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문제 정의
- 따라서 본 연구는 한우 배반포의 체외생산에 있어서 난포란의 체외성숙 시간이 핵성숙과 초기배발달에 미치는 효과를 검토하였으며, 또한 체내 및 체외 생산된 배반포를 수란우에 이식함으로써 생산된 배반포의 품질을 검토하였다.
- 본 실험은 체외에서 한우 난포란의 핵성숙과 그 후의 초기 배발달에 있어서 체외성숙시간이 PB 출현율, 배 발달율, 배반포의 세포수와 수태율에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
- 인공수정 후 7일째에 비외과적 관류법으로 수정란을 회수하였다. 2% lidocaine (광명약품)을제 1~3미주 사이에 6~10 ml 주사하여 경막외마취를 행하였고, 자궁각에 foley catheter (FHK, Nipro)를 고정시킨 후 2% FBS가 첨가된 D-PBS (Sigma, D5773)로 자궁관류하여 배반포를 회수하였다.
- 5% pronase (Sigma, P6911) 용액으로 처리하여 용해시킨 후, HbT로 3~5회 세척하였다. 그리고 rabbit anti-bovine whole serum (Sigma, B8270)이 1:5로 희석된 HbT 용액에서 1시간 배양한 후, HbT용액에 1:10으로 희석된 guinea pig complement (Sigma, S-1639; PI와 bisbenzimide가각각 4 μg/ml 첨가)에서 1시간 처리하여 염색을 행하였다. 배반포를 HbT로 5분간 세척한 후, slide glass에whole mount하여 형광현미경하에서 배반포의 inner cell mass (ICM) 와 trophectoderm (TE) 의 세포 수를 각각 조사하였다.
- 발정은 FSH 주사 후 48시간째에 PGF% (Lutalyse, Upjohn) 25 mg을 근육주사 함으로써 유도하였다. 그리고 인공수정은 발정 관찰 없이 PGF& 주사 후 48 및 60시간째에 2회 실시하였다. 인공수정 후 7일째에 비외과적 관류법으로 수정란을 회수하였다.
- 그리고 rabbit anti-bovine whole serum (Sigma, B8270)이 1:5로 희석된 HbT 용액에서 1시간 배양한 후, HbT용액에 1:10으로 희석된 guinea pig complement (Sigma, S-1639; PI와 bisbenzimide가각각 4 μg/ml 첨가)에서 1시간 처리하여 염색을 행하였다. 배반포를 HbT로 5분간 세척한 후, slide glass에whole mount하여 형광현미경하에서 배반포의 inner cell mass (ICM) 와 trophectoderm (TE) 의 세포 수를 각각 조사하였다.
- 배양 7, 8일째에 배반포의 세포수를 측정하기 위하여 propidium iodide (Sigma, P4170; PI)와 bisBenzimide (Sigma, B2261)를 사용하여 이 중 형광염색을 실시하였다 (Giles 등, 1995). 배반포의 투명 대를 0.
- 본 연구에 사용된 배양액 중 난소로부터 난포란의 세척 및 회수용은 25 mM HEPES 와 3 mg/ml BSA (Sigma, A6003)가 첨 가된 Hepes-buffered TALP (HbT)용액, 체외성숙용은 0.2 mg/ml pyruvate (Sigma, P3662), 10% FBS (Sigma, F0643), 1 ug/ml FSH (Sigma, F8174), 10 yg/ml LH (sigma, L9773), 1 “g/ml Estradiol-17 6 (Sigma, E2758)가 각각 첨가된 TCM-199 (Gibco, 12340-030)용액, 체외수정용은 6 mg/ml BSA와 10 yg/ml heparin (Sigma, H3149)°] 첨가된 TALP용액, 체외배양용은 3 mg/ml BSA 그리고/또는 10% FBS가 첨가된 CRlaa용액을 각각 이용하였다. 그리고 실험에 제공되는 배양액의 미세소적은 mineral oil (Sigma, M8410)을 도포하여 39℃, 5% CO2 배양기에서 최소한 4시간 이상 전 배양하였다.
- 선발된 공란우의 과배란 처리는 발정 확인일을 0일로 하여 10일째부터 12시간 간격으로 4일간(8 회) 50 mg의 FSH (Falltropin-V, Veterpharm, Canada)를 근육주사하였다. 발정은 FSH 주사 후 48시간째에 PGF% (Lutalyse, Upjohn) 25 mg을 근육주사 함으로써 유도하였다.
