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문제 정의
- 그러나 현재까지 국내에서 개발된 생물 배양기는 영양분이나 가스공급에 문제가 있으며, 그 비용도 고가여서 현실화하는 데 문제가 있다.5) 따라서 본 연구에서는 대량배양에 문제점으로 지적되고 있는 자동적인 양분공급, 산소공급, 수확 등의 난제을 덜기 위해 반영구적 특징을 갖는 모 상근에서 비교적 산소공급이나 모 상근 근모(hair of hary root)에 균등한 영양공급이 가능한 모 상근 캘러스(GHC)를 유도하고 그 캘러스 세포로부터 부정근을 유발 배양하였다. 그 밖에 현탁배양의 최적 조건을 규명 히.
- 모 상근 배양은 호르몬 없는 배지에서도 무한 세포 배양이 가 능하여 8, 9) 이차대사산물인 ginsenoside를 얻기 위한 반영구적 재료로 사용되고 있으나, 모 상근 배양 시 영양 생장을 증가시키기 위해서는 배양 도중에 조직을 절단해야 하는 등의 문제점을 가지고 있으며, 대량배양 시 조직이 서로 얽혀 root ball을 형성하고 양분공급과 통기가 불량하여 생장이 지연된다. 따라서 비교적 양분공급이 용이한 캘러스를 모 상근으로부터 유도하고자 하였다. 일반적으로 캘러스는 auxin과 cytokinin 조성에 따라 유도되며, 모 상근 세포에는 전술한 두 호르몬의 유전자가 삽입되어 있다.
- 그 밖에 현탁배양의 최적 조건을 규명 히. 여 모상 근 캘러스(callus of hairy root)의 생장과 ginsenoside 함량이 우수한 세포주(cell line)을 선발함으로서 대량 바양을 위한 제반 조건을 규명하고자 본 연구를 수행하였다.
가설 설정
- Influences of inoculum size, hormone contents on the growth of ginseng hairy root callus(GHC-T78). A: The initial inoculum was 50 mg. B: The initial inoculum was 150 mg.
- A: The initial inoculum was 50 mg. B: The initial inoculum was 150 mg. The data represent the mean ±SE of triplicates measured after 4 weeks culture.
제안 방법
- Agrobacterium rhizognes A4 Ti-plasmid를 인삼 뿌리에도 입하여 유전적으로 안정하며 반영구적으로 이용할 수 있는 형 질전혼된 인삼 모 상근 캘러스(GHC-T78)를 유도하였다. 특정 ginsenoside* 대량으로 생산할 수 있는 최적배양조건을 확립하기 위해서 먼저 모 상근으로부터 캘러스의 유도하는 과정에서 BA의 단독 처리 구는 auxir과 cytokinin의 혼합 처리구보다 캘더스 형성이 더 우수하였다.
- MS 배지는 무기질 소원으로서 NH4NO3와 Ke%을 다량으로 첨가하며, 특히 암모니아 농도가 높은 것이 특징이다. MSM은 1/2 MS 배지에서 KWQj와 K#의 농도를 변형 시켜 본 연구실에서 고안하였으며 NH4NO3 농도와 KNO3농도가 모두 높으며 인산염의 농도 또한 높은 것이 특징이다. 따라서 MSM 배지에서 GHC의 생장이 높았다는 것은 NH4NO3와 K3C)3의 농도에 영향을 받으며 특히 높은 NO「(nitrate)의 농도에서 생장이 촉진됨을 알 수 있다.
- Ginsenoside는 수포화 n-butanol 추출법에 의해 추출하였다. 냉동 건조시킨 분말시료 50mg을 취하여 50~60℃ 수욕 조에서 80% MeOH 500 B로 3회 추출하여 강압 농축 시킨 후, 증류수로 용해시켜 ethyl ether를 가하여 지질 등을 제거한 다음, 수층을 수포화 n-butanol로 3회 추출하여 n-butanol층을 모두 합하여 다시 증류수로 3회 세척한 후 수층은 버리고 n-butanol층만 건조시킨 후 HPLC용 MeOH 60 B에 녹여 12000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액 20p/를 Pharmacia's LKB HPLC PUMP 2248기에 주입하여 gin- senoside로 분리 정량하였다. 이때 사용한 용매는 E, Merck 회사의 HPLC용을 사용하였으며 ginsenoside 표준품은 한국 인삼 연초 연구원에서 분리한 표준품을 사용하였다.
