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문제 정의
- , 2001). 따라서, 본 연구에서는 능이버섯 자실체 추출물의 인체 암세포에 대한 세포독성 및 돌연변이원성, fibrin 분해효소에 의한항 혈전성, polyphenol 등 항산화물질에 의한 항산화작용,angiotensin converting enzyme(ACE) 저해성분에 의한 항고혈압성 등을 확인하여 생활습관병의 예방 및 치료보조제로서의 활용 여부를 확인하였다.
가설 설정
- l) Streptokinase was 1, 180 unit/g.
제안 방법
- 5 mg/mL 농도의 MTT시약을 well 당 200 uL씩 분주하였다. 4시간 배양 후 MTT 시 으*이 포함된 배지를 제거하고, dimethyl sulfoxide 100 uL를 가한 후 sorenson's buffer(0.1 M NaCl - 0.1 M lycine, pH 10.5) 20 uL를 처리하여 상온에서 5분간 발색시키고 ELISA microplate reader(ELx800, Bio-tech., USA)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였으며 대조구는 시료 대신 PBS를 첨가하였다.
- Maron과 Ames(1983)의 방법에 따라 시료의 농도 증가에따른 Salmonella typhimurium TA98 (KCTC 2053) 및 TA100(KCTC 2054)의 돌연변이원성을 알아보기 위하여 멸균된micro tube에 시료를 2.5, 5.0, 10.0 uL씩 넣은 후 S9 mix 500 uL, 균주 100 uL를 첨가하고 37℃ water bath에서 20분간 전 배양하였다. 이 것을 0.
- 0 uL씩 넣은 후 S9 mix 500 uL, 균주 100 uL를 첨가하고 37℃ water bath에서 20분간 전 배양하였다. 이 것을 0.5 mM histidine , biotin이 포함된 top agar 2 mL에 첨가한 후 minimal glucose agar plates 에 중층하고 37℃에서 48시간 배양 후 revertant colony수가 spontaneous colony의 수보다 2배 이상이면 돌연변이성이 있는 것으로 하였다.
- 5 N HC1 250 uL를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이 용액에 ethyl acetate 1.5 mL를 넣고 1분간 혼합한 후 상온에서 2, 800rpm, 10분간 원심분리하여 상등액 ImL를 취하고 140℃에서 20분간 건조하고 1 M NaCl 3 mL를 가하여 용해시킨 후 228 nm에서 흡광도를 측정하는 통상법과 ACE와 sample을 먼저 반응시킨 후 기질을 나중에 첨가하는 전처리법으로 측정하였다
- plate에 지름 5 mm의 pasteur pipette로 4개 원형을 만들어 각 시료를 20 uL씩 농도별로 점적하고 37C에서 18시간 동안 반응시킨 후 생성된 clear zone 을 측정하였다. 표준시료로서 정제된 혈전용해효소인 Strep- tokinase(제일제당, 1, 180 unit/g)의 용해면적에 대한 시료의용해면적의 상대적인 비율로 환산하여 산출하였다.
대상 데이터
- 능이버섯 추출물의 세포독성을 측정하기 위해 인체 유래암세포 A549(lung carcinoma ; KCLB 10185), HeLa(cervix uterine denocarcinoma; KCLB 10002), AGS(stomach adenocarcinoma; KCLB 21739), SK-Hep-1 (liver adenocarcinoma;KCLB 30052)를 한국 세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 10% Fetal bovine serum( FBS)와 1% penicillin 및 streptomycin이포함된 RPML1640에서 배양하였다. 능이버섯 추출물의cytotoxicity는 Carmi아iael 등(1987)의 방법에 따라 MTT assay로 실험하였다.
- 식용 및 약용버섯으로 알려진 Sarcodon ㈣9/切姑(능이버섯, 강원도산)을 건조하여 사용하였다. 능이버섯 추출물은자실체 각 100 g를 조분쇄하고 20배의 40% ethanol을 첨가하여 40℃에서 48시간 환류 추출, 여과한 후 50℃에서 감압 농축하여 100 g으로 제조하였으며 0.
데이터처리
- of 4 replications. Significantly different from control at *p*<*0.001 by Student's t-test.
- of 4 replications. Significantly different from control at *p<0.05 and **p<0.01 by Student's t-test.
- of 6 replications. Significantly different from control at *p<0.05, **p<0.01 and 001 by Student 's t-test.
이론/모형
- 따라서, 표준 시료가 동일하지 않아 상대 비교를 할 수 없으나 능이버섯 추출물 역시 상기의 버섯 추출물과 동일하게 혈전 용해활성이 강한 것으로 판단된다. ACE 저해활성 측정은 기질이 ACE의 저해물질로 작용하거나, ACE의 순도에 따라서 혼입될 수 있는 이종의 효소에 의해 ACE 저해물질이 분해 될 수도 있기 때문에 시료와 기질을 ACE와 함께 반응시키는 통상법(General method)과 미리 시료를 ACE와 반응시킨 후 기질을 첨가하여 반응시키는 전처리법(pretreatment method)을 이용하여 분석하였다. 능이버섯 추출물로 ACE 저해 활성을 측정한 결과, Table 1과 같이 통상법에서는 52.
