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문제 정의
- 이와 같이 차가버섯에 대해서는 오래전부터 여러 가지 생리 활성 연구가 이 루어져 왔다. 따라서 본 연구에서는 이와 같이 여러 가지 기능성 성분을 함유하고 있는 차가버섯에 대하여 좀더 구체적인 항암활성을 구명 하여 새로운 암예방 및 항암소재로서의 개발을 목적으로 항돌연변이활성 및 세포독성 효과를 실험하였으며 그 결과를 밝힌다.
- 활성성분대무분 버섯 자실체나 액체 배양균사체로부터 추출된 다당 류들로서 대표적으로 표고버섯 자실체에서 분리한 순수 다 당게 lentinan이 sarcomaT80에 대하여 강한 항암작용을 나 타낸다고 보고되었다(17). 본 실험 결과에서는 차가버섯 추 출룰 다당류에서 부동한 암 세포에 대하여 비교적 높은 암세 포 성장 억제 효과를 나타내어 기능성 식품소재로서의 가능성을 제시하였다.
- 본 실험에서는 암세포로 인간 폐암세포 A549, 인간 유방암세포 MCF-7과 인간 위암세포 AGS를 이용하여 이들 암세포주에 대하여 SRB assay를 이용한 차가버 섯 분획 물의 저 해효과를 검토하였다. 그 결과 Fig.
제안 방법
- 배양하면서 실험에 사용하였다. A549, MCF-7, AGS 세 포주는 RPMI Medium 1640 복합배 지 를, 그리고 293 세포주는 MEM(minimum essential medium)을 이용하여 1C% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2에 적 응시켜 각각 배양시켰다. 실험에 사용한 Salmonella typhimurium LT-2의 histidine 영양요구성 변이주(auxotroph)는 TA98 TA100의 두 종류였으며, 미국 Califonia 대학의 B.
- 그■리 고 microsomal enzyme의 대 사활성 에 의해 서 만 돌연변 >1 원성을 나타내는 간접변이원으로서 실제로 식품을 통해 흡수될 수 있는 B(a)P과 아미노산 가열분해물인 Trp-PT을 사牛하여 실험을 수행하였다. Trp-P-l(0.
- 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 ml/4] 가하여 잘 혼합후에 미리 조제 해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평 판고화시 켜 37℃ 배양기 에서 48시간 배양하여 생성 된 복귀돌연변이수를 측정하여 추출물의 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 그리고 항돌연변이원성 실험은 건열멸균시 킨 glass cap tube에 추출물 및 분획 물들을 각각의 농도별로 50 UL씩 첨 가하고 변이 원 물질을 각각 50 HL씩 첨가한 다음 대 사활성 물질이 필요한 경우에는 S-9 mix를 250 UL를 각각 첨가하였다. 여기에 전배양시킨 S.
- 열수추출 후 잔사를 10% ZnCb로 100℃에서 8시간 3회 추출한 후 5% NaOH 용액 으로 24시 간, 2회 추출하였다. 여 기 서 얻은 상등액을 99% 초산용액을 가하여 pH 5로 산성화하고 세척하여 불용성 조다당 분획 I, II를 얻었다.
- 2 M sodium phosphate buffer를 가하여 최종부피가 700 虬가 되도록 하였다. 이것을 37℃어' 서 20분간 진탕배양한 다음 상기의 돌연변이원성 실험과 i 은 방법으로 실험하여 생성된 복귀돌연변이 colony수를 측정하여 항돌연변이원성 유무를 판정하였다. 각 시료와 변。' 원 물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며 항돌연변이 활성은 변이원물질의 활성에 대한 시료의 억제율(inhibition, %)로 나타내었다.
- 4)로 전체 량이 700 UL가 되 도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 ml/4] 가하여 잘 혼합후에 미리 조제 해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평 판고화시 켜 37℃ 배양기 에서 48시간 배양하여 생성 된 복귀돌연변이수를 측정하여 추출물의 돌연변이원성의 유무를 판정하였다. 그리고 항돌연변이원성 실험은 건열멸균시 킨 glass cap tube에 추출물 및 분획 물들을 각각의 농도별로 50 UL씩 첨 가하고 변이 원 물질을 각각 50 HL씩 첨가한 다음 대 사활성 물질이 필요한 경우에는 S-9 mix를 250 UL를 각각 첨가하였다.