- 수정란이식은 정상 발정주기의 7일째의 것을 수란우로 선정하여, 일반적인 방법에 준하여 황체가 존재하는 쪽의 자궁각 선단부에 배반포를 주입하였고, 임신진단은 이식 후 60일경에 직장 검사법으로 행하였다.
- 그리고 인공수정은 발정 관찰 없이 PGF& 주사 후 48 및 60시간째에 2회 실시하였다. 인공수정 후 7일째에 비외과적 관류법으로 수정란을 회수하였다. 2% lidocaine (광명약품)을제 1~3미주 사이에 6~10 ml 주사하여 경막외마취를 행하였고, 자궁각에 foley catheter (FHK, Nipro)를 고정시킨 후 2% FBS가 첨가된 D-PBS (Sigma, D5773)로 자궁관류하여 배반포를 회수하였다.
- 체외성숙 0, 6, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24시간째에 확장된 cumulus oocyte complexs (COCs)를 0.03% hyaluronidase (Sigma, H4272)함유 PBS 용액으로 5분간 vortex하여 난구세포를 제거하고 first polar body (PB) 출현을 조사하였다.
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4. 체외배양
체외수정 20시간 후 15개의 수정란(배양 1일)을 3mg/ml BSA가 첨가된 CRlaa 용액 50μl에 넣고, 39℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 배양 3일째부터 10% FBS가 첨가된 CRlaa 용액으로 난관 상피세포와 공배양을 행하였으며(Pegeraro 등, 1998), 배 양 5일 및 7일째에 50%씩 신선 배양액으로 교환하였다.
대상 데이터
- 도축 한우에서 난소를 적출하여 25 μg/ml genta-mycin (Sigma, G1264)이 첨가된 0.9% 생리식염수 (25~28 ℃)가 들어있는 보온병에 담아 6~7시간에 실험실로 운반하였다. 수집된 난소는 penecillin G (Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18 G 주사침이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 직경 2~8 mm의 가시난포로부터 난포란 을 회수하였다.
- 9% 생리식염수 (25~28 ℃)가 들어있는 보온병에 담아 6~7시간에 실험실로 운반하였다. 수집된 난소는 penecillin G (Sigma, P3032)가 첨가된 생리식염수로 3~4회 세척하여, 18 G 주사침이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 직경 2~8 mm의 가시난포로부터 난포란 을 회수하였다. 회수된 난포란은 실체현미경 하에서 난구 세포의 부착상태가 치밀한 것만을 선별하여, 50 μl의 체외성숙용 배지에 15개 난포란을 옮겨 39 ℃, 5% CO2 배양기에 배양함으로써 체외성숙을 유도하였다.
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계학적 분석은 SAS (package ver 8.1)를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 처리 간의 유의성은 Duncan's multiple range test를 이용하여 검정하였으며, 수태율은 x2-test를 이용하였다.
이론/모형
- 체외수정용 정자의 준비는 Parrish 등(1995)의 방법에 준하여 행하였다. 한우 동결정액 1~2개를 실온에서 10초간, 37℃의 항온수조에서 30초간 처리하여 융해한 후 90% percoll (Sigma, P4937) 2 ml 용액이 담겨져 있는 15 ml 원심분리관(Coming, 4300 52)에 살며시 놓은 후 700 g에서 20분간 원심분리 후 하층부의 정자괴만을 회수하여, 2 ml의 신선 체외수정용액으로 350 g에서 다시 10분간 원심분리함으로써 정자를 세척하였다.
성능/효과
- 있다. 그러나 본 연구 결과 체외성숙 과정에서 총 PB 출현율보다는 PB 출현 시간대와 발달능력 사이에 관련이 있는 것으로 판단된다. 이것은 Fig.
- 05)으로 많았다. 그리고 TE 세포수는 체외성숙 18시간, 배양 7일째 군(97.6±29.6)에 생산된 것과 체내 생산된(87.5±3.5)것이 비슷했으며, 특히 배양 8일째군(체외성숙 18시간 70.7+3.8 및 24시간 60.9±3.2)의 것과 비교하여 유의적 (P<0.05)으로 높았다.