- ACE저해활성은 Cushman과 Cheung(19기)의 방법에 따라 0.3 M NaCl ■ 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)로 녹인 12.5 mM HHL(Hip-Hip-Leus Sigma 4884) 기질 100 uL에 시료 5 uL를 첨가하고 sodium borate buffer 45 uL를 가한 후 37℃에서 5분간 반응시켰다. 반응 후 rabbit lung acetone powder(Sigma L0756)로 제조한 ACE 150 uL를 가하고 다시 37℃, 1시간 반응시킨 다음 0.
- Astrup과 Mullertz(1952) 방법에 따라 0.2% fibrinogen용액 (pH 7.5, borate saline buffer로 제조) 5mL를 혼합하여 제조한 fibrinogen-agarose 용액 에 thrombin 50 uL를 첨 가하여 fibrin plate를 제조하였다. plate에 지름 5 mm의 pasteur pipette로 4개 원형을 만들어 각 시료를 20 uL씩 농도별로 점적하고 37C에서 18시간 동안 반응시킨 후 생성된 clear zone 을 측정하였다.
- Rlois(1958)의 방법에 따라 능이버섯 추출물의 농도별 희석용액 0.2 mL에 4xl0-4 M DPPH( 1, 1 diphenyl-2-picryl-hydrazyl)용으§ 0.8 mL를 가하여 10초간 혼합하고, 상온에서 10분간 방치 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- SOD유사활성은 nitroblue tetrazolium(NBT)의 환원을 억제하는 원리에 의해 측정하였다(Beaucham and Fridovich, 1971). 즉, cuvette에 각 시료용액 50-150 uL를 첨가하고, 5mM xanthine (Sigma.
- bovine serum( FBS)와 1% penicillin 및 streptomycin이포함된 RPML1640에서 배양하였다. 능이버섯 추출물의cytotoxicity는 Carmi아iael 등(1987)의 방법에 따라 MTT assay로 실험하였다. 즉, 5xl04 c이 1/w아1 농도로 96 well plate 에 분주 후 세포가 plate 바닥에 부착될 수 있도록 37℃, 5% CO? incubator에서 16시간 배양하였다.
성능/효과
- 능이버섯 추출물에 의한 돌연변이원성 유무를 확인해 본 결과는 다음과 같다. Salmonella typhimurium TA98에 대한 능이버섯 추출물의 돌연변이원성을 실험한 결과는 Fig. 5와 같이 자연돌연변이수인 54.3±2.3에 비해서 능이버섯 추출물의 첨가농도가 증가할수록 histidine positive revertant colony의 수도 증가하여 2.5 uL/plate에서는 123.0±5.1, 5 uL/pIate에서는 125.0+7.0, 10 uL/plate에서는 167.3 + 2.6 개의 colony를 나타내 p<0.05 이상의 수준에서 유의차 있게 2배 이상 증가함을 알 수 있었다. 또한, Salmonella typhimurium TA 100의 돌연변이원성 결과에서도 자연 돌연변이수 48.
- 7%의 증식 억제를 나타내었다. 그리고 처리농도가 100 mg/mL까지 증가하여도 증식 억제율이 증가하지 않음을 알 수 있었다. 자궁암 세포인 HeLa의 경우 능이버섯 추출물의 세포 증식 억제율은 0.
- ACE 저해활성 측정은 기질이 ACE의 저해물질로 작용하거나, ACE의 순도에 따라서 혼입될 수 있는 이종의 효소에 의해 ACE 저해물질이 분해 될 수도 있기 때문에 시료와 기질을 ACE와 함께 반응시키는 통상법(General method)과 미리 시료를 ACE와 반응시킨 후 기질을 첨가하여 반응시키는 전처리법(pretreatment method)을 이용하여 분석하였다. 능이버섯 추출물로 ACE 저해 활성을 측정한 결과, Table 1과 같이 통상법에서는 52.89 ±1.93%, 전처리법은 57.63±0.61 %로 나타났다. Lee(2002)가 보고한 curry 사용원료 중 ACE저해활성에서 통상법보다 전처리법의 활성이 높게 나타난 것은 본 실험과 일치하였으며, 활성이 가장 강하게 나타난 red paper의 통상법 (52.
