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문제 정의
- 위한 기초적인 데이터를 얻고자 하였다. 또한 환경에 적용했을 경우 효과를 확인하고자 실제환경을 모사한 환경을 조성하여 디젤유의 제거능을 확인하는 실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 디젤 오염토양의 정화를 위하여 디젤분해 능이 우수한 균주를 분리하고, 분리 균주의 특성 파악과 더불어 최적 유류분해 조건을 파악하여 디젤 오염환경에의 생물학적인 정화를 위한 기초적인 데이터를 얻고자 하였다. 또한 환경에 적용했을 경우 효과를 확인하고자 실제환경을 모사한 환경을 조성하여 디젤유의 제거능을 확인하는 실험을 실시하였다.
- 본 연구에서는 유류 오염토양으로부터 디젤유 분해활성이 높은 미생물 균주를 분리하고, 그 중 활성이 높은 HS1, HS2, HS3 균주에 대한 특성을 파악하는 실험을 실시하였다. 균주에 대한 동정을 실시하여 각각 Acinetobacter calcoaceticus (HS1), Psedomonas sp.
제안 방법
- )를 사용하여 microbial identification system으로 동정하였다. 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 통한 동정은 forward primer 로 5'-CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'를, reverse primer로는 5'-GCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCC-3'< 사용, PCR을 실시하고, 염기서열 분석과 BLAST 검색을 통해 동정하였다.
- 사용하였다. 50 g의 멸균된 토양에 2%(w/w, 675 μl)의 디젤유를 분주하여 분해능을 확인하였으며, 균주의 접종은 TSB게서 12 시간 배양한 균주를 16, 920Xg에서 10분간 원심 분리한 후 최소배지로 현탁하여, 토양수분 보유능(0.58ml/g soil)의 40%가 되도록 토양과 고르게 혼합하였다. 본 실험에서 사용한 토양의 pH는 4.
- 각각의 배양 pH는 50mM의 zwitterionic buffer (pH 5; MES, pH 7; MOPS, pH 9 TRIS)를 이용하여 보정한 후 배양하였다. Branched alkane에 대한 분해능을 확인하기 위해서 branched alkane의 대표물질로 C19 인 pristane을 최종 2%(v/v)로 첨가하였으며, 잔류 pristane의 양은 GC로 잔류 디젤의 분석방법과 동일한 조건에서 정량 분석하였다.
- FAH의 분해능 확인을 위해서, 대표물질로 fluorene, phenanthrene, anthracene, pyrene을 ethyl acetate에 용해시킨 후 최종 200 p.g/L 의 농도로 최소배지에 첨가하여 10일간 배양하였다. 양성 대조 구로 BAH 분해능이 높다고 알려진 곰팡이 균주인 Phanerochaete chrysosporium PSBL-1 을 이용하였고, 배양액의 잔류 PAH 정량은 acetonitrile을 배양액에 75%가 되도록 첨가하여 분해되지 않은 PAH를 용해시킨 후 HPLC system (Spectra system, Thenno seperation products, USA)을 이용하여 정량 분석하였다.
- 5 g/L 로 20 ml의 배지에 디젤유는 2%(v/v)로 첨가하였으며, 모든 배지는 121℃, 15분간 가압멸균하여 사용하였다. 각각의 균주는 TSB 에서 12시간동안 배양한 후 최소배지에 l%(v/v)로 접종, 25℃ 200rpm으로 5일간 배양한 후 결과를 분석하였다. 균주의 성장은 배양액을 96 well plate에 200|_il씩 분주, ELISA reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 균주의 배양은 복합배지인 TSB (tryptic soy broth, Difco)를사용하였고, 액체배지에서의 디젤분해능을 측정하기 위해서는, 탄소 원으로 디젤유가 첨가된 최소배지를 사용하였다. 최소배지의 조성은 NH4C1 0.
- 배양은 실온에서 29일간 실시하였다. 대조군으로 균을 접종하지 않은 최소배지를 동량으로 혼합한 후 동일한 조건에서 배양하였다.
