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문제 정의
- 그 밖에도 차가버섯의 여러 성분은 항 바이러스") 및 항산화 활성。등 여러 생물학적 활성이 있는 천연물질로 알려져 왔다. 본 연구는 차가버섯의 겉부위와 속부위별로 면역자극 활성 및 항종양 활성을 규명하고 활성을 비교 조사하였다.
제안 방법
- BALB/c 마우스에 1% thioglycollate를 1 1㎕ 복강주사하고 4일 후에 경추탈골법으로 마우스를 희생시킨 후, 복강에 RPMI- 1640 배지 10 ㎕를 주입하여 복강 내 세포(peritoneal exudative cells; PEC)를 수집하였다. 수획한 PEC를 24 well culture plate에 1.
- 1 carcinoma는 1×104/100 ㎕의 밀도로 96-well plate의 각 well에 plating 하였고 여러 농도로 조정된 차가버섯을 100 ㎕씩 첨가하고 2일간 배양하였다. 각 물질의 세포 독성 효과는 MTT assay법⑺으로 조사하였다.
- 한편, 차기버섯 속부위 추출물의 경우, 흥미로웠던 결과를 보여 동일한 농도 처리에서 유의한 항종양 활성은 인정되지 않았다. 따라서 차가버섯에서 항종양 활성을 나타내는 성분은 버섯의 외부에 있을 것으로 생각되어 이후 동물 실험인 치료적활성은 겉부위 추출물에 의한 실험을 실시하였다. Table 1은 차가버섯의 예방적 투여에 의한 항종양 활성 유도를 근거 로 치료적 활성을 조사한 결과이다.
- 그 후 적정농도로 조정 된 차가버 섯을 첨 가하고 24시간 동안 배 양하였다. 배양 완료 毛 macrophage의 배양 상등액을 회수하였고 배양 상등액에 유도 분비된 TNF-a의 측정은 각 cytokine 에 대한 ELISA kit(Pharmingen, San Jose, CA, USA)을 구입 하여 조사하였다.
- ) 하였다. 종양 접종 14일 후에 마우스를 희생시키고 종양의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정시킨 후, 종양의 군집 수를 측정하였다. 한편, 시료에 의한 항종양 전이 효과는 종양만 접종한 대조군과 비교함으로써 조사하였고, 시료는 종양 접종 2일 전에 1회 정맥(5, 1, 0.
- 시료의 준비를 위한 건조된 차가버섯의 겉부위(검은부위) 및 속 부위(안쪽 부분의 엷은색 부위)를 각각 준비하였다. 준비된 각 시 료는 믹서기(Hanil Co Ltd, Seoul, Korea)를 이용하여 입자 크기가 0.1 mm 이하로 분쇄 후, 중량의 10배가 되는 증류수를 넣고 4 ℃ 에서 12시간 magnetic stirring bar를 이용하여 교반 하였으며, 원심분리 (1800xg/30 min)를 통하여 상등액을 얻은 후, 0.22 ㎛의 pore size를 가지는 필터 (Whatman, Philadelphia, PA, USA)를 통과 후 동결건조(£eeze diyer, EYELA FDU-540, Tokyo, Japan)하여 조 추출물을 얻었다.
- 차가버섯 추출물의 전신 투여는 실험 전이 모델에서 유의한 항종양 전이 효과를 보였기에 동일한 실험 모델에서 차가버섯의 경구 투여에 의한 항종양 효과를 조사하였다. 최근 점막 면역계를 통한 전신면역의 활성화에 대한 관심이 고조되고 있고 천연물의 경구 투여는 점막 면역계를 통하여 선천적 전신 면역계를 활성화시켜 유의한 항종양 활성이 유도 등 전신적 생체 방어력 을 증진시 킨다는 보고가 발표되고 있다2卜 시료의 경구 투여에 의한 항종양 활성 유도기구를 혈관투여 와 같은 전신적 투여에 의한 작동기 전을 동일하게 적용할 수 없지만, 이후 식품으로 섭취 시 생체 방어력에 미치는 효과를 검토하기 위한 기초실험으로 실시하였다.
- 차가버섯의 면역 자극 효과 및 항종양 효과를 실험동물을 이용하여 조사하였다. Colon26-M3.
