선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 CYP2B유전자의 발현이 일어나 지 않는 콩팥세포[19]에서 유래한 COS cell line을 이용하여, CAR 단백질을 일시적으로 발현시켰을 때 CYP2B1PBRU의 활성촉진에 영향을 미치는지의 여부를 조사하고자 하였다.
- 이러한 세포간 특이성을 이용하여 유전자 발현에 관여하는 인 자들을 규명하는데 기초적 자료로 이용될 수 있다. 따라서 본 연구의 목적은 CYP2B유전자의 발현이 일어나지 않는 콩팥세포 line (COS) 에서 CAR 단백질 수용체가 PBRU의 활성촉진에 영향을 미치는지의 여부를 조사하고자 하였다. Control 상태의 Hep G2와 COS 배양세포에서는 CAR 단 백질의 발현이 거의 나타나지 않았다.
제안 방법
- CAR-GFP의 발현을 위한 expression vector, pECARCl- GFP는 pCDNA3.CAR로부터 분리된 BamHl/EcoRl 제한 효소 조각을 pEGFP-Cl (BD Biosciences CLONTECH) vector의 Bglll/EcoRl site에 융합하여 합성하였다. 포유동 물에서 발현할 수 있는 RXR (Retinoic Acid Receptor) plas- mid인 pCMX-RXR는 B.
- Constitutive Androstane Receptor (CAR) 에 의한 CYP2B의 PBRU 활성효과를 다르게 분화된 세포에서 차이가 일 어나는지를 비교하기 위하여 CAR에 의해 매개되는 PBRU 의 transactivation효과를 Hep G2와 COS 세포에서 조사 하였다. 각각의 세포를 CAR expression vector와 단일 copy 의 CYP2B1PBRU 가 minimal CYP2C1 promotor/ firefly luciferase 보고유전자와 fusion된 reporter plasmid로 cotransfection을 하였다.
- Constitutive Androstane Receptor (CAR) 에 의한 CYP2B의 PBRU 활성효과를 다르게 분화된 세포에서 차이가 일 어나는지를 비교하기 위하여 CAR에 의해 매개되는 PBRU 의 transactivation효과를 Hep G2와 COS 세포에서 조사 하였다. 각각의 세포를 CAR expression vector와 단일 copy 의 CYP2B1PBRU 가 minimal CYP2C1 promotor/ firefly luciferase 보고유전자와 fusion된 reporter plasmid로 cotransfection을 하였다.
- Human HepG2 혹은 COS 세포를 10% charcoal- dextran-stripped fetal calf serum, 100 units/ml penicillin 과 0.01% streptomycin을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 에서 배양하였다. Transfection을 위해서, 24-well의 세포배양 plate에 90%의 Confluency로 각각의 세포를 접종한 다음 항생제가 없는 DMEM에서 18 시간동안 배양하였다.
- Transfection을 위해서, 24-well의 세포배양 plate에 90%의 Confluency로 각각의 세포를 접종한 다음 항생제가 없는 DMEM에서 18 시간동안 배양하였다. LipofectAMINE 방법을[21] 이용하여 1 ug/well의 CYP2B1 PERU cis-acting element를 minimum pmmotor 인 CYP2C1 Promoter 와 firefly luciferase 보고유전자에 융합한 보고 유전자 Plasmid (PBRU2ClLuc)z 10 ng/well의 SV40 promoter와 Renilla luciferase 유전자 를 함유한 pRL-SV40 plasmid, 그리고 다양한 양의 CAR 발현유전자 pCDNA3CARl을 각각의 well에 첨가시켰다. PBRU를 제외한 1 나g/well의 2ClLuciferase 보고유전자를 대조 군으로 사용하였다.
- Transfection 후 각각의 세포를 36시간동안 incubation한 다음 dual luciferase 보고유전자 분석 방법(Promega Biotech)에 의해 luciferase의 활성을 측정하였다. Transfection 효율성의 차이에 의해 발생될 수 있는 변이를 최소화하기 위해 각각의 Sample에 대한 firefly luciferase의 활성을 동등한 Renilla luciferase의 활성과 비교하여 표준화시켰다.
