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문제 정의
- 이용하여 비교 실험하였다. 난백에서 lysozyme의 분리, 정제 및 수지의 활용성을 확인하는 실험이었다. 실험결과 Cellufine겔은 5 주기가 지나면서부터 용출분획에서 낮은 농도의 단백질이 용출됨을 확인하였다.
- 본 연구에서는 다중 이온교환크로마토그래피로 리 소 짐을 분리하는 공정개발을 위해 Cellufine CM C-200과 Bio-rex 70 겔을 이용하여 비교 실험하였다. 난백에서 lysozyme의 분리, 정제 및 수지의 활용성을 확인하는 실험이었다.
- 본 연구에서는 이온교환 크로마토그래피를 이용하여 난백에서 lysozyme의 분리, 정제 및 수지의 작동 용이성을 확인함을 통해 다중공정을 개발하는데 목적이 있다. 실험에 사용된 양이온 교환 수지로 Cellufine CM C-200(5)과 Bio-rex 70 겔을 선택하여 수행하였다.
제안 방법
- Cellufine CM C-200겔과 Bio-rex 70겔을 이용하여 난백에서 lysozyme을 분리한 다중 이온교환 크로마토그래피의 결과를 각 주기 별로 크로마토그램을 나타내어 보았고, 또한 lysozyme 용출 분획을 15% SDS-PAGE를 통하여 확인하였다. 먼저, Cellufine 겔을 이용하여 실험한 경우의 크로마토그램과 단백질 분석결과를 고찰하겠다.
- Fig. 1의 실험 절차에 따라 양이온 교환 크로마토그래피는 평형, 시료 주입, 세척, 용리를 반복 정제 1주기로 lysozyme 정제를 수행함으로써 수지의 적합성을 실험하였다. 실험조건은 Table 1과 같다.
- 확인하였다. 먼저, Cellufine 겔을 이용하여 실험한 경우의 크로마토그램과 단백질 분석결과를 고찰하겠다.
- 겔의 counter ion 은 모두 sodium을 사용하였다. 완충용액은 20 mM Na-phosphate(pH 7.0)을 평형 용액으로 하고 여기에 0.5, 1.0 M NaCl을 첨가하여 용리 용액으로 사용하였다.
- Lysozyme을 비롯하여 결합된 단백질은 NaCl 용출용액에 의해 용출되며 흡광도의 값이 0에 가까워지면 NaCl에 의해 용출이 끝난 것이며, 이때 겔의 재생을 위해 겔의 종류에 따라 다른 재생단계를 거치며 다시 정제공정을 반복하게 된다. 용출유속은 L5 畝/min로 하였으며 분획들은 15% SDS-PAGE를 이용하여 lysozyme의 존재를 확인하였다.
- 이온교환 크로마토그래피로 분취한 샘플은 전기영동으로 분석을 하였으며, 단백질 분석조건은 15% SDS-PAGE를 이용하여 확인하였다. Coomassie brilliant blue R-250으로 염색하였다.
대상 데이터
- Lysozyme 분리를 위한 다중 이온교환크로마토그래피 공정에 적용한 또 다른 겔로 Bio-rex 70 겔을 선택하였다. Fig.
- 본 연구에서 이용한 재료로 대표적인 생명공학 제품인 lysozyme효소를 사용하였다. Lysozymee 1922년 Alexander Fleming(7)에 의해 최초로 발견된 용균효소로서, Micrococcus lysodeikticus같은 세균이나 다른 그람 양성 세균과 음성 세균 등을 용균 시키는 특성을 갖는 효소로 처음 보고되었다(8, 9).
- 통해 다중공정을 개발하는데 목적이 있다. 실험에 사용된 양이온 교환 수지로 Cellufine CM C-200(5)과 Bio-rex 70 겔을 선택하여 수행하였다.
- 실험에 사용된 재료는 일반 시장에서 구입한 달걀로 난백과 난황으로 분리한 후 난백만을 모아 증류수로 10배 희석하여, 원심분리기를 8, 000 rpm, 30분간 작동하여 불용성의 물질은 제거하고 상등액을 취하여 주입 시료로 사용하였다.
- 실험에 사용한 칼럼으로 유리칼럼(25 mm ID x 330 mm L, Spectra/chrom Co. USA)을 사용하였고 양이온교환수지로는 Cellufine CM C-200겔과 Bio-rex 70 겔을 이용하였다. Cellufine겔의 작용기는 carboxymethyl group이고, Bio-rex겔의 작용기는 carboxylic acid 이다.