- 인삼 모 상근(GHR-T78)으로부터 3 mg/L BA를 처리하여 유도한 인삼 모 상근 캘러스(Ginseng hairy rott callus; GHC-T78)는 250 mL 삼각플라스크에 BA가 3.0mg/L로 첨가된 1/2 MS 액체배지를 150mL을 넣어 암 조건과 광조건 (1.9|imol . m-2 . s-1)에서 23℃, lOOrpm으로 현탁배양한 후 수확하여 각각의 성장률을 40℃ dry oven에서 24시간 건조 시킨 dry weight으로 측정하여 산출하였다.
- 8%)을 이용하였다. 호르몬은 auMn류인 2, 4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid), IAA(indole-3-acetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), NAA(l-naphthaleneace- tic acid)와 cytokinin류인 kinetin, BA(benzyladenine)를 0.5, 1, 3, 6 mg] 농도로 단독처리 또는 혼합 처리하여 23℃ 로 암상태에서 16주 동안 배양, 각각 캘러스 유도를 촉진하였다.
대상 데이터
- 00mg으로 측정되었다. 1/2 MS 배지와 비교해 볼 때 MSM 배지에서는 약 43.2% 정도 높은 생장률을 보여 이후의 GHC 배양은 MSM 배지를 사용하였다(Fig. 7). 액체 배지의 질소 공급원은 주로 NHJ(ammonium와 NCenitrmte)이다.
- BA(Benzyladenine) 이 첨가된 고체 배지에서 유도된 캘러스를 선발하여 BA가 3 mg/L로 첨가된 1/2 MS 액체배지로 옮겨 암상태에서 현탁 배양하였다(Fig. 4). 액체배양에서는 캘러스가 고체 배지에서보다 더욱 잘 성장함을 볼 수 있었는 데 이는 고체 배지에서는 캘러스 덩어리가 제한된 부분에서만 배지와 접촉함으로서 배지로부터 양분흡수가 적은데 반해 액체배지에서는 캘러스가 덩어리가 조각으로 부서지기도 하면서 표면적이 더 커져서 배지로부터 양분의 흡수와 산소공급이 더 원활히 일어나기 때문이다.
- 본 실험에 사용된 식물재료는 인삼(Rzsx ginseng C.A Meyer) 뿌리에 Agrobacterium rhizogenes A4 균주를 접종하여 유도한 인삼 모상근(Ginseng hairy root A4, GHR-T78)을 사용히였다.© 유도된 모 상근은 100 mL 삼각플라스크에 50 mL 의 1/2 Murashige and skoog(MS)7) 액체 배지를 넣어 23℃, 암 조건에서 진탕 배양(lOOrpm) 하였다.
- © 유도된 모 상근은 100 mL 삼각플라스크에 50 mL 의 1/2 Murashige and skoog(MS)7) 액체 배지를 넣어 23℃, 암 조건에서 진탕 배양(lOOrpm) 하였다. 실험에서 사용된 모 상근은 계대배양 후 4주가 경과한 후 새로 나온 모 상근 의 선단 부위를 L 5cm로로 균일하게 잘라 사용하였다(Fig. 1).
- 냉동 건조시킨 분말시료 50mg을 취하여 50~60℃ 수욕 조에서 80% MeOH 500 B로 3회 추출하여 강압 농축 시킨 후, 증류수로 용해시켜 ethyl ether를 가하여 지질 등을 제거한 다음, 수층을 수포화 n-butanol로 3회 추출하여 n-butanol층을 모두 합하여 다시 증류수로 3회 세척한 후 수층은 버리고 n-butanol층만 건조시킨 후 HPLC용 MeOH 60 B에 녹여 12000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액 20p/를 Pharmacia's LKB HPLC PUMP 2248기에 주입하여 gin- senoside로 분리 정량하였다. 이때 사용한 용매는 E, Merck 회사의 HPLC용을 사용하였으며 ginsenoside 표준품은 한국 인삼 연초 연구원에서 분리한 표준품을 사용하였다. 분석조건은 다음과 같다.