- 디젤유의 분해능 확인을 위해 배양액 20 ml에 n-hexane 20 ml 을 가하여 배양액 속의 잔류 디젤을 추출하였다. 배양액과 nhexane을 30초간 강하게 교반하고 9, 297 g에서 원심분리 후 분리된 n-hexane증을 tube에 담아 65℃에서 n-hexane을 증발시켰다.
- 였다. 메틸화된 균체지방산은 GC (HP 6890, Hewlett packard, USA.)를 사용하여 microbial identification system으로 동정하였다. 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 통한 동정은 forward primer 로 5'-CGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'를, reverse primer로는 5'-GCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCC-3'< 사용, PCR을 실시하고, 염기서열 분석과 BLAST 검색을 통해 동정하였다.
- 배양조건 변화에 의한 디젤유 분해능 확인을 위하여 pH (5.0, 7.0, 9.0)에 따른 디젤유 분해능을 확인하였다. 각각의 배양 pH는 50mM의 zwitterionic buffer (pH 5; MES, pH 7; MOPS, pH 9 TRIS)를 이용하여 보정한 후 배양하였다.
- 분리균주의 동정을 위하여 Biolog(metabolic fingerprint) assay 와 균체지방산 조성 분석, 16S ribosomal DNA 염기서열 분석을 실시하였다. Biolog assay의 경우 시험균주를 BUGM agar (Biolog Universal Yeast Agar, BIOLOG Inc.
- 분리된 HS 균주 중 액체 배양시 디젤 분해율이 가장 높게 나타난 HS1 균주에 대하여 실제 토양에서의 생존능과 디젤 분해능 확인을 위한 토양배양을 실시하였다. 실험에 사용한 토양의 분석 결과 수분 보유능(Water Holding Capacity, WHC)은 0.
- 소수성이 높은 HS1 균주와 유화활성이 높은 HS3 균주에서 quorum sensing을 일으키는 것으로 알려져 있는 homoserine lactone (HSL)-type autoinducer를 검줄하였다(결과 미제시). 기존의 여러 연구결과 Acinetobacter sp.
- g/L 의 농도로 최소배지에 첨가하여 10일간 배양하였다. 양성 대조 구로 BAH 분해능이 높다고 알려진 곰팡이 균주인 Phanerochaete chrysosporium PSBL-1 을 이용하였고, 배양액의 잔류 PAH 정량은 acetonitrile을 배양액에 75%가 되도록 첨가하여 분해되지 않은 PAH를 용해시킨 후 HPLC system (Spectra system, Thenno seperation products, USA)을 이용하여 정량 분석하였다. Clg Vydac column (15 cmX4.
- 총 유기물 함량은 토양 시료에 함유된 수분을 75℃의 건조기에서 12시간 이상 건조시킨후, 일정 토양시료가 들어있는 도가니를 전기로 (High temp muffle furnace, Pillip, US A) 에 넣어 500℃로 가열하고 매 두 시간 간격으로 도가니를 꺼내어 방냉하여 무게를 측정하였다. 위의 과정을 반복하여 무게의 변화가 없을 때까지(4~5시간) 실행하여 유기물 함량을 즉정하였다. 수분 보유능(Water Holding Capacity, WHC)은 Kirsten의 방법으로 측정하였다(10).
- 유화능(emulsifying activity)은 a-hexadecane을 유화기질로 이용하여 즉정하였다. 배 양액을 1.
- 이후 hexane층을 취하여 32, 540 g에서 10분간 원심분리하여, 잔류디젤량을 GC로 분석하였다.
- 5 mm ID, 5 |im)을 이용하여 , 분석은 이동상 75% acetonitrile, 유속 1 ml/min, 검출기 254 nm의 조건에서 20분간 실시하였다. 제거된 PAH의 양은 균을 접종하지 않은 대조군의 잔류 PAH 농도와 비교하여 산출하였다.
