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문제 정의
- 본 연구는 능이버섯의 식품영양학적 및 기능성을 평가하기 위하여 능이버섯의 화학성분과 추출물에 대한 생리활성을 확인하였다. 능이버섯은 수분 85.
- 이에 본 연구에서는 능이버섯의 식품학적 품질을 평가하기 위하여 일반성분, 무기질, 유리 아미노산, 지방산, 유기산 및 유리당 등의 화학성분을 분석하고 자실체의 메탄올 추출물을 통한 전자 공여능, 아질산염의 소거 효과, 간 지질에 대한 과산화 억제 효과, linoleic acid에 대한 항산화력 및 항암 활성 등의 생리활성을 검정함으로써 기능성 식품 소재로서의 이용 가능성을 알아보기 위하여 연구하였다.
제안 방법
- Sulfosalicylic acid 0.5 g을 넣고 잘 혼합한 후 암실에서 1시간 방치하고, 이 추출액을 0.45 μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge로 여과한 후 아미노산 자동분석기 (Pharmacia Chrom20, Sweden)로 분석하였으며 모든 실험은 3회 반복 실시하였고 mean±S.D.로 나타내었다.
- inoleic acid에 대한 항산화력 능이버섯 추출물의 항산화 효과를 linoleic acid의 과산화 물값(peroxide value, POV)을 측정하여 in vitro로 관찰하였다(27). 즉, 삼각플라스크에 linoleic acid 1 mL, carbonyl을 제거한 ethanol 20 mL 및 능이버섯 추출물 0.
- 2로 조정한 후 반응용액의 부피를 10 mL로 하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 그리고 반응액 1 mL에 2% 초산용액 5 mL를 첨가한 다음 Griess 시약 0.4 mL를 가하여 혼합하고 15분 방치후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였는데, 공시험구는 NaNO2 용액 대신에 증류수를 첨가하여 측정하였으며, 소거율은 다음 식에 의해 제거된 아질산염의 백분율로 나타내었다.
- 능이버섯 100 mg에 증류수 10 mL를 가하고 잘 섞은 후 30℃의 incubator에서 1시간 방치한 후 원심분리(10,000 rpm, 10분)하여 상징액을 0.2 μm membrane filter로 여과한 후 여과액을 칼럼에서, HPLC(LC 10A, Shimadzu Co, Kyoto, Japan)로 분석하였으며(23) 모든 실험은 3회 반복 실시하였고 mean±S.D.로 나타내었다.
- 능이버섯 메탄올 추출물의 linoleic acid에 대한 항산화력은 linoleic acid에 능이버섯 메탄올 추출물을 첨가한 후 50℃에서 7일간 저장하면서 과산화물가를 측정하였는데, 그 측정한 결과는 Fig. 4와 같았다. 능이버섯 메탄올 추출물을 첨가하지 않은 대조구는 저장 1, 3, 5 및 7일 후에 과산화물가(POV)가 34.
- 능이버섯 추출물의 지질과산화 억제효과를 흰쥐의 liver homogenate를 사용하여 in vitro로 관찰하였다(26). 즉, 흰쥐의 간장을 적출하여 phosphate buffer(pH 7.
- 능이버섯의 메탄올 추출물에 대한 항산화 효과를 측정하기 위하여, 흰쥐의 간 지질에 능이버섯 메탄올 추출물을 첨가한 다음 42℃에서 72시간 동안 저장한 후 TBA값을 측정한 결과는 Fig. 3과 같았다. 흰쥐의 간 지질에 대한 TBA가는 능이버섯 메탄올 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서 3,306 μmol MDA/g liver이었고, 능이버섯 메탄올 추출물을 500-1,500 μg/mL 농도별로 첨가한 시험구들의 TBA가는 2,783-2,347 μmol MDA/g liver 범위로서 모두 대조구에 비하여 낮게 나타나 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 무기질 함량은 전처리한 시료 용액을 원자흡광분광광도계(Varian spectra AA-30, ds-15 data statin, USA)에 주입하여 분석하였으며 모든 실험은 3회 반복 실시하였고 mean±S.D.로 나타내었다.