- 인삼 모 상근의 호르몬에 대한 효과를 조사하기 위하여 V2 MS 고체 배지 (agar 0.8%)을 이용하였다. 호르몬은 auMn류인 2, 4-D(2, 4-dichlorophenoxyacetic acid), IAA(indole-3-acetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), NAA(l-naphthaleneace- tic acid)와 cytokinin류인 kinetin, BA(benzyladenine)를 0.
이론/모형
- Ginsenoside는 수포화 n-butanol 추출법에 의해 추출하였다. 냉동 건조시킨 분말시료 50mg을 취하여 50~60℃ 수욕 조에서 80% MeOH 500 B로 3회 추출하여 강압 농축 시킨 후, 증류수로 용해시켜 ethyl ether를 가하여 지질 등을 제거한 다음, 수층을 수포화 n-butanol로 3회 추출하여 n-butanol층을 모두 합하여 다시 증류수로 3회 세척한 후 수층은 버리고 n-butanol층만 건조시킨 후 HPLC용 MeOH 60 B에 녹여 12000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상등액 20p/를 Pharmacia's LKB HPLC PUMP 2248기에 주입하여 gin- senoside로 분리 정량하였다.
성능/효과
- GHC의 생장에 미치는 광의 효과를 조사하였던바, 광 처리 구(1.9 mol . rr「2 . s"1)에서 엽록소와 안토시안이 형성됨을 육 안으로 관찰할 수 있었다. 캘러스의 생장이 암상태보다 광상태에서 훨씬 더 높게 나타난 반면(Fig.
- 이는 결과적으로 인삼 모 상근으로부터 모 상근 캘러스를 유도하기 위해서는 BA의 단독처리가 매우 효과적임을 확인하였다.。'러한 결과는 6년근 인삼 뿌리의 캘러스 유도 시에 2, 4'D7 - 가장 효과적이며, BA와 2iP, Kinetin과 같은 cytoki- nine 캘러스의 분열증식을 강하게 억제한다는 보고와는 상 반 되는 결과로 모 상근에서의 캘러스 유도는 인삼 정상근에서 의 캘러스 유도 시 나타나는 현상과는 전혀 다른 호르몬 요구도를 보임을 알 수 있었다. 모 상근 절편이 캘러스를 형성하도록 하기 위하여 외부로부터 생장조절제를 공급하고 있는데, 이때 생장조절제의 효과는 내생 호르몬의 함량에 따라 크게 좌우됨을 알 수 있었다.
- 또한 근래 소비자의 기호 추세에 부합하는 여러 가지 타입의 인삼 단일제제 및 생약 복합제제가 개발되어, 건강식품 또는 의약품으로 등록되고 있으며, 점차 그 범위가 확대되고 있다.1) 그러나 자생 인삼은 재배가 까다롭고 연작이 쉽지 않으며 병충해 발생 등으로 인하여 원료 삼 의 수요를 충족시키지 못하고 있는 실정이다. 따라서 이러한 문제점을 해결하여 다량의 ginsenoside를 생산하고자 기내 배 양에 대한 연구가 진행되고 있다.
- 호르몬의 혼합처리는 단독 처리에 비해 인삼 모 상근의 캘러스 유도에 좋지 않았다. 2, 4- D와 BA 또는 Kinetin 복합처리구에서는 캘러스 형성이 억제되었으며 IAA와 Kinetin 조합에서는 캘러스 형성율. 이 다소 높았다(Table 2).
- BA(Benzyladenine)를 1, 2, 3, 4 mg/L로 서로 다르게 첨가한 1/2 MS 액체배지에 50mg(A)과 150mg(B)의 캘러스를 접종하여 4주 배양한 캘러스의 총 ginsenoside 함량은 BA 2mg/L를 첨가한 50mg(S) 처리 구에서 가장 높게 나타났다. 50mg(S) 처리 구에서는 BA 2mgJ가 3.