- 차가버섯의 면역 자극 효과를 조사하기 위하여 thioglycol- late로 유도된 macrophage를 in 讨Zm 에서 직접 자극 후 TNF- a 의 유도능을 조사하였다(Fig. 2). TNF-。는 자극에 의하여 활성화된 macrophages, T cells 혹은 내피세포에 의하여 생산되며, 백혈구의 염증 부위로 이동을 위한 접착분자의 발현, 국소부위의 염증유도, 항암 및 항 바이러스 활성 등 여러 기능을 가지고 있다34기9) g-。에 의한 종양세 포에 대한 살해기 전은 macrophage의 종양세포 살해 매 개 물질인 nitric oxides 혹은 hydrogen peroxide의 분비 를 촉진하고, TNF-仪 의 존재 하에서 살해 활성을 가지는 NK 세포의 증식에 직간접적으로 작용하는 것으로 보고되고 있다겨).
- 경구 투여에 의한 항종양 효과를 조사하였다. 최근 점막 면역계를 통한 전신면역의 활성화에 대한 관심이 고조되고 있고 천연물의 경구 투여는 점막 면역계를 통하여 선천적 전신 면역계를 활성화시켜 유의한 항종양 활성이 유도 등 전신적 생체 방어력 을 증진시 킨다는 보고가 발표되고 있다2卜 시료의 경구 투여에 의한 항종양 활성 유도기구를 혈관투여 와 같은 전신적 투여에 의한 작동기 전을 동일하게 적용할 수 없지만, 이후 식품으로 섭취 시 생체 방어력에 미치는 효과를 검토하기 위한 기초실험으로 실시하였다. 그 결과, CO- Ion26-M3.
- 종양 접종 14일 후에 마우스를 희생시키고 종양의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정시킨 후, 종양의 군집 수를 측정하였다. 한편, 시료에 의한 항종양 전이 효과는 종양만 접종한 대조군과 비교함으로써 조사하였고, 시료는 종양 접종 2일 전에 1회 정맥(5, 1, 0.2 mg) 또는 종양 접종 후 5일간 매일 경구투여(2 mg) 하였고, 군당 각각 5마리의 마우스를 이용하였다.
대상 데이터
- 시료의 항종양 효과는 colon26 세포로부터 얻은 고전 이성 세포주인 colon26-M3.1 carcinoma를 이용하는 실험동물 종양 전이 모델을 이용하였다"」§ 실험동물로 BALB/c 마우스를 사용하였으며, 종양의 접 종은 colon26-M3.1 carcinoma 세포주의 경우 마우스당 2.7X10」을 정맥주사(i.v.) 하였다. 종양 접종 14일 후에 마우스를 희생시키고 종양의 표적기관인 폐를 적출하여 Bouin's 용액에서 전이된 종양을 고정시킨 후, 종양의 군집 수를 측정하였다.
- 본 실험에서 사용한 차가버섯은 러시아산으로 (주)Natural F&P(Seoul, Korea)로부터 제 공받아 사용하였다. 시료의 준비를 위한 건조된 차가버섯의 겉부위(검은부위) 및 속 부위(안쪽 부분의 엷은색 부위)를 각각 준비하였다.
- 생후 6~8주령의 자성 BALB/c를 (주)중앙실험동물(Seoul, Korea)에서 분양 받아 건국대학교 바이오식의약연구센터 실험동물장에서 무균상태로 사육하였다. 마우스는 사육조에 각군별로 5마리씩 넣어 정수된 물과 실험 동물용 펠렛사료(Sam- yang Co Ltd, Incheon, Korea)를 자유 공급하였고, 온도 22 ℃, 습도 50%, 12시간 간격으로 자동 조명되는 상태에서 스트레스를 받지 않도록 주의하여 사육하였다.
- Korea)로부터 제 공받아 사용하였다. 시료의 준비를 위한 건조된 차가버섯의 겉부위(검은부위) 및 속 부위(안쪽 부분의 엷은색 부위)를 각각 준비하였다. 준비된 각 시 료는 믹서기(Hanil Co Ltd, Seoul, Korea)를 이용하여 입자 크기가 0.
- 종양세포의 배양을 위한 RPMI-1640과 Eagle's minimal essential medium(EMEM) 배지, fetal bovine serum(FBS), vitamin solution, non-essential amino acid, L-glutamic acid, thiogly- collate 등은 Gibco(Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다.
데이터처리
- 대조군에 대한 실험군 간의 통계적 유의성은 Microsoft Excel 프로그램의 Student's two-tailed f-test로 분석하였다.
이론/모형
- 1 cells were co-incubated with the indicated doses of crude extracts from Inonotus obliquus for 48 hrs. The proliferation of these cells was measured by a MTT-based colorimetric assay.