- 토양의 특성은 총 유기물 함량, 수분 보유능 그리고 pH를 측정하였다. 총 유기물 함량은 토양 시료에 함유된 수분을 75℃의 건조기에서 12시간 이상 건조시킨후, 일정 토양시료가 들어있는 도가니를 전기로 (High temp muffle furnace, Pillip, US A) 에 넣어 500℃로 가열하고 매 두 시간 간격으로 도가니를 꺼내어 방냉하여 무게를 측정하였다. 위의 과정을 반복하여 무게의 변화가 없을 때까지(4~5시간) 실행하여 유기물 함량을 즉정하였다.
- 최소배지의 조성은 NH4C1 0.5 g/L, Na2HPO4 -7H2O 1.89 g/L, I&HPQ 0.5 g/L 로 20 ml의 배지에 디젤유는 2%(v/v)로 첨가하였으며, 모든 배지는 121℃, 15분간 가압멸균하여 사용하였다. 각각의 균주는 TSB 에서 12시간동안 배양한 후 최소배지에 l%(v/v)로 접종, 25℃ 200rpm으로 5일간 배양한 후 결과를 분석하였다.
- tetrazolium chloride)를 이용하였다(2). 토양시료 0.2 g과 0.88 mM NADH 50 μ1, 0.02% nalidixic acid 200 pd, 0.2% INT 200 μ1, 0.4 M Tris-Cl (pH 7.0) 100(11 를 첨가하여 24시간 동안 배양한 후 5, 922g에서 15분간 원심분리하여 현탁된 세균을 침전 시켜 싱등액을 제거하였다. Pellet에 96% methanol 1 ml을 넣고, 교반하여 세포내에 축적된 iNT-formazan을 추출하였다.
- 19mm sieve를 이용하여 입자의 크기를 고르게 하였다. 토양의 특성은 총 유기물 함량, 수분 보유능 그리고 pH를 측정하였다. 총 유기물 함량은 토양 시료에 함유된 수분을 75℃의 건조기에서 12시간 이상 건조시킨후, 일정 토양시료가 들어있는 도가니를 전기로 (High temp muffle furnace, Pillip, US A) 에 넣어 500℃로 가열하고 매 두 시간 간격으로 도가니를 꺼내어 방냉하여 무게를 측정하였다.
- 17을 나타내었다. 토양이 산성을 강하게 나타내어 CaCC)3를 첨가하여 토양의 pH를 7 로 보정한 후 실험을 실시하였다.
대상 데이터
- 배양에 사용한 균주는 분해능이 가장 높게 측정된 HS1 균주를 사용하였다. 50 g의 멸균된 토양에 2%(w/w, 675 μl)의 디젤유를 분주하여 분해능을 확인하였으며, 균주의 접종은 TSB게서 12 시간 배양한 균주를 16, 920Xg에서 10분간 원심 분리한 후 최소배지로 현탁하여, 토양수분 보유능(0.
- 본 실험에서 사용한 토양은 경기도 용인시 명지대학교 야산 50cm 깊이에서 채취하였으며, 내경 1.19mm sieve를 이용하여 입자의 크기를 고르게 하였다. 토양의 특성은 총 유기물 함량, 수분 보유능 그리고 pH를 측정하였다.
- 본 연구에서는 36개 지역의 디젤 오염토양 시료를 채취, 농화배양을 실시하여 디젤 분해능이 있고 높은 유화활성을 나타내는 총 150여 균주를 분리하였다. 이들 균주를 디젤유 최소배지에 접종하여, 최종적으로 디젤유 분해능이 높은 3개의 균주를 선별하였다.
- 이들 균주를 디젤유 최소배지에 접종하여, 최종적으로 디젤유 분해능이 높은 3개의 균주를 선별하였다. 이들 균주를 HS1, HS2, HS3라 명명하였고 본 연구에 이용하였다.
- 균주를 분리하였다. 이들 균주를 디젤유 최소배지에 접종하여, 최종적으로 디젤유 분해능이 높은 3개의 균주를 선별하였다. 이들 균주를 HS1, HS2, HS3라 명명하였고 본 연구에 이용하였다.