- 배양이 종료된 후, 50 μL의 cold 50% TCA를 위에서부터 천천히 가해주고 TCA가 바닥에 가라앉도록 잠시 기다린 후 조심스럽게 냉장고로 옮겨 1시간 동안 충분히 고정시키고 고정이 끝난 후에는 증류수로 5회 이상 세척하여 잘 건조시키고 나서 각 well에 1% 빙초산에 녹인 0.4% SRB용액 100 mL을 가하여 상온에 30분 이상 염색하였다.
- 시료의 추출은 능이버섯 500 g을 정량하고 조분쇄 한 후, methanol 2,000 mL로 37℃ 12시간 진탕 2회 반복한 뒤 여과하여 감압 농축하여 100mL로 제조하였으며 0.22 μm membrane filter로 제균한 후 -20℃ 이하에서 보관하면서 사용하였다.
- 여과한 액을 모아서 0.2 μm membrane filter와 Sep-pak C18 cartridge로 여과한 후 칼럼에서, HPLC(Shimadzu LC 10A)로 분석하였으며(23) 모든 실험은 3회 반복 실시하였고 mean±S.D.로 나타내었다.
- 조단백질은 능이버섯 2 g에 진한 황산 20 mL과 촉매제 3 g (K2SO4:CuSO4 = 9:1)을 넣고 분해시킨 후, 증류장치에서 증류 및 중화시켜서 0.1 N NaOH로 적정하였으며, 조지방은 능이버섯 2 g을 취하여 Soxhlet 추출기로 추출하여 남은 에테르를 증발시켜 제거하고 100℃ 오븐에서 항량이 나올 때까지 건조시켜 계산하였으며 모든 실험은 3회 반복 실시하였고 mean±S.D.로 나타내었다.
- 일반성분의 함량은 일반 상법에 준하여 실시하였다(21). 즉, 수분은 능이버섯 2.5 g을 채취하여 105℃ 상압건조를 행하였고, 회분은 능이버섯 1 g을 채취하여 500℃ 직접 회화법으로 실시하였다. 조단백질은 능이버섯 2 g에 진한 황산 20 mL과 촉매제 3 g (K2SO4:CuSO4 = 9:1)을 넣고 분해시킨 후, 증류장치에서 증류 및 중화시켜서 0.
- 능이버섯 추출물의 지질과산화 억제효과를 흰쥐의 liver homogenate를 사용하여 in vitro로 관찰하였다(26). 즉, 흰쥐의 간장을 적출하여 phosphate buffer(pH 7.4)로 균질화한 다음 균질액에 H2O2(1 M)와 FeSO4(50 mM) 및 능이버섯 추출물 0.05 mL를 가하여 37℃에서 40분간 배양한 후 생성된 TBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)를 측정하였다.
- 지방산 조성의 분석은 능이버섯 1 g과 Folch용액 (chloroform:methanol = 2:1, v/v) 100 mL을 혼합하여 마쇄기로 마쇄한 후 질소 충진전에 밀봉하여 실온에서 2시간 교반한 다음 여과하였다. 여과액을 분액 깔대기에 옮기고 증류수 100 mL를 가한 후 서서히 혼합한 다음, 냉장고(4℃)에서 두 층이 분리될 때까지 방치한 후, 아래층을 취해서 회전진 공농축기(35℃)에서 농축시켰다.
대상 데이터
- 암세포 배양 : 인체 고형암 세포주인 A549 (human lung carcinoma), 1종을 한국 세포주 은행에서 분양받아 실험에 사용하였다. A549 세포주를 10%의 송아지 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 1주일에 1-2회 계대 배양하면서 실험에 사용하였다. 플라스크의 바닥에 부착되어 있는 세포를 떼어내는 데는 0.
- 8 mL를 가하여 10 초간 혼합하고, 상온에서 10분간 방치한 후 525 nm에서 UV/Vis-spectrophotometer로 측정하였다. 대조구로는 0.1% BHT 용액을 사용하였다.
- 본 연구에 사용한 능이버섯(Sarcodon aspratus)은 거창군 일원에서 생산된 것을 구입하여 상태가 우수한 것을 선별한 후 4℃ 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
- 암세포 배양 : 인체 고형암 세포주인 A549 (human lung carcinoma), 1종을 한국 세포주 은행에서 분양받아 실험에 사용하였다. A549 세포주를 10%의 송아지 혈청(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 1주일에 1-2회 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
이론/모형
- 능이버섯 추출물에 대한 아질산염소거의 효과는 Gray 등의 방법(25)에 준하여 다음과 같이 측정하였다. 즉, 1 mM NaNO2 1 mL에 능이버섯 추출물 0.