성능/효과
- 조사하였다. Colon26-M3.1 세포주를 이용하는 실험동물 전이 모델에서 1 mg의 차가버섯 추출물의 예방적 투여에 의한 항종양 효과를 조사한 결과, 대조군에 비하여 약 80% 이상, 치료적 활성을 조사한 결과, 약 33%의 유의한 종양 전이 억제 효과를 보였다. 차가버 섯 추출물은 in 에서 colon26-M3.
- 최근 점막 면역계를 통한 전신면역의 활성화에 대한 관심이 고조되고 있고 천연물의 경구 투여는 점막 면역계를 통하여 선천적 전신 면역계를 활성화시켜 유의한 항종양 활성이 유도 등 전신적 생체 방어력 을 증진시 킨다는 보고가 발표되고 있다2卜 시료의 경구 투여에 의한 항종양 활성 유도기구를 혈관투여 와 같은 전신적 투여에 의한 작동기 전을 동일하게 적용할 수 없지만, 이후 식품으로 섭취 시 생체 방어력에 미치는 효과를 검토하기 위한 기초실험으로 실시하였다. 그 결과, CO- Ion26-M3.1 carcinoma 세포주의 접종 후 5일간 매일 2 mg의 차가버섯 추출물을 경구 투여한 결과, 약 30.8%의 유의한 항종양 활성을 유도함으로써 차가버섯 겉부위는 전신 투여(Fig. 1 및 Table 1) 뿐 아니라 경구 투여로도 동일한 항종양 활성을 유도한다는 것을 확인하였다(Table 2). 경구 투여에 의한 면역계의 활성화는 점막 면역계를 구성하는 특수기관인 소장의 Peyer's patch를 통하는 것으로 알려져 있고, 이들을 통한 전신면역의 활성화는 앞으로 생체 방어력을 증진시키는 기능성 식품의 개발에 매우 중요한 요소로 고려되고 있다2"6).
- 012)%의 유의성 있는 종양 전이 억제 활성을 보였다. 따라서 마우스를 이용한 실험 전이 모델에서 0.2 ~5 mg의 차가버섯 겉부위 추출물의 투여는 유의한 항종양 활성이 있는 결과를 보였으며, 항종양 활성을 유도하는 최적의 농도는 1회의 혈관 투여의 경우 1 mg 임을 암시하였다. 한편, 차기버섯 속부위 추출물의 경우, 흥미로웠던 결과를 보여 동일한 농도 처리에서 유의한 항종양 활성은 인정되지 않았다.
- 1의 종양 전이 억제 활성의 결과와 일치하게 겉 부위의 경우가 속부위에 비하여 높은 활성을 보였다. 따라서 차가버섯 겉부위 추출물이 속부위 추출물에 비하여 대식세포와 같은 선천적 면역 계(innate immune system)를 일부 활성화시키는 능력이 우수함을 확인하였다. 따라서 차가버섯 겉부위 추출물에 의한 macrophage의 활성화는 Fig.
- 한편, 종양접종 후 5일간 메일 2 mg 의 차가버섯 경구투여도 유의한 항종양 효과를 유도하였다. 따라서 차가버섯 추출물은 전신 및 경구 투여에 의하여 선천적 면역자극계를 자극함으로 유의한 항종양 활성을 유도하는 것으로 사료되었다.
- 본 연구 결과로부터 차가버섯 추출물의 투여는 실험동물에서 전이 암에 대하여 유의한 항암 활성을 유도한다는 것을 통하여 입증하였고, 그 작용기전으로 macrophage의 활성화에기인되는 것으로 조사되었다. 동시에 차가버섯 겉부위 추출물의 경구투여가 유의한 항종양 활성을 나타낸 결과는 이 시료가 식품으로의 섭취로 인하여 점막 면역계를 자극한다는 기초 근거가 되므로서 앞으로 차가버섯의 점막 면역계에 미치는 자세한 작동 기전의 확립에 대한 연구가 요구되었다.
- 또한, TNF-a 는 종양세포에 대한 T 세포를 활성화 시키는 주요한 기구로 알려져 있다" 실험 결과, 차가버섯 속부위 혹은 겉부위 추출물 모두 1~0.1 ㎍/㎖。의 농도로 macrophage를 자극한 결과, TNF-a의 생산을 시료로 자극하지 않은 대조군에 비하여 유의하게 높게 생산하였으나, Fig. 1의 종양 전이 억제 활성의 결과와 일치하게 겉 부위의 경우가 속부위에 비하여 높은 활성을 보였다. 따라서 차가버섯 겉부위 추출물이 속부위 추출물에 비하여 대식세포와 같은 선천적 면역 계(innate immune system)를 일부 활성화시키는 능력이 우수함을 확인하였다.