- Constitutive Androstane Receptor (CAR) 에 의한 CYP2B의 PBRU 활성효과를 다르게 분화된 세포에서 차이가 일 어나는지를 비교하기 위하여 CAR에 의해 매개되는 PBRU 의 transactivation효과를 Hep G2와 COS 세포에서 조사 하였다. 각각의 세포를 CAR expression vector와 단일 copy 의 CYP2B1PBRU 가 minimal CYP2C1 promotor/ firefly luciferase 보고유전자와 fusion된 reporter plasmid로 cotransfection을 하였다. 이전에 보고된 결과와 일치하 게 Hep G2 세포에서는 transfection된 CAR의 발현에 의해 firefly luciferase 보고단백질의 활성이 약 12배 증가하였다 (Fig.
- CAR 단백질은 세포 핵 내에서 PBRU의 NR과 결합하여 유전자의 발현을 조절하기 위해서는 RXR과 이량체를 형성 해야 하기 때문에 RXR의 발현이 일어나야 한다. 따라서 Hep G2와 COS 세포에서 transfection 전후의 RXR 단백질 의 발현을 western immunoblot에 의해 조사하였다. Fig.
- 박테리아 내에서 FLAG-tagged RXR을 발현하기 위하여 pf:RXR vector 를 사용하였다. 박테리아 내 단백질의 발현을 위하여, 1/20 volume의 overnight Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 배양 액을 1 L의 LB broth에 접종시켜 37℃에서 약 1시간 0.6) 동안 배양한 후 1 mM isopropyl-/9-D-thioglucopyranoside(IPTG)에 의해 발현을 유도시키고 37℃에서 4시간 동안 배 양하였다. 증식된 Bacteria를 원심분리에 의해 침전시킨 다음 CAR pellet아에 대해서는 20 I이의 Ni-NTA equilibrium buffer (20 mM Tris-HCl, pH.
- 박테리아 세포 내에서 N-terminus에 His-tag이 융합된 CAR의 다량의 발현과 분리를 위해서 CAR2 cDNA를 BmHl과 EcoRl으로 자른 다음 pET28a+ vector (Novagen Corp)에 주입한 후 pETCAR2를 합성하였다. 박테리아 내에서 FLAG-tagged RXR을 발현하기 위하여 pf:RXR vector 를 사용하였다.
- 5% SDS~Polyacryl- amide에서 전기영동 하였다. 분리된 단백질을 Nitrocellulose membrane에 transfer한 다음 rabbit anti-CAR serum (1:1000), mouse anti-GFP Ab (1:5000), 혹은 rabbit anti-RXR IgG (1:2000)을 30분간 상온에서 incubation하고, horse radish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (CAR와 RXR) 또는 HRP-rabbit anti-mouse IgG (GFP) 와 20분간 상온에서 incubation 하여 ECL (Enhanced Chemiluminescence) detection System (Amersham Life Science Corp., Arlington Hechts, IL, U.S.A.) 에 의해 immuno- fluorescent 영상을 실시하였다.
- 생쥐의 간 cDNA Library로부터 Polymerase 연속반응에 의해서 생쥐 CAR1과 CAR2 cDNA를 분리한 다음 염기서 열 분석에 의해 CAR1과 CAR2단백질의 codon 염기서열임 을 확인하였다. 포유동물 세포 내에서의 CAR의 발현을 위 층)]서, pGEX2TK-mCARl으로부터 BamHI 과 EcoRl으로 분 리된 CAR1 cDNA를 동일한 제한 효소들로 자른 pCDNA3 (InvitTogen)에 결합시켜 pCDNA3-CARl을 합성하였다.
- 그 후 10% Fetal Bovine Serum이 함유된 DMEM에서 다시 36시간동안 배양하였다. 세포 내 발현된 단백질을 추출하기 위하여 배양세포를 PBS로 wash한 다음 hypotonic buffer에서 vortex하여 원형질막을 파괴하고 추출된 세포전체 단백질 sample을 8.5% SDS~Polyacryl- amide에서 전기영동 하였다. 분리된 단백질을 Nitrocellulose membrane에 transfer한 다음 rabbit anti-CAR serum (1:1000), mouse anti-GFP Ab (1:5000), 혹은 rabbit anti-RXR IgG (1:2000)을 30분간 상온에서 incubation하고, horse radish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (CAR와 RXR) 또는 HRP-rabbit anti-mouse IgG (GFP) 와 20분간 상온에서 incubation 하여 ECL (Enhanced Chemiluminescence) detection System (Amersham Life Science Corp.