성능/효과
- 그러나 Bio-rex 70겔은 6 주기를 수행 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 용출영 역의 크로마토그램과 전기 영동에서 확인하였다. Bio-rex 겔은 Cellufine겔보다 단백질과 작용기와의 결합력이 우수하였으나 순수한 lysozyme의 정제에 있어서 적당하지 못함을 알 수 있었다. lysozyme의 용출 이온강도가 다른 단백질들보다 더 강하기 때문에 용출용액의 소금 농도구배를 실행함으로써 단백질을 용출한다면 순수한 lysozyme을 정제할 수 있다고 생각된다.
- 또한 Bio-rex 70겔은 Cellufine겔과 달리 6 주기를 수행한 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 결론적으로 lysozyme 단백질을 다중 이온교환 크로마토그래피 공정으로 정제함에 있어 Bio-rex 70겔을 이용하는 것이 Cellufine겔보다 흡착능 측면에서 효과적임을 알 수 있었으며, 순도 증가를 위해서는 용출용액의 농도구배를 이용할 것이 필요하다고 생각된다.
- 탈착 작용을 하고 있지 못하기 때문에 용출영역의 peak가 계속해서 낮아지는 경향을 보였다. 그러나 Bio-rex 70겔은 6 주기를 수행 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 용출영 역의 크로마토그램과 전기 영동에서 확인하였다. Bio-rex 겔은 Cellufine겔보다 단백질과 작용기와의 결합력이 우수하였으나 순수한 lysozyme의 정제에 있어서 적당하지 못함을 알 수 있었다.
- 이는 겔이 여러 단백질들과 강하게 결합하고 있으므로 용출용액에 의해 약하게 결합된 단백질이 먼저 용출되어 나오고 그 후에 NaOH로 재생하는 과정에서 강하게 결합된 단백질들과 발색단을 가지고 있는 오염물질들이 함께 용출되어 나오면서 재생단계에서도 여러 peak가 나타나는 것이다. 따라서 Bio-rex 70 겔을 이용하여 순수한 lysozyme을 정제하기 위해서는 용출용액의 농도구배를 주어서 이온강도에 따라 결합력이 약한 오염 단백질을 먼저 저농도의 용출용액에서 용출시킨 후, 고농도의 용출용액에서 lysozyme단백질을 용출시킨다면 보다 lysozyme을 효과적으로 정제할 수 있음을 시사한다. 또한 Bio-rex 70겔은 Cellufine겔과 달리 6 주기를 수행한 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 확인할 수 있었다.
- 이는 겔이 더 이상 lysozyme을 선택적으로 흡착하는 능력을 상실한 것으로 볼 수 있으며 겔에 붙어있던 lysozyme이 주기가 진행될수록 보다 더 강하게 붙어있어 lysozyme이 용출용액에 의해 늦게 용출되거나 강한 NaOH 재생용액에서 용출되기 때문이다. 따라서 Cellufine CM-C 200겔에서 5 주기까지 다중공정을 조업하는 것이 효과적임을 알 수 있었다.
- lysozyme의 용출 이온강도가 다른 단백질들보다 더 강하기 때문에 용출용액의 소금 농도구배를 실행함으로써 단백질을 용출한다면 순수한 lysozyme을 정제할 수 있다고 생각된다. 따라서 본 실험결과 다중 이온교환 크로마토그래피 공정에 효과적인 겔은 Bio-rex 70겔임을 알 수 있었다.
- 따라서 Bio-rex 70 겔을 이용하여 순수한 lysozyme을 정제하기 위해서는 용출용액의 농도구배를 주어서 이온강도에 따라 결합력이 약한 오염 단백질을 먼저 저농도의 용출용액에서 용출시킨 후, 고농도의 용출용액에서 lysozyme단백질을 용출시킨다면 보다 lysozyme을 효과적으로 정제할 수 있음을 시사한다. 또한 Bio-rex 70겔은 Cellufine겔과 달리 6 주기를 수행한 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 결론적으로 lysozyme 단백질을 다중 이온교환 크로마토그래피 공정으로 정제함에 있어 Bio-rex 70겔을 이용하는 것이 Cellufine겔보다 흡착능 측면에서 효과적임을 알 수 있었으며, 순도 증가를 위해서는 용출용액의 농도구배를 이용할 것이 필요하다고 생각된다.