- GHC의 현탁배양을 위한 최적 배지를 규명하고자 SH17, 1/ 2MS, MSM 배지에서 캘러스를 4주간 배양한 결과 SH, 1/2 MS, MSM 배지 각각 GHC의 건물 중이 57.33 mg, 66.33 mg, 95.00mg으로 측정되었다. 1/2 MS 배지와 비교해 볼 때 MSM 배지에서는 약 43.
- 본 실험에서도 2, 4-D와 NAAe 인삼 모 상근 캘러스의 이 차대 사산 물인 ginsenoside의 생성을 억제하였다. cytokinin 단독 처리 구에서는 캘러스 형성에 탁월한 BA 처리 구가 auxin류의 처리 구에 비해 ginsenoside의 함량이 월등하게 증가하였다(Table 4). Kinetin 0.
- 107 mg . g dry wtf 으로 나 타났으며 BA의 처리가 옥신류 또는 Kinetin 단독처리보다 ginsenoside 생산에 가장 효과적인 생장조절제임을 확인하였다. 결론적으로 BA의 단독처리는 캘러스 생장뿐 아니라 ginsenoside 함량에 있어서도 효과적이었으며 ginsenoside 함량은 BA 0.
- g dry wtf 으로 나 타났으며 BA의 처리가 옥신류 또는 Kinetin 단독처리보다 ginsenoside 생산에 가장 효과적인 생장조절제임을 확인하였다. 결론적으로 BA의 단독처리는 캘러스 생장뿐 아니라 ginsenoside 함량에 있어서도 효과적이었으며 ginsenoside 함량은 BA 0.5 mg/L 처리 구에서 3.857mg . g dry wt"1.
- 일반적으로 캘러스는 auxin과 cytokinin 조성에 따라 유도되며, 모 상근 세포에는 전술한 두 호르몬의 유전자가 삽입되어 있다. 그 결과 auxin류의 경우 2, 4-D 처리 시 에는 3mg/L 이상에서 캘러스가 유도되지 못하였고 그 성장 또한 억제되었으나 그 외 IAA, IBA 그리고 NAA 처리시에 는 모든 처리 구에서 각각 6 ppm 이상의 농도에서도 캘러스가 유도되었다. Cytokinin류의 경우, kinetine 0.
- 3%으로 BA 첨가 하 지 않는 캘러스보다 높은 함량을 나타내었다. 그러나 150mg(L) 처리 구의 경우 BA 2와 4mg/L 처리 구만이 각각 11.6%와 3.69%으로 약간의 함량증가를 보였으며 BA 1 와 2 mg/L의 처리 구는 5.24%와 8.6%의 함량감소를 나타내어 inoculum size가 현탁배양에 있어 캘러스 생장뿐만 아니라 ginsenoside 함량에도 큰 영향을 미치고 있음을 확인하였다.
- 접종량(Inoculum size)은 식물 배양에 중요한 요인은으로 대사산물의 생산⑸과 모 상근의 생장에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 따라서 모 상근 캘러스의 생장에 미치는 접종량의 영향을 알아본 결과, BA를 1, 2, 3, 4mg/I로 농도를 달리하여 접종량을 50 mg과 150 mg씩 각각 접종하여 4주 배양하였던 바, 접종량과는 상관없이 두 처리 구 공히 BA를 2 mg/L로 첨가한 배지에서 가장 높은 생장을 나타내었다. BA가 2 mg/L 첨가된 배지에 50mg의 캘러스를 접증한 4주 후 건조중량(DW)은 9.
- 78%의 생장감소를 나타내었다. 따라서 인삼 모 상근 캘러스의 현탁배양에는 BA를 2mS로 비지에 첨가하는 것이 생장에 있어 최적 호르몬임을 확인하였다.
- 9%가량 ginsenoside 함량이 더 높게 나타나 inoculum size가 적은 것이 ginsenoside 생성에 더 효율적임을 나타내었다(Table 3). 또한 50mg(s) 처리 구의 경우 BA를 1, 2 그리고 3 mg/l첨가하여 배양한 캘러스는 각각 43.9%, 52.3% 그리고 20.3%으로 BA 첨가 하 지 않는 캘러스보다 높은 함량을 나타내었다. 그러나 150mg(L) 처리 구의 경우 BA 2와 4mg/L 처리 구만이 각각 11.