- 생쥐의 간 cDNA Library로부터 Polymerase 연속반응에 의해서 생쥐 CAR1과 CAR2 cDNA를 분리한 다음 염기서 열 분석에 의해 CAR1과 CAR2단백질의 codon 염기서열임 을 확인하였다. 포유동물 세포 내에서의 CAR의 발현을 위 층)]서, pGEX2TK-mCARl으로부터 BamHI 과 EcoRl으로 분 리된 CAR1 cDNA를 동일한 제한 효소들로 자른 pCDNA3 (InvitTogen)에 결합시켜 pCDNA3-CARl을 합성하였다. CAR-GFP의 발현을 위한 expression vector, pECARCl- GFP는 pCDNA3.
대상 데이터
- CAR로부터 분리된 BamHl/EcoRl 제한 효소 조각을 pEGFP-Cl (BD Biosciences CLONTECH) vector의 Bglll/EcoRl site에 융합하여 합성하였다. 포유동 물에서 발현할 수 있는 RXR (Retinoic Acid Receptor) plas- mid인 pCMX-RXR는 B. Kemper로부터 제공받았고, 보고 유전;자" plasmid인 PBRU2C1-Luc와 2CLLuc는 이전에[18] 보고된 방법을 이용하였다.
- CAR에 대한 항혈청 (rabbit anti-mCAR2 immunme serum)은 B. Kemper로부터 제공받았고, RXR에 대한 항혈 청 (rabbit anti-human RXR a immune serum) 과 GFP 에 대한 항혈청 (mouse anti-GFP immune serum)은 Santa Cruz Biotechnology (CA. U.S.A.)에서 구입하였다.
- LipofectAMINE 방법을[21] 이용하여 1 ug/well의 CYP2B1 PERU cis-acting element를 minimum pmmotor 인 CYP2C1 Promoter 와 firefly luciferase 보고유전자에 융합한 보고 유전자 Plasmid (PBRU2ClLuc)z 10 ng/well의 SV40 promoter와 Renilla luciferase 유전자 를 함유한 pRL-SV40 plasmid, 그리고 다양한 양의 CAR 발현유전자 pCDNA3CARl을 각각의 well에 첨가시켰다. PBRU를 제외한 1 나g/well의 2ClLuciferase 보고유전자를 대조 군으로 사용하였다. Transfection 후 각각의 세포를 36시간동안 incubation한 다음 dual luciferase 보고유전자 분석 방법(Promega Biotech)에 의해 luciferase의 활성을 측정하였다.
- 박테리아 세포 내에서 N-terminus에 His-tag이 융합된 CAR의 다량의 발현과 분리를 위해서 CAR2 cDNA를 BmHl과 EcoRl으로 자른 다음 pET28a+ vector (Novagen Corp)에 주입한 후 pETCAR2를 합성하였다. 박테리아 내에서 FLAG-tagged RXR을 발현하기 위하여 pf:RXR vector 를 사용하였다. 박테리아 내 단백질의 발현을 위하여, 1/20 volume의 overnight Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 배양 액을 1 L의 LB broth에 접종시켜 37℃에서 약 1시간 0.
이론/모형
- PBRU를 제외한 1 나g/well의 2ClLuciferase 보고유전자를 대조 군으로 사용하였다. Transfection 후 각각의 세포를 36시간동안 incubation한 다음 dual luciferase 보고유전자 분석 방법(Promega Biotech)에 의해 luciferase의 활성을 측정하였다. Transfection 효율성의 차이에 의해 발생될 수 있는 변이를 최소화하기 위해 각각의 Sample에 대한 firefly luciferase의 활성을 동등한 Renilla luciferase의 활성과 비교하여 표준화시켰다.
- 배양된 Hep G2 혹은 COS 세포 내에서 transfection을 하지 않은 control 상태와 transfection을 한 후의 CAR와 RXR 단백질의 발현여부를 알아보기 위하여 각각 0.5 u응의 pEmCARIGFP vector 또는 pCMX-RXR vector를 LipofectAMINE 방법에 [21] 의해 95%의 confluence 도달 한 배양세포에 transfection을 하였다. 먼저 transfection하 고자 하는 DNA를 OPTI-MEM에 mix한 다음 1 ug의 DNA에 대하여 5 ul의 LipofectAMINE과 혼합한 다음 15 분간 25℃에서 Incubation 하였다.