이론/모형
- 이후 반응액을 30초 동안 강하게 교반한 후 300|11씩 96-well plate에 분주하여 유화활성을 540nm에서 ELISA reader를 이용하여 측정하였다. 소수성 (hydrophobicity)은 n-hexadecane을 기질로 사용하여 BATH (bacterial adherence to hydrocarbon) 방법을 이용, 세포의 소수성을 백분율로 나타내었다(23, 29).
- 위의 과정을 반복하여 무게의 변화가 없을 때까지(4~5시간) 실행하여 유기물 함량을 즉정하였다. 수분 보유능(Water Holding Capacity, WHC)은 Kirsten의 방법으로 측정하였다(10). 토양의 pH는 100 ml flask에 토양 50 g과 50 ml의 증류수를 넣고, 1시간 동안교반 후 측정하였다.
- 배양액과 nhexane을 30초간 강하게 교반하고 9, 297 g에서 원심분리 후 분리된 n-hexane증을 tube에 담아 65℃에서 n-hexane을 증발시켰다. 이후 tube의 무게를 측정, 잔류된 디젤유의 무게를 환산히는 partiton gravimetric method(Standard methods, 5520B)와 GC(HP 6890)를 사용하여 분석하였다. GC 분석조건은 FID (Flame Ionization Detector) detector, HP-1 capillary column (crosslinked methylsiloxane, 30 m (length) X 0.
성능/효과
- 또한 PAH의 ring 수가 증가할수록 분해가잘 이루어지지 않는 결과를 나타내었는데, 이러한 결과는 PAH의 경우 ring의 개수에 비례하여 증가하는 소수성의 증가로 인해 분해율이 감소한 것으로 보여진다(25). Branched alkane에 대한분해능을 확인하기 위해 탄소원으로 탄소사슬이 19개인 pristane 을 사용하여 5일간 배양한 결과 세 균주 모두 10% 미만의 낮은 분해율을 나타내었고, GC chromatogram을 확인한 결과 pristane의 중요한 pick의 경우 거의 분해되지 않은 것을 확인하였다(결과 미제시).
- 04%)가 주요성분으로 Chromobacterium/ Pseudomomonas속의 특징을 나타내었다. HS3 균주는 summed feature 31(38.47%) (Cl6:i ISO/C15:0 iso 2OH)], C16.0 27.49%), C18.1(16.55%) 가 주성분으로서 ChromobacteriuniJ Pseudomonas 속의 특징을 나타내었다.
- 1). 각 균주의 배양조건을 최적화하기 위해 pH에 따른 디젤 분해효율을 확인한 결과 HS1, HS2 균주는 pH9의 높은 pH에서의 분해 활성은 낮게 나타난 반면, HS3는 pH5의 산성 pH에서 분 해 활성이 매우 높게 나타남을 확인할 수 있었다(Table 2). 각 균주를 혼합
- 또한 HS1 균주에 대한 16S rDNA 분석결과 Acinetohacter calcoaceticus 균주와 유의성이 높게 나타났다(BLAST homology search score; 837). 따라서 HS1 균주는 최종적으로 Acinetohacter calcoaceticus 로동정하였다.
- HS1 균주와 HS2 균주의 경우 낮은 유화능을 지니고 있는 균주로서 HS3 균주와 혼합 배양할 경우 유화능이 증가함으로 인하여 소수성을 이용한 탄화수소 이용능이 저해를 받게 된다. 따라서 HS1 균주와 HS2 균주에 의한 분해효율이 감소되고 HS3 균주에 의한 분해 효율이 매우 낮아져 전체적으로 분해효율이 감소되는 결과가 나타났다고 보여진다.
- 따라서 두 균주 모두 Pseudomonas 속으로 동정하였다. 또한 HS1 균주에 대한 16S rDNA 분석결과 Acinetohacter calcoaceticus 균주와 유의성이 높게 나타났다(BLAST homology search score; 837).