- 능이버섯 추출물에 대한 전자 소거능은 Blois(24)의 방법에 따라 농도별 희석용액 0.2 mL에 4×10-4 M DPPH (1,1-diphenyl-β-picrylhydrazine) 용액 0.8 mL를 가하여 10 초간 혼합하고, 상온에서 10분간 방치한 후 525 nm에서 UV/Vis-spectrophotometer로 측정하였다.
- 암세포 성장 억제효과 : 세포증식 정도를 SRB assay법 (28)과 Cell ,Titer 96 Aqueous One Solution Cell proliferation Assay에 따라 측정하였다. Monolayer로 배양중인 암세포주를 0.
- 일반성분의 함량은 일반 상법에 준하여 실시하였다(21). 즉, 수분은 능이버섯 2.
성능/효과
- 각각의 용매 분획물을 1 μg/mL, 10 μg/mL 및 100 μg/mL 농도로 처리한 결과 약간의 성장억제효과 있음을 확인하였다.
- 4와 같았다. 능이버섯 메탄올 추출물을 첨가하지 않은 대조구는 저장 1, 3, 5 및 7일 후에 과산화물가(POV)가 34.6, 67.5, 140.4 및 218.6 meq/kg이었는데, 능이버섯의 메탄올 추출물을 첨가한 시험구에는 저장 7일 후에 POV가 197.4 meq/kg이하로서 대조구에 비하여 약간의 항산화효과가 있었다. Jung 등(37)은 느타리버섯 자실체 및 균사체 추출물의 항산화 효과에서 각 용매별 3,000 ppm농도를 첨가하여 대조간 비교구(BHA 및 BHT 처리군)에 비하여 과산화물가가 낮았으며, 특히 ethanol분획에서 강한 산화능이 확인되었다고 보고하였다.
- 능이버섯 메탄올 추출물의 200-800 μg/mL 농도별로 첨가한 아질산염 소거능은 48.1-77.8% 범위를 나타내어, 농도 의존적으로 증가하였다.
- 능이버섯 메탄올 추출물의 전자 소거능은 0.1% BHT를 첨가한 것의 95.4%보다는 그 효과가 낮게 나타났지만(29.5-46.2%), 추출물의 농도(200-800 μg/mL) 증가에 따라 약간씩 증가하는 효과를 나타내었다.
- 능이버섯 추출물에 대한 전자 소거능 및 아질산염 소거능은 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하였고, 800 μg/mL 처리 시 각각 46.2% 및 77.8%로 가장 높게 나타났다.
- 능이버섯 추출물은 역시 농도가 증가함에 따라 간 지질에 대한 과산화 억제 활성이 증가하였고, 1,500 μg/mL 처리 시 2,347 μmol MDA/g liver로 가장 높게 나타났다.
- 본 연구는 능이버섯의 식품영양학적 및 기능성을 평가하기 위하여 능이버섯의 화학성분과 추출물에 대한 생리활성을 확인하였다. 능이버섯은 수분 85.73%, 조단백질 1.78%, 조지질 1.87%, 회분 1.27%로 나타났으며, 아미노산 중 alanine(90.11 mg%), 지방산 중 linoleic acid(39.09 mg%), 유기산 중 tartaric acid(75.47 mg%) 및 유리당 중 glucose (1,680 mg%)의 함량들이 가장 높게 나타났다. 능이버섯 추출물에 대한 전자 소거능 및 아질산염 소거능은 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하였고, 800 μg/mL 처리 시 각각 46.
- 능이버섯의 무기질 함량은 아래의 Table 2와 같이 칼륨 (1,024.25 mg%), 나트륨(238.90 mg%)이 매우 풍부할 뿐만 아니라 인(101.50 mg%), 마그네슘(25.55 mg%), 칼슘(61.25 mg%) 등 각종 무기질 함량이 높게 함유되어 있었다. Lee등(15)의 보고에서도 칼륨과 나트륨의 순으로 함량이 높게 나타났다.