- 05 mg/mL 농도에서부터 50%이상의 nitrite 제거활성을 나타내었으며, 농도 의존적으로 증가하였다. 능이버섯 추출물의 경우 0.5 mg/mL에서는 99.14±1.86% 의 높은 활성을 나타내어 대조군으로 사용한 0.1 mg/mL vitamin C 및 butyrated hydroxy toluene(BHT)의 nitrite 제거 활성 99.64±0.09%, 98.35±0.11%과 유사하였고, 0.1 mg/mL 에서는 89.06±0.74%로 천연 항산화제로 사용되는 vitamin E의 67.22±1.63% 보다 활성이 높음을 알 수 있었다. Kim 등(2001)은 팽이버섯 및 마늘, 녹차, allspice, 하수오, 오미자, 행인, 솔잎에 대한 nitrite 제거활성 실험에서 각각의 에탄올 추출물은 pH 1.
- 능이버섯 추출물의 첨가가 2.5% linoleic acid의 자동산화속도에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 3과 같이 0.01 mg/mL 이상의 모든 농도에서 p<0.001 수준으로 유의성 있게 linoleic acid의 자동산화를 억제하는 것으로 나타났다. 특히, 0.
- 활성화된 thrombin에 의해 fibrinogen이 fibrin으로 전환되어 생성된 혈전은 plasmin과 같은 혈전용해효소에 의해 용해된다. 능이버섯 추출물의 혈전용해 활성을 측정한 결과 표준시료인Streptokinase(제일제당) 1, 180 unit/g 보다 높은 1, 843.8 unit/g 의 활성을 나타냈다. Choi 등(1999)은 Daedaleopsis styra- cina, Trichaptum abietium, Coriolus versicolor, Pisolithus tinctorius 그리고 Tricholomopsis decora 버섯주줄액의 혈전 용해 효소 활성을 측정한 결과, 대조구로 사용한 plasmin 1.
- Kim 등(2001)은 식물체 추출물 중 녹차 및 allspice, 오미자, 하수오 등이 50% 이상의 전자공여효과를 나타냈다고 발표했고, Kang 등(1996)은 전자공여 능이 phenolic acids와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화작용의 지표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 큰 것 일수록 전자공여능이 높다고 하였다. 따라서 능이버섯 추출물의 전자공여효과가 우수하여 산화성 생물활성 free radical에 전자를 공여하여 산화를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
- 01 수준에서 유의차 있게 2배 이상 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 능이버섯 추출물은 Salmonella typhimurium TA98 및 TA100에 대한 돌연변이원성이 존재하는 것으로 확인되었다. Bae와 Lee(2000)는 능이버섯 추출물을 이용하여 돌연변이원성유무를 확인한 결과 시료자체에 의한 돌연변이원성은 존재하지 않는다고 보고하였는데, 이는 항돌연변이 실험 결과에서 추출용매에 따른 억제효과가 각각 달리 나타난 것과 비교해 볼 때, 돌연변이원성의 차이는 능이버섯의건조상태, 추출용매와 처리 농도 차이, 혹은 보관방법 등에 영향을 받았을 것으로 사료된다.
- 2 mg/mL의 농도에서 울금 및 구기자, 산조인, 약쑥, 당귀, 산조인 등의 항산화력은 우수하여, 대조구인 vitamin E나 rosemary 보다 월등히 높은 항산화력을 보였다고 보고하였다. 따라서, 능이버섯 추출물의 경우 황백 추출물이나 울금, 구기자 등의 생약 추출물과 동등 수준의 항산화활성을 보유한 것으로 나타났다.
- 05 이상의 수준에서 유의차 있게 2배 이상 증가함을 알 수 있었다. 또한, Salmonella typhimurium TA 100의 돌연변이원성 결과에서도 자연 돌연변이수 48.5±9.7보다 모든 농도에서 histidine positive revertant colony의 수가 p<0.01 수준에서 유의차 있게 2배 이상 증가함을 알 수 있었다. 따라서, 능이버섯 추출물은 Salmonella typhimurium TA98 및 TA100에 대한 돌연변이원성이 존재하는 것으로 확인되었다.
- 이와 같은 결과는 버섯추출물의 처리 농도가 증가하면서 함유되어 있는 색소 물질의 농도 역시 증가하여 세포독성 측정에 사용되는 MTT 시약에 영향을 끼쳐 실제 세포독성은 증가하였더라도 흡광도가 높게 나타났기 때문으로 판단된다. 위암 세포주인 AGS 에대한 세포독성 실험결과 0.01의 농도에서는 증식억제 효과가 없었으며, 0.1 mg/mL에서는 6% 미 만의 낮은 증식억제율을 보였고, l~50mg/mL의 농도를 처리했을 경우에는 68.5~70.8%의 유사한 증식 억제율을 나타내었으며, 그 이상의 농도에서는 억제효과가 감소하는 것으로 나타났다. 간암 세포주인 SK-Hep-1에 대한 세포독성 실험결과 능이버섯의암세포 증식 억제율은 HeLa에서 보였던 능이버섯의 증식 억제율과 비슷한 경향을 나타냈다.