- 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 HS1 균주가 가장 높은 디젤유 분해효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1). 각 균주의 배양조건을 최적화하기 위해 pH에 따른 디젤 분해효율을 확인한 결과 HS1, HS2 균주는 pH9의 높은 pH에서의 분해 활성은 낮게 나타난 반면, HS3는 pH5의 산성 pH에서 분 해 활성이 매우 높게 나타남을 확인할 수 있었다(Table 2).
- 따라서 두 균주 모두 Pseudomonas 속으로 동정하였다. 또한 HS1 균주에 대한 16S rDNA 분석결과 Acinetohacter calcoaceticus 균주와 유의성이 높게 나타났다(BLAST homology search score; 837). 따라서 HS1 균주는 최종적으로 Acinetohacter calcoaceticus 로동정하였다.
- 2). 또한 미생물 활성도를 확인한 결과 초기 10일 이내에 미생물 활성이 급격히 증가한 후에 배양 18일이 경과된 후부터는 일정한 활성을 유지하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 초기 미생물 활성도의 증가는 접종된 HS1 균주가 디젤유를 분해함으로서 탄소원을 얻어 급격한 성장을 나타내고 이에 따른 미생물 활성도가 높게 측정되는 것이다(2).
- (HS2, HS3) 균주로 동정되었다. 또한 분리된 균주의 경우 디젤유 분해 방법이 각기 다르게 나타남을 확인할 수 있었고, 이에 따라 디젤유의 분해율 또한 차이가 나타남을 알 수 있었다. 실제 세 균주의 경우 소수성과 유화활성이 다르게 나타났는데 이러한 특성이 균주의 유류분해 특성을 결정짓는 것으로 나타났다.
- 실제 세 균주의 경우 소수성과 유화활성이 다르게 나타났는데 이러한 특성이 균주의 유류분해 특성을 결정짓는 것으로 나타났다. 또한 분해활성이 높게 나타난 HS1 균주의 경우 디젤유 오염환경을 조성하여 토양배양을 실시한 결과 높은 디젤유 분해능을 나타내었고, 토양에서의 생존능 또한 높게 나타나는 것으로 확인되었다.
- 배양하여 각 균주와의 상호 관계에 따른 디젤 분해양상을 확인한 결과 흔합배양을 한 모든 경우 단독배양의 경우에서 보다 낮은 분해양상을 나타내었으며 , 세 균주(HS 1, 2, 3)를 모두 혼합하여 배양하였을 경우 배양액이 매우 높은 유화활성을 나타내는 반면 디젤유의 분해활성은 가장 낮은 28%의 디젤유를 분해하는 결과를 확인할 수 있었다(Table 3). 이러한 결과는 고 등(1)이 밝힌 바와 같이 탄화수소 이용방법에 따른 영향으로 보여진다.
- 분리균주 HS1, HS2, HS3의 Biolog (metaboUc fingerprint) 분석결과 HS1 균주의 경우 Acinetohacter calcoaceticus와의 유사성이 43%로 나타났으며, HS2 균주는 Pseudomonas aeruginosa와 유사성 이 53%로 나타났다. HS3 균주의 경우 Pseudomonas fluorescens 와의 유시"성이 53%로 나타났다.
- 분리균주의 16S rDNA 분석 결과 HS2 균주의 경우 Pseudomonas putida 균주와 유의성이 높게 나타났으며 (BLAST homology search score; 938), HS3 균주의 경우 Pseudomonas borealis 균주와 유의 성 이 높게 나타났다(BLAST homology search score; 900). 따라서 두 균주 모두 Pseudomonas 속으로 동정하였다.
- 분리균주의 균체지방산 분석결과 HS1 균주는 C1S:I(39.19%), C]6.o(23.79%), summed feature 3[(15.66%)(12:0 aide or Ci&i ISO/Ct5.0 iso 2OH)]가 주성분으로서 Acinetovacter의 특징을 나타냈으며, HS2 균주는 summed feature 3[(36.41%) (C16:1 ISO/CI5:0 iso 2OH)], C16.o(27.5O%), C]8.](17.04%)가 주요성분으로 Chromobacterium/ Pseudomomonas속의 특징을 나타내었다. HS3 균주는 summed feature 31(38.