- 능이버섯 추출물은 역시 농도가 증가함에 따라 간 지질에 대한 과산화 억제 활성이 증가하였고, 1,500 μg/mL 처리 시 2,347 μmol MDA/g liver로 가장 높게 나타났다. 능이버섯추출물을 첨가하여 linoleic acid에 대한 항산화 활성을 살펴본 결과, 저장 7일 후에 POV가 197.4 meq/kg이하로서 대조구에 비하여 약간의 항산화효과가 있었다. 암세포에 대한 능이버섯 메탄올 추출물의 세포독성에서, 폐암 세포주인 A549에 대한 증식 억제율은 능이버섯 메탄올 추출물 100 μg/mL 처리 시 96%로 가장 높게 나타났다.
- 버섯에서 칼륨의 함량이 다른 무기성분에 비해 많은 결과는 싸리버섯의 무기성분 함량을 보고한 Seoh 등(30)의 결과와 Hideo 등(31)의 결과 및 영지버섯의 무기성분 함량을 보고한 Chung 등(32)의 결과와 일치하였다. 또한 유해한 활성 산소 저해에 관여하는 아연, 망간 등의 함량도 소량이지만 존재하고 있어 항산화 작용도 높을 것으로 추정되었다.
- 능이버섯의 일반성분을 분석한 결과는 아래의 Table 1과 같았다. 수분함량은 85.73%, 조단백질은 1.78%, 조지질은 1.87%, 회분양은 1.27%, 탄수화물은 9.34%로 나타났다. Lee 등(15)이 능이버섯의 일반성분을 분석한 결과와는 조단백질 함량이 약간 낮고 조지방 함량이 약간 높게 나타났는데 이는 능이버섯의 생산지 환경에 따라 약간씩의 함량 차이가 나는 것으로 사료된다.
- 4 meq/kg이하로서 대조구에 비하여 약간의 항산화효과가 있었다. 암세포에 대한 능이버섯 메탄올 추출물의 세포독성에서, 폐암 세포주인 A549에 대한 증식 억제율은 능이버섯 메탄올 추출물 100 μg/mL 처리 시 96%로 가장 높게 나타났다.
- 능이버섯에 함유되어 있는 유리아미노산의 함량을 분석한 결과는 Table 3과 같았다. 총 아미노산의 함량이 862.71 mg%로 상당히 높게 나타났으며, alanine(90.11 mg%), arginine(78.31 mg%), lysine(78.31 mg%), valine(73.29 mg%) 등의 함량이 높게 나타났다. Lee 등(15)은 alanine(117.
- 능이버섯의 유기산을 분석한 결과는 Table 5와 같았다. 총 유기산 함량은 169.95 mg%로 tartaric acid(75.47 mg%), malic acid(59.46 mg%), oxalic acid(35.02 mg%) 순으로 함량이 많았다. 다른 버섯과 비교해볼 때 큰 유의적인 함량 차이는 나타나지 않았으며 이는 버섯류에는 유기산의 함량이 높지 않기 때문인 것으로 판단된다.
- Lee 등(15)이 능이버섯의 일반성분을 분석한 결과와는 조단백질 함량이 약간 낮고 조지방 함량이 약간 높게 나타났는데 이는 능이버섯의 생산지 환경에 따라 약간씩의 함량 차이가 나는 것으로 사료된다. 표고버섯과 느타리버섯과 비교해볼 때도 수분함량은 약간 낮게 나타났으며, 조지방 및 조단백질 함량은 큰 유의적인 차이는 없는 것으로 나타났다.
- 능이버섯의 지방산을 분석한 결과는 Table 4와 같았다. 필수지방산인 linoleic acid(39.09 mg%)의 함량이 높게 나타났으며 특히 어류에 많이 함유되어있는 고도불포화지방산에 속하는 archidonic acid의 함량이 높게 나타난 것이 특이적이였다.
- 흰쥐의 간 지질에 대한 TBA가는 능이버섯 메탄올 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서 3,306 μmol MDA/g liver이었고, 능이버섯 메탄올 추출물을 500-1,500 μg/mL 농도별로 첨가한 시험구들의 TBA가는 2,783-2,347 μmol MDA/g liver 범위로서 모두 대조구에 비하여 낮게 나타나 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다.
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