- 。'러한 결과는 6년근 인삼 뿌리의 캘러스 유도 시에 2, 4'D7 - 가장 효과적이며, BA와 2iP, Kinetin과 같은 cytoki- nine 캘러스의 분열증식을 강하게 억제한다는 보고와는 상 반 되는 결과로 모 상근에서의 캘러스 유도는 인삼 정상근에서 의 캘러스 유도 시 나타나는 현상과는 전혀 다른 호르몬 요구도를 보임을 알 수 있었다. 모 상근 절편이 캘러스를 형성하도록 하기 위하여 외부로부터 생장조절제를 공급하고 있는데, 이때 생장조절제의 효과는 내생 호르몬의 함량에 따라 크게 좌우됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 모 상근에 삽입된 T- DNA의 auxin 생합성 유전자가 cytokinin 유전자보다 더 강하게 발현되고 있다고 생각되며, 캘러스 형성에 필수적인 BA만 첨가함으로써 호르몬의 균형을 이루어 캘러스 형성에 효 과적이었다고 생각된다.
- g dry wt-1. 보다 낮음을 보여 2, 4-D와 NAA의 단득처리가 ginsenoside 합성을 억제하고 있음을 나타내었다.
- 유사한 실험에서 Furuya 등은 2, 4-D의 농도를 증가시키면, 사포닌 합성이 억제되는 것을 확인하였으며, 그밖에 2, 4-D와 NAAe nicotin12), polyphenol131, anthocyanin의 합성을 억제한다고 보고하였다. 본 실험에서도 2, 4-D와 NAAe 인삼 모 상근 캘러스의 이 차대 사산 물인 ginsenoside의 생성을 억제하였다. cytokinin 단독 처리 구에서는 캘러스 형성에 탁월한 BA 처리 구가 auxin류의 처리 구에 비해 ginsenoside의 함량이 월등하게 증가하였다(Table 4).
- 실저로 인삼 모 상근 캘러스의 생장율은 암상태에서 배양하는 것이 광상 태에서 보다 다소 양호하였으나, ginsenoside의 생성 어는 연속광상 태에서 더 효과적임이 확인되었다. 모 상근 캘러스에서 얻은 이러한 결과는 국내외 처음으로 보고되는 내용이다, 액체배양의 캘러스 세포에서 분화된 무수히 많은 단 일 모 상근 근모의 형성은 액체배양을 통한 특정 ginsenosid 의 새로운 생산방법을 개발할 수 있도록 하고 있다.
- 410 mg - g dry wt-1. 으로 나타났으며 Kinetin 단독처리구 중 생장이 가장 우*하였던 0.5mg/L 처리 구에서 ginsenoside의 함량 또한 가장 높게 나타났다(Fig. 2).
- 053mg dry wt. 으로 호르몬 무첨 가 배지 보다 4.79%의 생장증가를 나타내었으며 BA 3.4 mgL 첨가한 배지 내 캘러스의 건조중량은 19.4± 1.422 mg, 18.8+1.075 mg 으로 각각 3.80%, 6.78%의 생장감소를 나타내었다. 따라서 인삼 모 상근 캘러스의 현탁배양에는 BA를 2mS로 비지에 첨가하는 것이 생장에 있어 최적 호르몬임을 확인하였다.
- 으두- 2084 mg/g dry wt. 의 함량을 나타내는 150 mg을 접 종한 BA 2mg/L 처리 구보다 72.9%가량 ginsenoside 함량이 더 높게 나타나 inoculum size가 적은 것이 ginsenoside 생성에 더 효율적임을 나타내었다(Table 3). 또한 50mg(s) 처리 구의 경우 BA를 1, 2 그리고 3 mg/l첨가하여 배양한 캘러스는 각각 43.