- 분리된 HS 균주의 디젤유 분해양상을 확인하기 위해 GC를 통한 잔류 디젤의 분석결과 세 균주 모두 디젤유의 탄소 사슬의 길이에 관계없이 모든 종류의 지방족 탄화수소에 대해 분해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 또한 HS1 균주가 가장 높은 디젤유 분해효율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 분리된 HS 균주의 소수성을 측정한 결과 HS1 아1S2>HS3 순서로 소수성이 높게 나타났으며, 유화능은 이와 반대로 HS3>HS2 >HS1의 순서로 나타났다(Table 1). HS1 균주의 경우 거의 100%에 가까운 소수성을 나타냈는데 이러한 특성은 각각의 균주가 디젤 분해 양상을 결정하는 요인인 것으로 생각된다.
- 또한 분리된 균주의 경우 디젤유 분해 방법이 각기 다르게 나타남을 확인할 수 있었고, 이에 따라 디젤유의 분해율 또한 차이가 나타남을 알 수 있었다. 실제 세 균주의 경우 소수성과 유화활성이 다르게 나타났는데 이러한 특성이 균주의 유류분해 특성을 결정짓는 것으로 나타났다. 또한 분해활성이 높게 나타난 HS1 균주의 경우 디젤유 오염환경을 조성하여 토양배양을 실시한 결과 높은 디젤유 분해능을 나타내었고, 토양에서의 생존능 또한 높게 나타나는 것으로 확인되었다.
- HS2 균주는 다른 두 균주의 중간적인 형태를 나타내는 것으로 보여진다(Table 1). 실제로 균주 배양액의 현미경관찰 결과 HS1 균주의 경우 배양액에서보다 분해되지 않은 디젤유에 부착되어 있는 상태로 관찰되는 것을 확인할 수 있었다(자료 미제시).
- 위한 토양배양을 실시하였다. 실험에 사용한 토양의 분석 결과 수분 보유능(Water Holding Capacity, WHC)은 0.58 g H2O/g soil, 총 유기물량은 9.66%(w/v), pH는 4.17을 나타내었다. 토양이 산성을 강하게 나타내어 CaCC)3를 첨가하여 토양의 pH를 7 로 보정한 후 실험을 실시하였다.
- HS1 균주의 경우 거의 100%에 가까운 소수성을 나타냈는데 이러한 특성은 각각의 균주가 디젤 분해 양상을 결정하는 요인인 것으로 생각된다. 즉 소수성이 높은 HS1 균주의 경우 세포 자체의 소수성으로 디젤유와 직접 접촉함으로서 디젤유를 탄소원으로 이용하는 것으로 보였고, 유화능이 높은 HS3 균주의 경우는 유화제 분비를 통해 디젤유를 작게 분산시켜 탄소원으로 이용하는 것으로 보여진다. HS2 균주는 다른 두 균주의 중간적인 형태를 나타내는 것으로 보여진다(Table 1).
후속연구
- 본 연구를 통해 분리된 디젤유 분해 균주들의 유류 분해조건을 최적화 할 경우 실제 오염환경에 적용할 수 있을 것으로 보여지며, 이외에도 발현하는 유화제 등을 이용한 산업적인 응용 또한 가능할 것으로 사료된다.
- 의 경우 HSL-type autoinducer를 발현한다는 사실이 보고되었다(8, 17, 18). 상기의 결과는 HS1 균주와 HS3 균주가 정족수를 인식하는 신호 전달체계를 지니고 있다는 증거로서, 두 균주가 지니고 있는 유류 분해능과의 관련성을 확인하여 유류분해시 적용시킬 경우 유류분해 효율을 증가시킬 수 있는 방법으로의 응용이 가능할 것으로 보여진다.
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