- SRB assay의해 측정하였다(13). 즉, 10% fetal bovine serum 및 각각의 암세포(A549, MCF-7, AGS, 293)를 함유하는 RPMI 1640 배지를 5Xlb cells/mL 농도로 100 HL씩각 well에 첨가하여 24시간 동안 배 양(37℃, 5% CO2) 시 킨 후 0.2 M 이 하의 DMSO로 녹인 시료를 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 mg/ mL 농도로 100 RL씩 첨가하여 48시간 동안 다시 배 양하였다. 그 후 상등액을 aspirator로 조심스럽 게 제거하고 냉장보관한 10%(w/v) TCA를 100 UL씩 첨가한 후 1시간 동안 4℃ 에서 방치한 후 증류수로 다섯번 정도 헹구었다.
- 차가버섯 분획물의 돌연변이원성 억제작용을 검토하기 위하여 Ames test에서 양성반응을 나타내며, 직접 변이원물질로 알려진 MNNG와 4NQO 그리고 대사활성을 필요로 하는 간접변이원물질인 B(a)P과 Trp-P-1 을 사용하여 각각의 농도에 따른 돌연변이원성 억제효과를 검토하였다.
- 차가버섯의 각 분획물에 대한 돌연변이원성 실험은 %/- monella typhimurium의 변이주인 TA98과 TA100을 이용하여 Ames test를 개량한 preincubation법(12)으로 실시하였으며, 대사 활성물질로서 S-9 mix를 첨가하였다. 차가버섯의 분획물들을 미리 건열 멸균시 킨 glass cap tube에 각각의 농도별로 50 (1L씩 을 가하고 여 기 에 전배 양시 킨 S.
- 차가버섯의 분획물들을 미리 건열 멸균시 킨 glass cap tube에 각각의 농도별로 50 (1L씩 을 가하고 여 기 에 전배 양시 킨 S. typhimurium 배양균액을 100 UL씩을 가한 다음 0.2 M sodium phosphate buffer(pH 7.4)로 전체 량이 700 UL가 되 도록 하였다. 이것을 37℃에서 20분간 진탕배양한 다음 histidine/ biotin이 첨가된 top agar(45℃)를 2 ml/4] 가하여 잘 혼합후에 미리 조제 해 놓은 minimal glucose agar plate상에 도말하고 평 판고화시 켜 37℃ 배양기 에서 48시간 배양하여 생성 된 복귀돌연변이수를 측정하여 추출물의 돌연변이원성의 유무를 판정하였다.
- 얻어진 잔사를 95℃, 8시간씩 3회 추출한 후, 상등액의 4배의 ethan이을 첨가하여 수용성 조다당을 침전시켰다. 침 전물을 30%의 (NH4)2SO4 용액으로 투석 하여 분자량 10.00C 이상의 수용성 조다당 분획을 얻었으며, 침전여액은 에틸 아세테이트 용액으로 분획하여 에틸 아세테이트 분획물과 물분획물을 얻었다.
대상 데이터
- (DPPH), D-biotin, 。-NADP, glucose-6-phosphate(G-6- P) gentamycin sulfate, sulforhodamine B(SRB)는 미국 Si/ma사의 것을, benzo( a )pyrene (B( a )P)과 3-amino- 1/ -dimethyl- 5H -pyrido-(4, 3_b)indol (Trp P- 1), L-histi- dinee 일본 和光純藥 특급시약을 사용하였다. Nutrient bmth는 Difco laboratory(USA)사의 것을 사용하였다.
- RPMI 16 40과 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), min - irrum essential medium (MEM) 및 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), Tripsin-EDTA는 Gibco사(USA) 제품을 사용하였다. Giemsa stain solution (Gurr 66)는 British drug hcuse(BDH)사의 제품을 사용하였으며 그외 일반시약은 특급시약을 사용하였다.