성능/효과
- 3). CAR 발현유전자 15 ng을 transfection하였을 때 주어진 보고유전자의 양에 대하여 최대반응을 나타내었고 90 ng의 CAR에 대해서도 더 이상 luciferase의 발현이 증 가되지 않았다. CYP2B1PBRU enhancer?} 제거된 CYP2C1 promotor/firefly luciferase를 보고유전자로 사용하였을 때는 CAR에 의한 luciferase의 활성이 나타나지 않았다.
- Hep G2 세포에서는 transfection된 CAR의 발현에 의해 firefly luciferase 보고단백질의 활성이 약 12배 증가하였다. CAR 발현유전자를 15 ng transfec- tion하였을 때 주어진 보고유전자의 양에 대하여 최대반응을 나타내었고 CYP2B1PBRU가 제거된 CYP2C1 promotor/ firefly luciferase를 보고유전자로 사용하였을 때는 CAR에 의한 luciferase의 활성이 나타나지 않았다. Hep G2와는 달 리, COS세포에서는 transfection된 CAR의 발현이 PBRU에 의한 firefly luciferase보고단백질의 발현에 영향을 주지 못 하였다.
- IB). 따라서 transfection된 CAR plasmid가 주어진 포유동물 배양세포 조건에서 정상적인 단백질의 발현을 할 수 있음을 확인하였다.
- 한편, GFP antibody를 이용하여 immunoblot 을 시행하였을 경우에는 CC6 세포에서 강한 mCARl- GFP 단백질의 발현을 나타내었을 뿐만 아니라 Hep G2 세 포에서도 명백히 단백질의 발현을 관찰할 수 있었다. 또한, Hep G2와 COS세포 모두에서 endogenous RXR의 발현이 일어남을 확인하였고 RXR expression plasmid를 trans- fection시켰을 때 두 세포 모두에서 단백질의 발현이 현저하게 증가되었다. Constitutive Androstane Receptor (CAR) 에 의한 CYP2B의 PBRU 활성효과를 다르게 분화된 세포 에서 차이가 일어나는지를 비교하기 위하여 CAR에 의해 매개되는 PBRU의 transactivation효과를 Hep G2와 COS 세포에서 조사하였다.
- 또한 콩팥으로부터 추출한 핵단백질이 함유된 in vitro transcription system에서도 CYP2B2 Promotor Construct의 전사활성이 Phenobarbital에 의해 유 도되지 못했다[31]. 이러한 결과들은 분화된 세포의 종류에 따라서 constitutive androstane receptor (CAR) 의 CYP2BPBRU의 활성효과가 다르게 나타날 수 있음을 제시 할 뿐만 아니라, 간세포에서는 Phenobarbital에 의한 PBRU의 활성유도를 매개하는 endogenous 인자들 중 CAR와 RXR과는 다른 전사조절 인자들이 필요로 하며 이러한 인자들의 발현이 콩팥 세포에서는 다르게 존재함 을 시사한다.
후속연구
- 다세포동물 에서 각각의 분화된 세포는 독특한 유전자의 발현 Pattern 을 갖고 있어서 어느 특정한 세포에서 일어나는 유전자의 발현특징이나 작용기전 혹은 기능이 다른 종류의 세포에서는 일어나지 않거나 상이한 기전에 의해서 조절된다. 이러한 세포간 특이성을 이용하여 유전자 발현에 관여하는 인 자들을 규명하는데 기초적 자료로 이용될 수 있다. 따라서 본 연구의 목적은 CYP2B유전자의 발현이 일어나지 않는 콩팥세포 line (COS) 에서 CAR 단백질 수용체가 PBRU의 활성촉진에 영향을 미치는지의 여부를 조사하고자 하였다.
- 예를 들어, 쥐의 간에서는 Phenobarbital에 의해 cytochrome P450 2B1과 2B2의 발현이 촉진되지만, 콩팥과 같은 간 이외의 조직에서는 CYP2B 유전자의 발현이 현저 하게 낮을 뿐만 아니라 Phenobarbital 에 의한 유도발현도 일어나지 않는 것으로 알려져 있다[29, 31]. 이러한 세포에 따른 반응특이성의 차이를 이용하여 유전자 발현에 관여하는 인자들을 규명하는데 기초적 자료로 이용될 수 있다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.