- 이는 결과적으로 인삼 모 상근으로부터 모 상근 캘러스를 유도하기 위해서는 BA의 단독처리가 매우 효과적임을 확인하였다.。'러한 결과는 6년근 인삼 뿌리의 캘러스 유도 시에 2, 4'D7 - 가장 효과적이며, BA와 2iP, Kinetin과 같은 cytoki- nine 캘러스의 분열증식을 강하게 억제한다는 보고와는 상 반 되는 결과로 모 상근에서의 캘러스 유도는 인삼 정상근에서 의 캘러스 유도 시 나타나는 현상과는 전혀 다른 호르몬 요구도를 보임을 알 수 있었다.
- 0819mg이었다. 이러한 결과는 모 상근 캘러스의 액체 배양 과정에서는 접종량이 작은 것이 GHC의 대량생산에 효율적임을 제시하여 준다(Fig. 5, 6).
- 모 상근 절편이 캘러스를 형성하도록 하기 위하여 외부로부터 생장조절제를 공급하고 있는데, 이때 생장조절제의 효과는 내생 호르몬의 함량에 따라 크게 좌우됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 모 상근에 삽입된 T- DNA의 auxin 생합성 유전자가 cytokinin 유전자보다 더 강하게 발현되고 있다고 생각되며, 캘러스 형성에 필수적인 BA만 첨가함으로써 호르몬의 균형을 이루어 캘러스 형성에 효 과적이었다고 생각된다.
- g dry wt-1. 이하로 비교적 낮았으며 단독처리 시의 2, 4-D와 NAA의 ginsenoside 함량의 억제 효과가 조합처리에도 영향을 주고 있음을 보여주고 있다(Fig. 3).
- 5, 1 mg/L 첨가한 배지에서 BA는 1, 3mg/L로 첨가한 배지에서 캘러스 유도율이 가장 좋았다(Table 1). 인삼 모 상근에서 캍러스 유도에는 auxin류의 호르몬보다 Cytokinin류 (kinetin, BA)가 훨씬 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 호르몬의 혼합처리는 단독 처리에 비해 인삼 모 상근의 캘러스 유도에 좋지 않았다.
- 인삼 캘러스 형성율은 Benzyladenine(BA)를 lmg-3mg/L까지 첨가한 배지에서 가장 높게 나타났으며, ginsenoside 함량 역시 bezyladenine 단독처리구는 가장 우수하였다. 캘러스 세포의 액체배양 기간을 4주로 설정할 때 BA의 농도 역시 BA 2 mg/L로 첨가한 배지에서 가장 우수한 캘러스 생장률을 보였다.
- 인삼 캘러스 형성율은 Benzyladenine(BA)를 lmg-3mg/L까지 첨가한 배지에서 가장 높게 나타났으며, ginsenoside 함량 역시 bezyladenine 단독처리구는 가장 우수하였다. 캘러스 세포의 액체배양 기간을 4주로 설정할 때 BA의 농도 역시 BA 2 mg/L로 첨가한 배지에서 가장 우수한 캘러스 생장률을 보였다.
- Ti-plasmid를 인삼 뿌리에도 입하여 유전적으로 안정하며 반영구적으로 이용할 수 있는 형 질전혼된 인삼 모 상근 캘러스(GHC-T78)를 유도하였다. 특정 ginsenoside* 대량으로 생산할 수 있는 최적배양조건을 확립하기 위해서 먼저 모 상근으로부터 캘러스의 유도하는 과정에서 BA의 단독 처리 구는 auxir과 cytokinin의 혼합 처리구보다 캘더스 형성이 더 우수하였다.
- 호르몬 조합처리가 ginsenoside의 함량에 미치는 효과를 조사해 보았던바, BA와 NAA 조합 처리 구와 BA와 IAA 조합 처리 구 그리고 Kinetin과 IAA의 조합처리 구에서 ginsenoside 생성에 효과적임을 볼 수 있었다.
후속연구
- 그중 A. rhizogenes의 Ri-plasmid에 의해 형질 전환되어 유도되는 모 상근(hairy root)은 이 차대 사산 물의 함량과 성장이 모본 식물체보다 높다고 알려져 인삼 모 상근이 ginsenoside의 획득에 좋은 재료로 활용될 수 있을 것으로 기대되고 있다.2) 또한 그동안의 실험실 수준에서의 기초적인 연구에서 벗어나 응용 및 산업화를 위해서 대량배양이 필수적으로 요구되고 있다.
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