- 본 실험 결과도 Hasler 등(1995)의 보고와 같이 체내 배반포가 수태율이 가장 높았으며, 체외성숙과 체외배양 시간이 길어질수록 수태율이 낮았다(Table 4). 따라서 수태율은 배반포의 생산 방법(체외 및 체내)과 체외생산 조건에 모두 영향을 받으며, 체외성숙과 배양시간이 길어짐에 따라 수태율이 낮은 원인은 난자의 체외성숙 시간 증가로 인하여 난자에 가해진 유해물질과 배반포 단계에서 적은 세포수 등이 복합적으로 작용한 것으로 사료된다.
- 한편, Khatir 등(1998)은 소의 연령에 따라 PB 출현율에 차이가 있었고, Dominko와 First(1997) 및 Suss 등(1988)은 체외성숙 배양액에 호르몬의 첨가에 따라 PB 출현율에 차이가 있다고 하였다. 본 실험(Fig. 1) 결과도 전체 PB 출현율은 75% 정도로 상기의 연구들과 비슷하였으며, 체외성숙 시간의 증가와 함께 PB 출현율이 증가하였고, 본 실험의 배양조건에서 핵성숙에 소요되는 시간은 체외성숙 18~20시간 전후인 것으로 판단된다.
- 이상의 결과를 요약하면 한우 수정란의 체외생산에 있어서 짧은 체외성숙(18시간)이 배 발달율, 세포수 그리고 수태율 측면에서 효과적이었다. 이것은 체외성숙 시간의 증가에 따라 체외성숙배양액 중에 세포 대사산물의 축적에 따른 유해 작용과 PB 방출 후 난자 노화과정이 진행되어 난자의 발달능력 손실이 발생하므로 조기에 체외성숙을 완료하는 것이 한우 배반포의 체외생산에 있어서 효율적일 것으로 사료된다.
- 이상의 결과에서 난포란의 체외성숙 및 발달에는 많은 조건들이 영향을 미치고 특히, PB 출현이 높을수록 난포란의 성숙 및 발달율이 높은 것으로 알려져 있다. 그러나 본 연구 결과 체외성숙 과정에서 총 PB 출현율보다는 PB 출현 시간대와 발달능력 사이에 관련이 있는 것으로 판단된다.
- 05)으로 많은 배반포가 형성되었다. 즉 18시간군이 배양 7일과 8일에 86%의 배반포가 형성되었으며, 이것은 24시간군(55%)의 배반포 형성률에 비하여 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 05)인 차이가 있었다. 즉 체내·외 배양 7 또는 8일째에 형성된 배반포의 수태율은 처리군 간에 유의적인 차이가 없었으나, 체외성숙 처리군 내에서는 배양 7일째 것이 8일째 것보다 유의적(P<0.05)으로 높았다.
- 결과는 Table 1에 나타냈다. 체외성숙 16, 18, 20, 22 및 24시간에 따른 수정율(≥2-cell)과 8세포기까지의 배 발달율은 각 군간에 유의적인 차이는 없었으나, 수정율은 체외성숙 20시간군(71.0± 1.6 %), 8세포기까지 배 발달율은 체외성숙 18시간 군에서 37.3±5.3%로 높은 경향을 보였다. 한편 배반포까지 및 8세포기 배부터 배반포까지의 배 발달율은 체외성숙 18시간군에서 각각 31.
- 3에 나타냈다. 총 세포수는 체내 생산군 (127.5±1.6)과 체외성숙 18시간, 배양 7일째군 (129.8±7.3)의 것이 비슷하였으며, 이것은 다른 처리군에 비하여 총 세포수가 유의적(P<0.05)으로 많았다. 한편, ICM 세포수는 체내 생산군(40.
- Pegeraro 등(1998) 및 Van Soom 등(1997)은 체외배양 7일째에 생산된 배반포의 ICM, TE와 총세포수가 배양 8일째의 것보다 많았다고 하였다. 한편, 본 실험 결과 세포수 측면에서 체내 배반포와 체외성숙 18 시간, 배양 7일째에 형성된 배반포가 비슷한 품질을 보였으며, 이들 배반포의 이식 후 높은 수태율 (Table 4)을 기록하여 체외성숙 및 배양시간과 생산된 배반포의 세포수와 수태율 사이에 밀접한 관계가 있음을 확인하였다.
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