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문제 정의
- 밀 단백질 에 효소가수분해 할 때 생산되 는 peptide의 항균 활성과 천연항균제로서의 이용가능성을 검토하기 위하여 실험을 행하였다. 밀 단백질에 7종의 단백질가수분해효소를 작용 시켜 생성된 가수분해물의 항균활성을 측정하고 한외여과, membrane filtration, HPLC를 이용하여 항균성 peptide 를 분리 정제한 후 분자량과 아미노산 결합순서를 측정한 결과는 다음과 같다.
- 본인 등은 가격이 저렴한 밀 단백질을 기질로 저분자 peptide 을 제조하여 실용적이고 인체에 무해한 항균제를 개발하고 식품소재로 이용가능성을 조사하기 위하여 밀 단백질인 glu ten^] Aspergillus saitoiA 분비하는 protease를 가하여 반응시키고 얻어진 peptide를 분자량별로 분획하고 분자량별 항균 활성 분획을 HPLC로 분취하여 얻어진 peptide의 아미노산 결합순서를 분석하여 새로운 결과를 얻었으므로 보고하는 바이다.
제안 방법
- 75% 한천 함유 nutrient 배지에 항균활성 피검균주를 10〃mL의 농도가 되도록 가하여 중층 둥卜였다. 이에 paper disc에 항균활성 피검 용액을 10 UL loading 하고 건조한 후 반복하여 10회 loading한 후 nutri ent agar 배지위 에 놓고 멸균수 70 "L를 가하여 4℃의 냉장고에서 1시간 방치하여 paper disc를 고정시켜 확산되도록한 후, 37℃에서 48시 간 배 양하면서 paper disc 주위의 clear zone직경을 측정하여 항균력을 측정하였다.
- Gel filtration : 효소 가수분해 물의 항균성 물질을 Seph- adex-G 25로 여 과하여 3 mL씩 분취 하고 220 nm, 280 nm에서 흡광도를 측정하고 각 분취 물을 모아 polyethylene gly col 6, 000으로 농축하여 항균활성을 측정하였다. 그 결과는 Fig.
- 있었다. Gel 여과는 ultrafiltration membrane 에 비하여 효율적으로 분획이 어렵기 때문에 차후의 실험에서는 membrane filter를 이용하여 분획하였다.
- Gluten 10 g, 증류수 100 m丄를 삼각 플라스크에 넣고 80℃ 에서 10분간 열 처리한 후, 이에 단백질 효소 분말 50 mg을넣어 37℃에서 6시간 진탕 반응시켜 80℃에서 5분간 열처리하여 효소를 파괴시킨 후 8, 000xg에서 30분간 원심분리하여 상징액을 항균활성 측정용 시료로 하였다.
- Gluten 효소 가수분해 물을 HPLC로 분취 하여 각 분획 물의 mass spectrum을 applied biosystem MALDI-TDF, STR Voyager mod이, Matrix: -cyanohydroxy cinnamic acid, reflector mode, accelerating voltage: 25, 000 V의 조건으로 분석하였다.
- High perfonnance liquid chromatography : 효소 가수분해물을 분자량 3, 000 cut-off membrane filter로 여과하여 얻어진 여 액의 HPLC chromatogram는 Fig. 4와 같았으며 여러 차례로 반복하여 분취하고 이의 항균활성을 측정하였다.
- High performance liquid chromatography 의 한 항균성 peptide의 분리 - Gluten 효소 가수분해물을 분자량 3, 000 이하의 membrane filter로 여과하여 이를 Table 1과 같은 HPLC 분석 조전에서 Table 2에서와 같이 gradient 하였으며 유출시간별 유출물을 분획수집기로 수집하여 질량과 항균활성을 측정하였다.
- Sephadex G-25 겔 여 과 : 항균활성 을 가지 고 있는 분자량 3, 000이하의 것을 Sephadex G~25가 충진된 column(18 mm X750 mm)에 loading하고 3 mL씩 분획하여 220 nm, 280 nm에서 흡광도와 이 분획 물을 동결 건조하여 상기와 같은 방법으로 항균활성을 측정하였다.
- 밀 gluten에 Asp. saitoi protease로 작용시 킨 가수분해 물의 항균성 물질을 분리, 정제하기 위 하여 ultrafiltration 분획, gel 여과, HPLC를 행한 결과는 다음과 같았다.
- 행하였다. 밀 단백질에 7종의 단백질가수분해효소를 작용 시켜 생성된 가수분해물의 항균활성을 측정하고 한외여과, membrane filtration, HPLC를 이용하여 항균성 peptide 를 분리 정제한 후 분자량과 아미노산 결합순서를 측정한 결과는 다음과 같다. 밀 단백질에 7종의 단백질 분해효소를 적용 시 켜 제조한 가수분해 물중 Asp.