- Nutrient bmth는 Difco laboratory(USA)사의 것을 사용하였다. RPMI 16 40과 Dulbecco's modified eagle medium (DMEM), min - irrum essential medium (MEM) 및 Hepes buffer, fetal bovine serum(FBS), Tripsin-EDTA는 Gibco사(USA) 제품을 사용하였다. Giemsa stain solution (Gurr 66)는 British drug hcuse(BDH)사의 제품을 사용하였으며 그외 일반시약은 특급시약을 사용하였다.
- ), Colony counter(Protos plus, Synoptics Co.), CO? incubator(KMC -8409C, Vision Co.), Freeze dryer(VD- 16, T aitec Co.), Optical density (ANA 1, Tokyo photoelec trie Co.) 그리고 Centrifuge(HmT50 IV, Hanil Industrial C<>.)를 사용하였다.
- 본 실험에 이용된 암세포주는 인간 폐암세포 A549(lung carcinoma, human), 인간 유방암세포 MCF-7(breast ade- nc carcinoma, pleural effusion, human), 인간 위 암세포 AGS (s:omach adenocarcinoma, human)가 이용되었고, 정상세포로는 293(transformed primary human embryonal kid- ney)을 Korea Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하여 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. A549, MCF-7, AGS 세 포주는 RPMI Medium 1640 복합배 지 를, 그리고 293 세포주는 MEM(minimum essential medium)을 이용하여 1C% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2에 적 응시켜 각각 배양시켰다.
- A549, MCF-7, AGS 세 포주는 RPMI Medium 1640 복합배 지 를, 그리고 293 세포주는 MEM(minimum essential medium)을 이용하여 1C% fetal bovine serum을 첨가하여 37℃, 5% CO2에 적 응시켜 각각 배양시켰다. 실험에 사용한 Salmonella typhimurium LT-2의 histidine 영양요구성 변이주(auxotroph)는 TA98 TA100의 두 종류였으며, 미국 Califonia 대학의 B.N. Ames 로부터 제공 받았다.
- 실험에 사용한 차가버섯은 러시아에서 수입한 것으로, 건조, 분말화한 후 -20℃ 냉동실에 보관하면서 실험에 사용하였다. 차가버 섯을 분말화한 후 Mizuno 등(11)의 방법에 따라 추출, 분획하였다.
이론/모형
- SRB assay의해 측정하였다(13). 즉, 10% fetal bovine serum 및 각각의 암세포(A549, MCF-7, AGS, 293)를 함유하는 RPMI 1640 배지를 5Xlb cells/mL 농도로 100 HL씩각 well에 첨가하여 24시간 동안 배 양(37℃, 5% CO2) 시 킨 후 0.
- 차가버 섯을 분말화한 후 Mizuno 등(11)의 방법에 따라 추출, 분획하였다. Fig.
성능/효과
- MNNG(0.4 pg/plate)의 경우 S. typhimurium TA100 균주에 서 시 료농도 501ig/plate에서 수용성 다당과 불용성 다당- II 가 각각 99.1% 및 91.0%로 높은 억 제효과가 나타났다. 그외의 분획물들은 저분자 물질, 에틸 아세테이트, 물 분획물 및 불용성 다당T이 각각 86.
- 8%의 억 제효과를 보였다. TA100 균주의 경우, 저분 자 물질, 에 틸 아세테이트, 물 분획 물, 수용성 다당, 불용성다당-:[은 시료농도 20 ug/plate에서 각각 53%, 79%, 81%, 92.4% 그리고 93.0%의 억제효과를 나타내었으며 불용성 다당』는 시료농도 50 Ug/plate에서 85.3%의 강한 억 제효과를 보였다.
- 대하여 SRB assay를 이용한 차가버 섯 분획 물의 저 해효과를 검토하였다. 그 결과 Fig. 6에서와 같이 A549 세포에 대한 분획물들의 억제효과에서는 4 mg/mL 첨가시 물 분획물과 수용성 다당과 불용성 다당口 그리고 저분자 물질이 각각 83.3%, 82.2%, 78.6%, 및 68.4%의 비교적 높은 억 제효과를 보였으며, 에 틸 아세 테 이 트 분획 물과, 불용성 다당 Ie 1 mg/ mL 첨가시 90.8%와 81.8%의 높은 억 제효과를 나타내었다. AGS 세포의 경우 Fig.