- 또한, Jung과 Lee(1998)은 석이버섯 중의 다량의 페놀성 화합물이 nitrite 제거활성이 있다고 보고하였다. 이와 같은 결과로 볼 때, 능이버섯 추출물의 경우 팽이 및 석이버섯보다 높은 nitrite 제거활성을 가지고 있으며 동일 농도에서는 녹차추출물보다 강한 활성을 보일 것으로 판단된다. 능이버섯의 경우 다른 버섯류에 비해 강한 향과 진한 색상을 가지고 있어 nitrite 제거활성에 관련된 폴리페놀 성분의 함량이 높은 것으로 판단되며 이에 따라 강한 활성을 보유한 것으로 생각된다(Kang et al.
- 그리고 처리농도가 100 mg/mL까지 증가하여도 증식 억제율이 증가하지 않음을 알 수 있었다. 자궁암 세포인 HeLa의 경우 능이버섯 추출물의 세포 증식 억제율은 0.01 mg/mL의 농도에서는 오히려 세포 증식이 촉진되었으나 1.0 mg/mL에서는 51.2%, 5 mg/mL에서는 55.3%로 나타났으며, 그 이상의 농도에서는 증식 억제율이 감소하는 것으로 나타났다. 이와 같은 결과는 버섯추출물의 처리 농도가 증가하면서 함유되어 있는 색소 물질의 농도 역시 증가하여 세포독성 측정에 사용되는 MTT 시약에 영향을 끼쳐 실제 세포독성은 증가하였더라도 흡광도가 높게 나타났기 때문으로 판단된다.
- 1 mg/mL 이상에서는 농도에 영 향을 받지 않았다. 전자공여 활성은 free radical을 환원시 킴으로서 산화를 방지하는 항산화활성과 관련이 있기 때문에 식품에 산화방지를 목적으로 사용되는 대조군을 사용하여 실험한 결과 0.1 mg/mL 농도에서 vitamin C가 95.36%로 가장 높았고, vitamin E 역시 92.56±0.04%로 높게 나타났으나 합성 항산화제 인 BHT의 경우 전자공여 활성이 약 50% 수준으로 낮게 나타났다. Kim 등(2001)은 식물체 추출물 중 녹차 및 allspice, 오미자, 하수오 등이 50% 이상의 전자공여효과를 나타냈다고 발표했고, Kang 등(1996)은 전자공여 능이 phenolic acids와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화작용의 지표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 큰 것 일수록 전자공여능이 높다고 하였다.
- 1에 나타내었다. 즉, nitrosamine 생성 최적조건인 pH 1.2 에서 반응시킨 경우, 능이버섯 추출물의 경우 0.05 mg/mL 농도에서부터 50%이상의 nitrite 제거활성을 나타내었으며, 농도 의존적으로 증가하였다. 능이버섯 추출물의 경우 0.
- 2에 나타내었다. 즉, 능이버섯 추출물의 경우 전자공여효과가 0.1 mg/mL에서 90.42±0.54%로 가장 높게 나타났고, 농도 의존적으로 활성이 증가하였으나, 0.1 mg/mL 이상에서는 농도에 영 향을 받지 않았다. 전자공여 활성은 free radical을 환원시 킴으로서 산화를 방지하는 항산화활성과 관련이 있기 때문에 식품에 산화방지를 목적으로 사용되는 대조군을 사용하여 실험한 결과 0.
- 간암 세포주인 SK-Hep-1에 대한 세포독성 실험결과 능이버섯의암세포 증식 억제율은 HeLa에서 보였던 능이버섯의 증식 억제율과 비슷한 경향을 나타냈다. 즉, 저 농도 O.Olmg/mL 에서는 18.5%의 증식 촉진효과를 나타냈으며 0.1 ~5 mg/mL의 농도처리 시 농도 의존적으로 증식 억제율이 42.5%까지 증가하였으나 그 이상의 농도처리 시에는 감소하는 경향을 보였다. 영지버섯의 새로운 약효성분의 개발에 관한 보고에서 Bok 등(1994)은 간암세포 Sk-Hep-1에 대한 MTT assay 결과 100 ug/mL의 농도에서 중성분획인 클로로포름층의 세포 증식억제 효과가 90.
- 4와 같다. 즉, 폐암 세포주인 A549에 대한 세포독성 실험결과 능이버섯 추출물의 증식 억제율은 같이 처리 농도 1 mg/mL 이하에서는 세포의 증식을 촉진하는 것으로 나타났으나, 5 mg/mL에서는 78.9%, 50 mg/mL에서는 84.7%의 증식 억제를 나타내었다. 그리고 처리농도가 100 mg/mL까지 증가하여도 증식 억제율이 증가하지 않음을 알 수 있었다.
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