- 밀 단백질인 gluten, Aspergillus saitoi protease(EC 3.4.23.18, 1.0 units/mg), pepsin(porcine stomach, EC 3.4.23.1, 1.0 units/mg), trypsin(porcine pancreas, EC 3.4.21.41, 1.0 units/mg), a-chymotrypsin(bovine pancreas, EC 3.4.21.1, 51.0 units/mg), bromelain(pineapple stem, EC 3.4.22.32, 3.5 units/mg), Strypomyces griseus protease, Bacillus lichen- ifomis protease는 Sigma사 제품을 사용하였으며 ultrafilteratin cell(Amicon) 과 membrane은 regenerated cellulose(molecular weight cut-off 10, 000 3, 000 1, 000) Millipore사 제품, Sepha dex G-25는 Pharmacia사 제품 항균활성 측정 용 paper disc (9 mm)는 Toyorhoshi사 제품, 기 타 시 약은 특급 분석 용 시약을 사용하였다.
- 항균성 peptide의 분자량 별 분획 : Membrane filter (molecular weight cut-off 10, 000, 3, 000, 1, 000)가 장착된 Amicon kit에 효소 반응액을 넣고 질소가스로 60 psi 압력을가중卜여 분자량(10, 000 이상, 10, 000~3, 000, 3, 000 이하) 별로분획하고 항균활성을 측정하였다.
- 항균활성 을 가지 는 가수분해물로부터 분자량 3, 000 이 하를 분획 하여 용액상태로 한 다음 80℃에서 10분, 에서 10분, 에서 15분 열처리하여 항균활성을 측정하였다.
- 항균활성 을 가지는 gluten 가수분해 물을 용액 상태로 한 다음, 80℃에서 10분간, 100℃에서 10분간, 121℃에서 15분간 각각 열처리한 후, Gram-positive 세균의 항균활성을 측정하고 열에 대 한 안정 성 을 비 교하였다. 그 결과는 Table 9와 같았다.
대상 데이터
- 항균활성 측정 용 균주는 Escherichia coli ATCC 10536, Staphylococcus aureus ATCC 6633, Streptococcus faecalis ATCC 13301, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894, Ba cillus subtilis ATCC 11778, Salmonella typhimurium ATCC 14028을 사용하였다.
이론/모형
- Gluten의 효소 가수분해 물을 HPLC로 분취 하여 항균 활성을 나타내는 peak 분획 물의 아미노산 결합순서 를 Hewlett Packard G 1000A automated protein sequencer, automated Edman chemistry 에서 liquid peptide sample을 2% TFA (triiluoroacetic acid)로 loading중卜여 method 3.5 방법으로 분석하였다.
- 방법으로 측정 하였다. 즉, 100 n丄의 물에 gluten 10 g을넣어 현탁시키고 micro-Kj이dahl 법(30)에 따라 질소를 정량하고 효소로 작용시 킨 gluten 가수분해 물 10 mL에 동량의 20% TCA 용액을 가하고 10, 000xg에서 15분간 원심분리하여 상징 액 중의 질소를 정 량하여 다음과 같이 가수분해율을 표시하였다.
- 항균활성은 paper disc법(31)으로 측정하였다. Nutrient broth에 1.
- 효소에 의 한 gluten의 가수분해정 도는 Yamashita 등(29) 의 방법으로 측정 하였다. 즉, 100 n丄의 물에 gluten 10 g을넣어 현탁시키고 micro-Kj이dahl 법(30)에 따라 질소를 정량하고 효소로 작용시 킨 gluten 가수분해 물 10 mL에 동량의 20% TCA 용액을 가하고 10, 000xg에서 15분간 원심분리하여 상징 액 중의 질소를 정 량하여 다음과 같이 가수분해율을 표시하였다.
성능/효과
- Fig. 2에서 보는 바와 같이 분자량 1000이상의 분 획에서 항균 활성이 있었고 1000이하에서는 항균활성이 나타나지 않는 점으로 보아 분자량 1000 ~ 3000의 peptide가 항균활성 이 있는 것으로 확인할 수 있었다. 각 분획물의 수률은 효소 반응 원액이 반응 기질에 대하여 56.
- Gluten 효소 가수분해물의 gel 여과 유출물을 peak 별로 동량 분취 하여 항균활성을 측정한 결과 F2 분획 에서 항균 활성을 확인할 수 있었다. Gel 여과는 ultrafiltration membrane 에 비하여 효율적으로 분획이 어렵기 때문에 차후의 실험에서는 membrane filter를 이용하여 분획하였다.
