성화 과정이 길경 수용액 추출물에 의한 apoptosis 유발에 주요한 요인으로 작용함을 알 수 있었다.
상기의 결과들에서 알 수 있듯이 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 폐암세포의 성장 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다.

상기의 결과들에서 알 수 있듯이 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 폐암세포의 성장 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다. 따라서 길경 추출물 처리에 의한 apoptosis 유발에 관여하는 유전자의 탐색을 위하여 apoptosis와 연관성을 가지는 대표적인 유전자 산물들의 발현 변화여부를 조사하였다.
이를 최근 본 연구실에서 얻은 세포주기 관련 결과와 종합하여 볼 때, Fig. 6과 같이 암세포 성장억제 기전 모식도를 제시할 수 있었다[unpublished data], 즉 선행연구의 결과에 의하면 길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 성장 억제효과는 세포주기 SeG2/M arrest와 연관성이 있었으며, 이는 세포주기 조절 양성 인자인 cyclins 및 Cdks의 발현 억제와 종양 억제 유전자 p53의 발현 증가에 따른 Cdk inhibitor p21 및 p27 발현의 증가 현상을 관찰할 수 있었다.

이상의 결과에서 길경 수용액 추출물에 의한 A549 인체 폐암세포의 성장억제는 apoptosis 유발과 깊은 상관성이 있었으며, 길경 추출물에 의한 폐암세포의 apoptosis 유발에는 Bcl-2 유전자의 발현 감소 및 Bax 유전자 발현의 증가에 의한 caspase-3의 활성화에 의한 것으로 요약될 수 있었다. 이를 최근 본 연구실에서 얻은 세포주기 관련 결과와 종합하여 볼 때, Fig. 6과 같이 암세포 성장억제 기전 모식도를 제시할 수 있었다[unpublished data], 즉 선행연구의 결과에 의하면 길경 추출물의 처리에 의한 암세포의 성장 억제효과는 세포주기 SeG2/M arrest와 연관성이 있었으며, 이는 세포주기 조절 양성 인자인 cyclins 및 Cdks의 발현 억제와 종양 억제 유전자 p53의 발현 증가에 따른 Cdk inhibitor p21 및 p27 발현의 증가 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 특이 유전자들의 발현과 연관된 암세포의 성장 억제는 본 결과에서 제시한 몇 가지 유전자들의 발현 조절을 통하여 apoptosis를 유발시킬 것으로 추측되어진다.
이를 확인 하기 위하여 48시간 동안 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 암세포에서의 PARP 발현을 조사한 결과, Fig. 5B에서 볼 수 있듯이 정상 배지에서 배양된 세포들의 경우 116 kDa 위치에 강한 주 band를 볼 수 있었다.

특히 PARP는 DNA repaii나 genomic stability의 유지에 매우 중요한 역할을 하몌3이, apoptosis의 과정 중 caspase의 활성에 의해 단백질의 분해 가 일어나면 PARP의 효소적 기능의 상실로 인하여 정상적인 DNA repair 과정이 억제되어진다[15, 39]. 이를 확인 하기 위하여 48시간 동안 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 자란 암세포에서의 PARP 발현을 조사한 결과, Fig. 5B에서 볼 수 있듯이 정상 배지에서 배양된 세포들의 경우 116 kDa 위치에 강한 주 band를 볼 수 있었다. 길경 추출물이 처리된 배지에서 배양된 세포의 경우 본 실험 조건에서 85 kDa 위치에서 발현되는 band는 관찰할 수 없었으나 PARP 단백질의 발현이 농도 의존적으로 감소되었음 을 알 수 있었다.
이상의 결과는 길경 수용액 추출물의 처리에 의한 암세포 성장 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 보여 주는 것으로 사료된다.

3은 DAPI 염색에 의한 핵의 형태에 미치는 길경 추출물의 영향을 나타낸 결과로서, 길경 추출물이 처리된 배지에서 자란 암세포의 경우 정상배지에서 자란 세포들에서 관찰할 수 없는 apoptosis 유발 특이적인 핵 내 DNA 단편화에 의한 apoptotic body의 출현[2, 1 기이 길경 추출물 처리 농도의 존적으로 증가됨을 알 수 있었다. 이상의 결과는 길경 수용액 추출물의 처리에 의한 암세포 성장 억제는 apoptosis 유발과 밀접한 연관성이 있음을 보여 주는 것으로 사료된다.
이상의 결과에서 길경 수용액 추출물에 의한 A549 인체 폐암세포의 성장억제는 apoptosis 유발과 깊은 상관성이 있었으며, 길경 추출물에 의한 폐암세포의 apoptosis 유발에는 Bcl-2 유전자의 발현 감소 및 Bax 유전자 발현의 증가에 의한 caspase-3의 활성화에 의한 것으로 요약될 수 있었다.