- 1%로 높은억 제효과를 나타내었다. 그 외의 저분자 물질과 에틸 아세테이트 및 물분획물이 각각 84.0%, 81.5%, 87.9%의 억제효과를 보였다(Fig. 5).
- 억 제 효과를 나타내었다. 또한 암세포 성 장 억 제 실험 에 서는 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획이나 시료들보다 시 료농도 4 mg/mL에서 A549, AGS, 그리고 MCF-7 세 포에 대 하여 각각 90.8%, 94.3%, 83.5%의 높은 암세포 성 장억 제효과를 나타내었다.
- 에 탄올 추출물을 10, 15, 20, 50 Rg/plate의 여러 농도를 첨가하여 시험한 결과, 집락수가 음성대조군에 비하여 농도변화에 따른 집 락수의 큰 변화를 나타내지 않으므로 차가버섯 분획물 자체로는 돌연변이원성을 나타내지 않은 것으로 판단되었다.
- typhimurium TA98 균주에서 는 시 료농 도 20 Ug/plate에서 저 분자 물질, 에 틸 아세 테 이 트, 물 분획물. 수용성 다당 및 불용성 다당 I 및 !! 에서 각각 55%, 46.5%, 58%, 36.3%, 43% 그리고 64.5%의 순으로 억 제효과를 나타냈 으나, TA100 균주의 경우, 시 료농도 50 Ug/plate에서 에 틸아세테이트 분획물 및 수용성 다당과 불용성 다당 I과 II에서 각 각 90.7%, 84.9%, 91.3%, 75.9%로 대부분의 시 료들이 80% 이 상의 억 제효과를 보였으며, 저분자 물질, 물 분획물이 각각 59 3% 및 9.6%의 억 제 효과를 나타내었다. 또한 B(tf )P(10 jug/plate)에 서 는 TA98 균주의 경우, 50 Ug/plate의 시 료농도에서 저분자 물질, 에틸 아세테이트, 물 분획물, 수용성 다당 및 불용성 다당 I과 n 에서 각각 63.
- 9%를 보였으며 , 저 분자 물질. 에틸 아세테이트 분획물, 불용성 다당-1은 각각 40.5% 및 72.0%, 84.8%의 억 제효과를 보였다. TA100 균주의 경우, 저분 자 물질, 에 틸 아세테이트, 물 분획 물, 수용성 다당, 불용성다당-:[은 시료농도 20 ug/plate에서 각각 53%, 79%, 81%, 92.
- 차가버섯 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 및 물 분획물 그리고 수용성 다당과 불용성 다당 I, Ⅱ에 대하여 항돌연변이원성 실험과 암세포성장억제 실험을 행한 결과, 각 시료에서 돌연변이원성은 없는 것으로 나타났으며 직접변이원인 MNNG와 4NQO, 간접변이원인 B[a]P와 Trp-P-1 모두에서 시료농도 50 Jig/plate에서 불용성 다당 II가 90% 이상의 높은 억 제 효과를 나타내었다. 또한 암세포 성 장 억 제 실험 에 서는 에틸아세테이드 분획물에서 다른 분획이나 시료들보다 시 료농도 4 mg/mL에서 A549, AGS, 그리고 MCF-7 세 포에 대 하여 각각 90.
- 2). 한편, Fig. 3은 4NQO(0.15 Ug/plate)에 대 환 항돌연변이성 을 나타낸 결과로서 TA98 균주에서 시료농도 50ug/plate에서 불용성 다당-日 이 96.2%의 높은 억 제효과를 보였으나, 수용성 다당, 물 분획물의 경우, 시료농도 20 μg/plate에서 각각 98.3%와 95.9%를 보였으며 , 저 분자 물질. 에틸 아세테이트 분획물, 불용성 다당-1은 각각 40.
후속연구
- 또한 Miyazaki 등(15)은 다당류인 글루칸을 동충하초로 부터 분리해 내어 항종양 효과를 마우스를 가지고 실험한 결과 매우 높은 효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터 추후 차가버섯에 대한 더 세부적인 연구가 필요한 것으로 사료되었다.
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