- 4는 7주기를 수행한 크로마토그램을 보여주고 있으며, 샘플주입 후 breakthrough curve 는 안정되게 나타내고 있으나, 용출 영역에서 아주 낮은 voltage값을 보이며 용출 peak가 아주 작게 나타나고 있음을 볼 수 있다. 또한 겔의 NaOH washing단계에서 비교적 높은 peak를 보이고 있는데, 이는 색을 가진 저분자 오염물질들과 용출용액에 의해 탈착되지 않고 겔에 강하게 결합되어있는 lysozyme이 함께 용출되고 있음을 SDS-PAGE를 통해 확인할 수 있었다. 8 주기에서도 7 주기와 비슷한 경향을 보이고 있음을 확인할 수 있었고, 또한 샘플주입 후 breakthrough curve는 안정되게 나타나지만 용출 peak가 작게 나타나며 단백질 정제가 효과적이지 않은 이유는 겔의 흡착과 분리 능력이 저하되기 때문으로 생각된다 .
- 3은 5 주기의 크로마토그램을 보여주고 있으며, 용출이 끝난 후 NaOH로 washing하는 과정에서 다시 peak가 약간 올라가고 있음을 확인할 수 있는데 이는 SDS-PAGE 상에서는 확인되지 않았지만 단백질이 용출된 후 겔에 남아있던 저분자 오염물질이 용출되고 있는 것으로 생각된다. 또한 용출 peak부분의 분획을 SDS-PAGE에서 분석한 결과 단백질이 잘 용출되고 있음을 알 수 있었으나 용출 단백질의 농도가 점차 낮아지고 있음을 볼 수 있다. 6주기의 실험은 샘플을 주입하는 과정에서 겔에 기포가 들어가며 금이 갔기 때문에 실험 결과에서 제외시켰다.
- 이는 주기가 진행될 수록 겔의 흡착능력이 약화됨을 보여주는 것이다. 또한 주기가 진행될수록 각 주기의 크로마토그램을 분석한 결과, 단백질이 겔의 작용기와 효과적으로 흡 . 탈착 작용을 하고 있지 못하기 때문에 용출영역의 peak가 계속해서 낮아지는 경향을 보였다.
- 2는 Cellufine CM C-200겔을 이용하여 1 주기를 실험한 결과를 보여주고 있다. 샘플주입 후 시료 단백질이 수지의 작용기에 빠르게 흡착되며 breakthrough curve를 보이고있으며, 용출 용액에 의해 겔에 흡착된 단백질이 단일 peak 로 분리되어 나옴을 알 수 있었다. 용출 peak를 SDS-PAGE 로 분석한 결과 높은 농도의 lysozyme과 미량의 ovalbumin이 정제되어 나옴을 확인할 수 있었다.
- 난백에서 lysozyme의 분리, 정제 및 수지의 활용성을 확인하는 실험이었다. 실험결과 Cellufine겔은 5 주기가 지나면서부터 용출분획에서 낮은 농도의 단백질이 용출됨을 확인하였다. 이는 주기가 진행될 수록 겔의 흡착능력이 약화됨을 보여주는 것이다.
- 샘플주입 후 시료 단백질이 수지의 작용기에 빠르게 흡착되며 breakthrough curve를 보이고있으며, 용출 용액에 의해 겔에 흡착된 단백질이 단일 peak 로 분리되어 나옴을 알 수 있었다. 용출 peak를 SDS-PAGE 로 분석한 결과 높은 농도의 lysozyme과 미량의 ovalbumin이 정제되어 나옴을 확인할 수 있었다. 2, 3, 4 주기에서도 1 주기와 비슷한 경향을 보이고 있음을 확인할 수 있었다.
- 샘플 주입 후 breakthrough curve를 Cellufine겔과 비슷하게 보이고 있으나 용출 peak의 voltage 값은 5까지 올라감을 볼 수 있었다. 이는 Bio-rex 70겔이 lysozyme을 선택적으로 흡착하지 않고 여러 단백질을 비선택적으로 강하게 결합하고 있다가 용출용액 주입 시에 단백질들을 선택성 없이 용출함을 의미하며 이를 전기영동으로 확인하였다. 2 주기의 실험에서는 겔에 흡착된 단백질을 용출용액으로 용출하는 과정에서 기포가 겔에 들어가며 용출용액이 칼럼의 한쪽 부분으로 치우쳐 흐르며 단백질의 용출 peak가 단일 peak로 나타나지 않음을 알 수 있었고, 따라서 2 주기의 실험은 실험결과에서 제외시켰다.
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