이상의 결과에서 길경 수용액 추출물에 의한 A549 인체 폐암세포의 성장억제는 apoptosis 유발과 깊은 상관성이 있었으며, 길경 추출물에 의한 폐암세포의 apoptosis 유발에는 Bcl-2 유전자의 발현 감소 및 Bax 유전자 발현의 증가에 의한 caspase-3의 활성화에 의한 것으로 요약될 수 있었다. 이를 최근 본 연구실에서 얻은 세포주기 관련 결과와 종합하여 볼 때, Fig.
즉 정상 배지에서 자란 암세포의 자연적 apoptosis 유발 현상은 2.5% 전후였으나, 길경 추출물의 처리 48시간 후 sub-Gl기에 속하는 세포의 빈도가 급격히 증 가되어 1.2 mg/ml 및 1.6 mg/ml 처리군에서는 각각 약 16.2% 및 23.5%의 암세포가 apoptosis의 과정을 통하여 사 멸되었음을 알 수 있었다.

2와 같다. 즉 정상 배지에서 자란 암세포의 자연적 apoptosis 유발 현상은 2.5% 전후였으나, 길경 추출물의 처리 48시간 후 sub-Gl기에 속하는 세포의 빈도가 급격히 증 가되어 1.2 mg/ml 및 1.6 mg/ml 처리군에서는 각각 약 16.2% 및 23.5%의 암세포가 apoptosis의 과정을 통하여 사 멸되었음을 알 수 있었다. 따라서 길경의 처리에 의한 upoptosis 유발의 직접적인 증거를 제시하기 위하여 정상 및 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포를 대상으로 핵의 형태적인 변화를 조사하였다.
특히 U) tng/ml 이상의 처리 농도군에서는 대조군에 비하여 5C% 이상의 성장억제 현상을 관찰할 수 있었으며, 2.0 ng/ml 처리군에서는 70% 정도의 성장억제 효과가 있었다.

1에서 볼 수 있듯이 처리 농도의 존적으로 성장억제의 효과가 뚜렷하게 관찰되었다. 특히 U) tng/ml 이상의 처리 농도군에서는 대조군에 비하여 5C% 이상의 성장억제 현상을 관찰할 수 있었으며, 2.0 ng/ml 처리군에서는 70% 정도의 성장억제 효과가 있었다. 이러한 암세포의 성장 억제 효과는 길경 추출물의 농도 증가에 따른 암세포의 심한 형태적 변형과도 연관성이 있었는데, 지농도 처리군에서는 전체적으로 세포질이 응축 되면서 짧고 많은 가지를 친 듯한 모양으로 바뀌었으며, >]러한 dendrite-like한 형태가 더욱 신장되면서 고농도 처 킈군에서는 암세포들의 부착력이 상실되었음을 알 수 있었2 (data not shown).

후속연구

그러나 길경 추출물의 정확한 항암 효과의 조사를 위해서는 보다 다양한 세포증식 억제 기전 해석이 추가적으로 실시되어야 하며, 특히 수용액 추출물에서 항암 활성을 가지는 길 경 함유물의 정확한 동정이 뒤따라야 할 것으로 사료된다.

이러한 특이 유전자들의 발현과 연관된 암세포의 성장 억제는 본 결과에서 제시한 몇 가지 유전자들의 발현 조절을 통하여 apoptosis를 유발시킬 것으로 추측되어진다. 그러나 길경 추출물의 정확한 항암 효과의 조사를 위해서는 보다 다양한 세포증식 억제 기전 해석이 추가적으로 실시되어야 하며, 특히 수용액 추출물에서 항암 활성을 가지는 길 경 함유물의 정확한 동정이 뒤따라야 할 것으로 사료된다.
이러한 결과들은 길경 추출물을 이용한 인체 암세포의 성장억제제의 개발 가능성이 있음을 시사하여 준다.

또한 길경 추출물의 처리에 의하여 caspase-3가 활성화 되었으며, 이에 따른 PARP 및 6-catenin의 단백질 발현 감소 현상을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과들은 길경 추출물을 이용한 인체 암세포의 성장억제제의 개발 가능성이 있음을 시사하여 준다.
이러한 현상은 실험 과정에서 관찰된 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포의 부착력 상실과 연관성이 있었음을 알 수 있었으나, 이와 연관된 정확한 기전 해석의 보안을 위해서는 관련 cadherin 단백질들과의 상호작용 및 kinase 활성도와 연관된 연구가 요구되어진다.

5B에서처럼 길경 추출물의 처리 농도 증가에 따라 대조군에 비하여 6-catenin의 발현이 현저하게 감소되었음을 알 수 있었다. 이러한 현상은 실험 과정에서 관찰된 길경 추출물이 함유된 배지에서 배양된 암세포의 부착력 상실과 연관성이 있었음을 알 수 있었으나, 이와 연관된 정확한 기전 해석의 보안을 위해서는 관련 cadherin 단백질들과의 상호작용 및 kinase 활성도와 연관된 연구가 요구되어진다.

저자의 다른 논문

이재훈(1) 배송자(53) 최영현(218)

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길경 수용액 추출물에 의한 인체 폐암세포의 apoptosis 유발에 관한 연구 생명과학회지 = Journal of life science v.13 no.2 = no.57 , 2003년, pp.154 - 162 이성열 (동의대학교 한의과대학 내과학교실 ) ; 이재훈 ( 동의대학교 한의과대학 생화학교실 및 한의학연구소 ) ; 김원일 ( 동의대학교 한의과대학 내과학교실 ) ; 배송자 ( 신라대학교 자연과학대학 식품영양학과 ) ; 박동일 ( 동의대학교 한의과대학 내과학교실 ) ; 최영현 ( 동의대학교 한의과대학 생화학교실 및 한의학연구소)

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