- 가수분해시킨 것이 가장 높았으며 효소의 종류에 따라 항균활성에 심한차이가 있었다. Gluten에 미생물 기원의 단백질 가수분해 효소를 작용하였을 때 항균성 peptide을 생산하는 것으로 보아, 밀 단백질가수분해 물은 곰팡이 protease를 이 용하는 고 단백질 식 품의 보존에 유용한 보존제로서의 가능성이 있을 것으로 생각되었다. Tomita 등(21)은 인간 및 소의 lactoferrinpepsin을 작용 시켜 얻어진 peptide 물질을 lactofeiricin이라 명명하고 Gram-positive, Gram-negative 균주에 대하여 강한 항균 활성을 나타내었다고 보고한 바 있다.
- Gluten을 가수분해 하였을 때 생산되는 항균성 peptide의 열에 대한 안정성을 실험해 본 결과, 열에 대해 대단히 안정함을 알 수 있었다. 즉, 100℃에서의 열처리와 121℃에서 15 min 열처리에 의해서도두균주의 생육저해환의 크기가 대조 구와 비 슷한 것 으로 보아 gluten의 Aspergillus saitoi pro tease 가수분해물은 열에 매우 안정하였다.
- Gluten의 효소적 가수분해 물의 HPLC 유출물을 retention time 1~3분 간격으로 반복하여 분획한 다음 항균 활성을 측정한 결과 retention time 31.1 ~31.8 min에서 활성이 나타났다.
- 밀단백 효소가수분해물은 membrane filtration에 의 하여 분자량 1, 000~3, 000에서 항균활성 이 나타났다. Membrane filtration 으로 얻어진 항균활성분획을 HPLC로 분리한 결과 retention time3Ll~3L8min에서 항균활성을 나타내었다. 밀단백 효소 가수분해물은 12FC에서 15분간 가열하여도 효소 활성이 유지되는 매우 안정한 화합물이었다.
- Manachini 등 (26)의 Bac. licheniformis protease가 50~60℃에서 잘 작용한다는 보고와 비교해 볼 때, 효소의 종류에 따른 작용 최적 온도가 각기 다름을 알 수 있었다.
- 항균력은 Asp saitoi protease^. 가수분해시킨 것이 가장 높았으며 효소의 종류에 따라 항균활성에 심한차이가 있었다. Gluten에 미생물 기원의 단백질 가수분해 효소를 작용하였을 때 항균성 peptide을 생산하는 것으로 보아, 밀 단백질가수분해 물은 곰팡이 protease를 이 용하는 고 단백질 식 품의 보존에 유용한 보존제로서의 가능성이 있을 것으로 생각되었다.
- 2에서 보는 바와 같이 분자량 1000이상의 분 획에서 항균 활성이 있었고 1000이하에서는 항균활성이 나타나지 않는 점으로 보아 분자량 1000 ~ 3000의 peptide가 항균활성 이 있는 것으로 확인할 수 있었다. 각 분획물의 수률은 효소 반응 원액이 반응 기질에 대하여 56.8%, 분자량 10, 000 이하의 분획 물이 32.6%, 분자량 3, 000이 하 분획 물이 26.3%, 분자량 1, 00() 이 하의 분획 물이 20.5%로서 비교적 높은 수준이 었다.
- 또한, 가수분해물과 membrane filter 여과물에 공존하고 있는 peptide의 분포를 확인하기 위 하여 membrane filter로 여과 시켜 본 결과 분자량 cur-off 별로 분획되 었음을 알 수 있었으며 콩단백질 가수분해물의 분자량 분포(32, 33)가 다른 경향을 나타내었다.
- 03 으로 측정되었다. 본 실험에서 얻어진 항균성 물질의 질량은 Dionysius 등(20)이 보고한 lactoferrin의 질량 3, 195 2, 673 5, 851보다 적 었으며 Pellegrini 등(22)이 보고한 lactoglubu- lin의 trypsin 가수분해물인 항균성 peptide보다는 큰 것이었다. 또한, 항균성 peptide의 아미 노산 결 합 순서 를 HP G1000 A automated protein sequence를 측정한 결과는 Fig.
- 알 수 있었다. 즉, 100℃에서의 열처리와 121℃에서 15 min 열처리에 의해서도두균주의 생육저해환의 크기가 대조 구와 비 슷한 것 으로 보아 gluten의 Aspergillus saitoi pro tease 가수분해물은 열에 매우 안정하였다.
후속연구
- 본 실험의 결과는 값이 저렴한 식물성 단백질과 미생물 기원의 protease를 이용하여 항균성 peptide를 생산하는데 기초 연구자료로서 활용될 것이며, 단백질 가수분해물의 항균성에 대한 지금까지 타 연구자들의 연구 시도된 바 없어 결과의 비교가 어려웠다.
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