- 1 세포주를 이용하는 실험동물 전이 모델에서 1 mg의 차가버섯 추출물의 예방적 투여에 의한 항종양 효과를 조사한 결과, 대조군에 비하여 약 80% 이상, 치료적 활성을 조사한 결과, 약 33%의 유의한 종양 전이 억제 효과를 보였다. 차가버 섯 추출물은 in 에서 colon26-M3.1 세포주에 대하여 1,000 “以戒의 농도까지 유의한 암세포주의 증식 억제능이 없는 결과를 보였고, 마우스 복강으로부터 얻은 macrophage를 차가버섯 추출물과 동시 배양한 결과, 농도 의존적으로 TNF-a를 생산하는 cytokine in- ducer로의 활성이 있었다. 한편, 종양접종 후 5일간 메일 2 mg 의 차가버섯 경구투여도 유의한 항종양 효과를 유도하였다.
- 1과 같다. 차가버섯 겉부위 추출물의 경우, 종양 접종 2일 전에 5, 1 및 0.2 mg의 추출물을 각각 1회 정맥 투여한 결과, 1 mg의 투여는 약 80.5% 이상의 유의성(0QOOO4) 있는 종양 전이 억제 효과를 보였으며, 5 및 0.2 mg의 투여군에서도 각각 42.7(p= 0.072) 및 59.1(p=0.012)%의 유의성 있는 종양 전이 억제 활성을 보였다. 따라서 마우스를 이용한 실험 전이 모델에서 0.
- Table 1은 차가버섯의 예방적 투여에 의한 항종양 활성 유도를 근거 로 치료적 활성을 조사한 결과이다. 치료적 활성의 유도를 위하여 종양 접종 1일부터 5일까지 0.2 mg의 추출물을 총 5회 투여 한 결과, 유의한 항종양 활성(33.1%)을 유도하였다. 혈관을 통하여 전이되는 암은 숙주로부터 암의 제거에 작용하는 작동세포와 접촉하게 된다22).
- 1 세포주에 대하여 1,000 “以戒의 농도까지 유의한 암세포주의 증식 억제능이 없는 결과를 보였고, 마우스 복강으로부터 얻은 macrophage를 차가버섯 추출물과 동시 배양한 결과, 농도 의존적으로 TNF-a를 생산하는 cytokine in- ducer로의 활성이 있었다. 한편, 종양접종 후 5일간 메일 2 mg 의 차가버섯 경구투여도 유의한 항종양 효과를 유도하였다. 따라서 차가버섯 추출물은 전신 및 경구 투여에 의하여 선천적 면역자극계를 자극함으로 유의한 항종양 활성을 유도하는 것으로 사료되었다.
후속연구
- 2). 그 결과, 실험에 적용한 최고농도인 1 mg/M까지의 농도에서 종양세포에 직접적인 독성을 나타내지 않는 결과를 보임으로서 차가버섯은 종양세포를 직접 살해하는 독성 효과는 매우 낮은 결과를 보였으며, 결국 Fig. 1에 제시한 in vz'va에서 차가버섯 1 mg 의 투여에 의한 항종양 활성은 차가버섯의 암세포에 대한 직접 독성 에 기 인되는 활성은 아닌 결과를 보였으며, 따라서 시료에 의한 선천 면역계의 활성화 측면에서의 실험이 요구되었다.
- 것으로 조사되었다. 동시에 차가버섯 겉부위 추출물의 경구투여가 유의한 항종양 활성을 나타낸 결과는 이 시료가 식품으로의 섭취로 인하여 점막 면역계를 자극한다는 기초 근거가 되므로서 앞으로 차가버섯의 점막 면역계에 미치는 자세한 작동 기전의 확립에 대한 연구가 요구되었다.
- 경구 투여에 의한 면역계의 활성화는 점막 면역계를 구성하는 특수기관인 소장의 Peyer's patch를 통하는 것으로 알려져 있고, 이들을 통한 전신면역의 활성화는 앞으로 생체 방어력을 증진시키는 기능성 식품의 개발에 매우 중요한 요소로 고려되고 있다2"6). 따라서 이후 이에 대한 자세한 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
- 있다. 따라서 차가버섯 외피 추출물의 전신적 투여(systemic administration)에 의한 항종양 효과의 유도가 암세포에 직접적으로 작용하는 세포 독성에 기인되는 효과인지 혹은 선천적 면역계(innate immune system)의 활성화에 기인되는 효과에 의한 것인지 확인하는 실험이 요구되었다.
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